5_FU诱导白血病细胞凋亡的分子机制研究

祝瑾,等󰀁5-FU诱导白血病细胞凋亡的分子机制研究

󰀁实验研究󰀁

5-FU诱导白血病细胞凋亡的分子机制研究

祝瑾,󰀁贾筱琴,󰀁程宏

扬州大学医学院(生化室:祝瑾,程宏;病理室:贾筱琴),江苏扬州225001

Molecularmechenismofapoptosisofleukamiccellsinducedby5-FU

ZHUJin,JIAXiao-qin,CHENGHong

MedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou225001,P.R.China【摘要】󰀁目的:检测化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)引起的T淋巴白血病细胞凋亡,及与之相关蛋白的表达和信号通路,为探索T淋巴细胞凋亡分子机制打下基础,为相关肿瘤的治疗提供依据。方法:用5-FU(10󰀁g/mL)刺激Jurkat细胞36h以诱导细胞发生凋亡,用流式细胞术和MTS比色法检测细胞存活率,计算细胞凋亡率;用Westernblot检测p53的表达和caspase-3的变化;向Jurkat细胞中瞬时共转染野生型或突变型pCMV-p53和pEGFP-c1检测p53在5-FU诱导的T淋巴细胞凋亡中的作用。结果:5-FU能诱导Jurkat细胞凋亡并伴随p53表达增加及caspase-3的活化;野生型p53过表达可明显增加细胞对5-FU的敏感性。结论:5-FU诱导的T淋巴白血病细胞凋亡的分子机制可能涉及p53及caspase-3。

中华肿瘤防治杂志,2006,13(8):586-588

[ABSTRACT]󰀁OBJECTIVE:ToinvestigatethesignalpathwayandexpressionofrelatedproteinsinapoptosisofTlymphocyte(leukemia)inducedby5-fluorouracil(5-FU),providinganovelinsightandinformationintheapoptosissignalingpathwaysin-ducedby5-FUandanimportantimplicationfortheclinicalthera-pyofT-lymphocyteleukemia.METHODS:Jurkatcellstreatedwith5-FU(10󰀁g/mL)for36hwereusedtodetecttheviabilitywithMTSassayandtodetectcaspase-3andp53expressionwithWesternblot.Toinvestigatetheroleofp53in5-FU-inducedcelldeathofTlymphocyte,wildtypeormutantpCMV-p53wereco-transfectedtransientlywithpEGFP-c1intoJurkatcells.

RE-SULTS:5-FUinducedapoptosisofJurkatcellswithactivationofcaspase-3.Cellstransfectedwithwild-typep53exhibitedmoresensitivityto5-FUthancellstransfectedwithmutantp53.CON-CLUSION:MolecularmechanismofapoptosisofT-lymphocyteleukemiainducedby5-FUmayinvolvecaspase-3andp53.p53ex-pressionplaysanimportantroleinapoptosisinducedby5-FU.

ChinJCancerPrevTreat,2006,13(8):586-588

【关键词】󰀁白血病;蛋白质p53;细胞凋亡;氟尿嘧啶;免疫印迹法;流式细胞术

[KEYWORDS]󰀁leukemia;proteinp53;apoptosis;fluorouracil;immunoblotting;flowcytometry

【中图分类号】󰀁R73-3;R733.7󰀁󰀁󰀁【文献标识码】󰀁A󰀁󰀁󰀁【文章编号】󰀁1673-5269(2006)08-0586-03

󰀁󰀁白血病是近年来较高发疾病,在儿童人群中尤为明显,呈上升趋势。有关白血病的治疗和发病机制研究一直很受关注。使用化疗药物治疗白血病是常见方法,而相关的基础研究还有待进一步深入[1]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种较为常用的肿瘤化疗药物,文献报道,在

用5-FU处理一些肿瘤细胞时引起了细胞凋亡,而且主要是通过caspase-8引起caspase-3的活化。我们的研

【基金项目】󰀁扬州大学自然科学基金(PK0410191)

【第一作者简介】󰀁祝瑾,女,江苏扬州人,实验师,主要从事药物对细胞影响的研究工作。

Tel:86-514-7978856󰀁E-mail:zhujinyz@126.com

【通讯作者简介】󰀁程宏,男,江苏扬州人,博士,副教授,主要从事医学分子生物学相关研究工作。

Tel:86-514-2229879󰀁E-mail:chenghongyz@126.com[2]

究应用5-FU对白血病细胞系Jurkat进行各种刺激,用多种实验手段检测刺激后细胞的凋亡、形态学变化及细胞内分子变化,初步探讨5-FU诱导的白血病细胞凋亡

的分子机制,为进一步临床治疗白血病提供理论依据。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁材料

真核表达载体pCMV-p53(野生型和突变型)和pEGFP-c1质粒由美国哈佛医学院惠赠。细胞表面CD8阴性Jurkat人T淋巴白血病细胞株购自ATCC(cat.No.TIB-152)。抗Erk-1多克隆抗体、抗caspase-3多克隆抗体(p20、L-18和sc-1225)和抗p53单克隆抗体购自SantaCruz公司。辣根过氧化酶(HRP)标记的抗鼠、抗羊、抗兔二抗购自鼎国生物技术公司。5-FU由北京协和医院免疫内科朱卫国博士馈赠。ECL显影试剂盒购中华肿瘤防治杂志2006年4月第13卷第8期󰀁󰀁CHINJCANCERPREVTREAT,April2006,Vol.13󰀁No.8

