营养条件对大鼠胃及小肠内Ghrelin表达的影响[1]

JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat.Sci.Ed.)Vol.38No.4Apr.2010

营养条件对大鼠胃及小肠内Ghrelin表达的影响

徐󰀁立,何󰀁强,吕颜枝,赵慧英

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100)

[摘󰀁要]󰀁󰀂目的 探讨营养水平对胃肠道Ghrelin表达的影响。󰀂方法 运用免疫组织化学SP法,在高、低和标准3个不同营养条件下,对健康成年雄性SD大鼠胃肠道内Ghrelin阳性细胞的分布和数量变化进行研究。󰀂结果 Ghrelin阳性细胞在大鼠胃及小肠内均有表达,各营养组胃中Ghrelin阳性细胞数量均明显多于十二指肠、空肠和回肠,且主要分布于胃底腺的体部和底部;低营养条件下,Ghrelin阳性细胞表达量较标准营养条件下多(P<0.05),恢复到标准状态下后其表达量减少(P<0.01);高营养条件下,Ghrelin阳性细胞数量与标准组无明显差异,当其恢复到标准营养条件下时,Ghrelin阳性细胞表达量减少,但单细胞着色面积增大,颜色加深。󰀂结论 营养条件可影响胃肠道内Ghrelin的分泌,并可能通过胃肠道内Ghrelin的分泌间接调节胃肠功能。

[关键词]󰀁营养状态;Ghrelin;大鼠;胃肠道;免疫组织化学SP法[中图分类号]󰀁Q952

[文献标识码]󰀁A

[文章编号]󰀁1671󰀁9387(2010)04󰀁0059󰀁05

EffectsofnutritionalconditionsGhrelin󰀁immunopositive

cells!expressioninthegastrointestinaltractofrats

XULi,HEQiang,L󰀁Yan󰀁zhi,ZHAOHui󰀁ying

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:󰀂Objective Thestudywastoinvestigatetheeffectsofnutritionalconditionsontheexpres󰀁sionofGhrelin󰀁immunopositive(Ghrelin󰀁ip)cellsinthegastrointestinaltractofrats.󰀂Method Immuno󰀁chemistrySPmethodwasusedtostainratsgastrointestinaltissueunderdifferentnutritionalconditions.󰀂Result Ghrelin󰀁ipcellswerefoundtobelocatedinthestomach,duodenum,jejunumandileum.Ghrelin󰀁ipcellsdensitydecreasedfromstomachtointestine.ThedentistGhrelin󰀁ipcellswerefoundintherats!stom󰀁achsunderlownutrition;however,theGhrelin󰀁ipcellswerereducedwhennutritionalconditionchangedtonormallevel.Incontrast,Ghrelin󰀁ipcellsgrewwiththetimeinthecontrolgroup.󰀂Conclusion NutrientscandeterminethenumberofGhrelin󰀁ipcellstoadjustthesecretionofGhrelin.

Keywords:nutritionalcondition;Ghrelin;rat;gastrointestinaltractofrats;immunochemistrySPmeth󰀁od

󰀁󰀁Ghrelin是由Kojima等

[1]

最早发现于大鼠胃底

腺区的生长激素促分泌激素受体(GHS󰀁R)的内源性配基。Ghrelin主要有非辛酰基化和3位丝氨酸辛酰基化2种形式,其中后者是GHS󰀁R的主要活性形式。Ghrelin在哺乳动物胎儿期的胃中即有表达,并且随着胃的发育而增加[2]。在哺乳动物甲状

*[收稿日期][基金项目][作者简介][通信作者]

󰀁󰀁󰀁󰀁腺、胰腺、肾脏、下丘脑垂体和性腺中也发现了Gh󰀁

[3]

relin阳性细胞,此外其也广泛存在于鸟类和鱼类组织中。Ghrelin主要由胃底部泌酸腺X/A样细胞分泌进入血液循环[4󰀁6],并通过下丘脑󰀁垂体轴调节生长激素的合成与释放;除此之外,其还有增强胃肠动力、保护胃黏膜、促进胃酸分泌和抑制炎症因子释

2009󰀁10󰀁27

陕西省自然科学基金项目(SJ08C105)

徐󰀁立(1984-),男,山东台儿庄人,在读硕士,主要从事神经生物学研究。

赵慧英(1966-),女,陕西韩城人,教授,硕士生导师,主要从事动物神经生物学研究。E󰀁mail:ylzhaohy@yahoo.com.cn60西北农林科技大学学报(自然科学版)第38卷

放的功能[7]。此前的研究结果已经表明,外源注射Ghrelin可刺激动物的食欲,但却不能增加动物的取食量[8]。糖类、脂肪和蛋白类等大量营养元素会影响动物的Ghrelin分泌,动物摄取的能量对Ghrelin的分泌有抑制作用,即摄入的能量越多,Ghrelin的分泌量就越少[9󰀁10],但目前尚不清楚营养条件的变化是否会对动物胃肠道内的Ghrelin表达产生影响。为此,本试验对不同营养条件下大鼠胃和小肠内Ghrelin阳性物质的表达情况进行研究,以期为揭示Ghrelin对胃肠分泌和动力功能的调节提供依据。

色,反应时间10~30min,蒸馏水终止反应。同时进行阴性对照试验,用0.01mol/LPBS缓冲液代替第一抗体Ghrelin(pH=7.4),其他步骤相同。切片染色后在400倍Motic显微镜下拍照,Ghrelin阳性产物表现为蓝色或蓝黑色,阴性对照不着色。1.4󰀁数据统计与分析

在每组大鼠胃和小肠切片中各随机选取5张,在400倍Motic数码显微镜下进行拍照,用江苏捷达801形态分析软件统计和测量阳性细胞的数量及灰度值后,用Spass软件进行数据分析,数据用#平均数∃标准差(X󰀂∃S)%表示,并进行t检验。灰度值与阳性产物的表达量呈反比,即灰度值越大阳性产物的表达量越少。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁材󰀁料

1.1.1󰀁试验动物󰀁健康成年雄性SD大鼠36只,由第四军医大学实验动物中心提供。

1.1.2󰀁饲料的配制󰀁标准饲料为普通商用饲料,购自第四军医大学实验动物中心;高营养饲料按照建立大鼠肥胖模型的饲料配制[11󰀁12]并进行改进,即在每100g标准饲料中加入鸡蛋、白糖、猪油各10g,面粉20g;低营养饲料按照m(麸皮)∀m(玉米粉)=2∀1的比例配制。1.2󰀁试验设计

将试验大鼠适应性饲养1周后,随机分成对照组、高营养组和低营养组3组,每组12只,分别用标准饲料、高营养和低营养饲料进行饲喂。2周后,每组大鼠随机取6只禁食不禁水24h;然后各组大鼠分别用体积分数10%水合氯醛腹腔麻醉(4mL/kg