󰀁587󰀁

自AmershemPharmacia公司。PVDF膜购自Milipore公司。MTS试剂盒购自Sigma公司。RPMI10培养基干粉和胎牛血清购自Hyclone公司。

1.2󰀁方法

1.2.1󰀁细胞培养󰀁白血病细胞Jurkat培养于含10%的胎牛血清RPMI10培养基(pH7󰀁2)中,培养至对数生长期用于实验。

1.2.2󰀁5-FU对细胞的影响󰀁使用不同浓度5-FU处理Jurkat细胞36h,处理后的细胞用MTS法测存活率或凋亡率,用免疫印迹法测p53和Erk-1的表达。1.2.3󰀁DNA片段梯度分析󰀁DNA片段梯度分析、流式细胞术测定细胞凋亡及免疫印迹参照文献[4]进行。1.2.4󰀁细胞瞬时转染󰀁取对数生长期Jurkat细胞,预冷电穿孔缓冲液(不含血清的细胞培养基)洗涤细胞,将细胞以1󰀁10mL的密度重悬于0󰀁的电穿孔缓冲液中,于冰上放置的电击池中加入0󰀁5mL细胞悬液。将pCMV-p53和pEGFP-c1质粒DNA(10󰀁1)20󰀁g加入冰上各电击池的细胞悬液中,混匀,冰浴5min,将电击池放入基因导入仪,室温,950mF,300V,电击2次,培养24h后检测荧光,取绿色荧光阳性细胞做相应的刺激并检测凋亡率和p53的表达。1.2.5󰀁MTS法检测细胞存活率将细胞加入96孔板,每孔100mL(2󰀁104细胞),经不同方式处理后,每孔加MTS试剂20󰀁L,继续培养1~4h,测定OD490。以空白调零,以未处理孔OD490值为对照,计算处理后细胞的存活率,绘制曲线并求IC50值。1.3󰀁统计学分析

用Excel2000及SPSS11󰀁5forWindows统计软件包进行统计学分析,所有数据均为9次重复实验结

-果的平均值(x󰀁s),数据经t检验分析,P󰀁0󰀁05为差异有统计学意义。

7

-1

图1󰀁MTS法检测Jurkat细胞对5-FU的敏感性Fig.1󰀁SensitivityofJurkatcellsto5-FUmeasured

byusingMTSmethod

2󰀁结果

2.1󰀁5-FU诱导Jurkat细胞凋亡

采用MTS法测定5-FU引起的细胞毒作用[3],发现Jurkat细胞对5-FU的细胞毒作用较为敏感(图1,Fig.1),半数致死量(IC50值,作用48h后)为20󰀁g/mL。使用生理能够承受的5-FU浓度,即10󰀁g/mL,处理细胞36h后,用PI染色,流式细胞术检测,结果细胞凋亡率可达到23%,这和用MTS检测方法得到的结果一致,表明5-FU可以诱导白血病细胞的凋亡。

2.2󰀁5-FU诱导的细胞凋亡激活caspase-3

从图2(Fig.2)清楚可见,以10󰀁g/mL5-FU处理Jurkat细胞36h后,细胞中除了仍然还有32󰀁10的caspase-3条带外,还出现了20󰀁103和10󰀁103条带,表明5-FU引起的细胞凋亡激活了caspase-3,进而水解下游的蛋白,引起凋亡效应。[4]

3

Western印迹检测caspase-3活化。1:未处理;2:10󰀁g/mL5-FU处理12h;3:10󰀁g/mL5-FU处理36h。

图2󰀁5-FU处理后引起Jurkat细胞凋亡伴随caspase-3活化

Detectionofactivationofcaspase-3inJurkatcellsbyWesternblotting.1:Untreated;2:Treatedwith5-FU(10󰀁g/mL)for12h;3:Treatedwith5-FU(10󰀁g/mL)for36h.

Fig.2󰀁Detectionofactivationofcaspase-3andapoptosis

2.3󰀁p53参与5-FU引起的Jurkat细胞凋亡调节

采用共转染的方法将pCMVp53和pEGFP共同转入Jurkat细胞,48h后,我们使用荧光显微镜检测到了

绿色荧光;接着通过WesternBlot,发现转染了野生型和突变型pCMVp53质粒的细胞中都有p53的表达,而未转的则检测不到(图3A,Fig.3A)。MTS实验发现,不同细胞对5-FU的敏感性差异有统计学意义(图3B,

󰀁588󰀁

祝瑾,等󰀁5-FU诱导白血病细胞凋亡的分子机制研究

Fig.3B),其中,转染了野生型p53的Jurkat细胞对5-FU

的敏感性显著高于转染了突变型p53的Jurkat细胞(P=0󰀁0083,n=1󰀁104细胞󰀁9组)。

活相关的酶和蛋白,引起细胞死亡。caspase-3是天冬

氨酸蛋白酶(胱天肽酶)家族中的一种,相对分子质量为32󰀁103,因此也被称作CPP32,它总是在凋亡的晚期阶段被活化,因此,检测其活化就成为检测凋亡的重要方法,而caspase-3活化的标志就是由32󰀁103的片段裂解为两个较小的片段(20󰀁103及10󰀁103);我们实验结果中有明显的caspase-3活化,出现了32󰀁10

3

3

3

的大片段裂解为20󰀁10及10󰀁10的小片段的现象,即caspase-3出现裂解和活化。

同时,我们还对p53在5-FU诱导的白血病细胞凋亡中的作用进行了研究,结果表明,野生型p53过量表达可使T淋巴细胞对5-FU的敏感性显著增加,提示p53参与了5-FU诱导的T淋巴白血病细胞凋亡的。但在5-FU诱导下p53的表达和caspase-3活化之间是否有必然联系尚有待进一步研究,但可以肯定的是它们都属于5-FU诱导T淋巴白血病细胞凋亡分子机制中的一部分。

进一步探索5-FU诱导的T淋巴白血病细胞凋亡

A:Western印迹法检测转染前后Jurkat细胞中p53的表达变化;B:MTS法测定转染了p53载体后细胞对10󰀁g/mL5-FU的敏感性;1:未转染细胞;2:转染野生型p53和pEGFP-c1细胞;3:转染突变型p53和pEGFP-c1细胞。

的分子机制及和其他多种因子的联系,将可为白血病的治疗提供新的思路和资料,更好地为临床治疗提供参考和帮助。

图3󰀁5-FU对瞬时转染pEGFP-c1和pCMV-p53的

Jurkat细胞的影响

A:Detectionofexpressionofp53inJurkatcellsbyWesternblotting;B:SensitivityofJurkatcellsto5-FU(10󰀁g/mL)measuredbyusingMTSmethod;1:NormalJurkatcells;2:Cellstransfectedwithwild-typep53andpEGFP-c1plasmids;3:Cellstransfectedwithmutantp53andpEGFP-c1plasmids.

【参考文献】

[1]󰀁ShangP,QianAR,YangTH,etal.Experimentalstudyof

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[2]󰀁程宏,刘彦信,张锦春,等.CD3e及5-氟尿嘧啶协同作用诱导T

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[3]󰀁祝瑾,李宁川,程宏.TRAIL诱导白血病细胞凋亡的分子机制研

究[J].实用临床医药杂志,2004,8(3):36-40.

[4]󰀁WuXX,KakehiY,MizutaniY,etal.Activationofcaspase-3

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[5]󰀁YukimotoK,NakataB,MugurumaK,etal.Apoptosisand

thymidylatesynthaseinductionsby5-fluorouracilingastriccanc-ercellswithorwithoutp53mutation[J].IntJOncol,2001,19(2):373-378.

[6]󰀁程宏,刘彦信,郑德先.5-氟尿嘧啶诱导细胞凋亡的分子机制

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[7]󰀁TsengYS,TzengCC,ChiuAW,etal.Ha-rasoverexpression

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[8]󰀁BackusHH,DukersDF,van-GroeningenCJ,etal.5-Flu-orouracilinducedFasupregulationassociatedwithapoptosisinlivermetastasesofcolorectalcancerpatients[J].AnnOncol,2001,12(2):209-216.

Fig.3󰀁Impactof5-FUtoJurkatcellstransfected

withdifferentplasmids

3󰀁讨论

5-FU是一种常用化疗药物,是天然存在的尿嘧啶的类似物,即有一个氟原子占据了C-5位,其作用原理被认为5-FU是胸苷酸合成酶(TS)的抑制剂,它使TS与FdUMP(一种5-FU代谢物)结合而失活,而该酶是使2󰀁-dU通过减少甲基化转变为胸苷酸重新合成途径的关键酶,由此产生了细胞毒的作用;另一种认为5-FU掺入到RNA中去,干扰了细胞的代谢,使细胞死亡,从而展示其抗癌作用。其分子机制现在认为是其参与多种细胞凋亡途径的调节,但可以分为线粒体依赖和非依赖两条途径[6]。在线粒体依赖的途径中,5-FU的调节涉及到bax基因、线粒体膜电位和caspase-9等,而在非线粒体依赖途径中涉及到Fas/FasL、NF-󰀁B和caspase-8等的变化。我们的实验结果表明,5-FU处理T淋巴白血病细胞后可引起细胞凋亡,这和Tseng等[7]的结果一致。

目前的研究已经证实,5-FU以线粒体依赖或非依赖途径诱导细胞凋亡均伴随caspase-3活化[8],进而激

[5]

收稿日期:2005-01-06󰀁修回日期:2005-05-07

(编辑:魏玲)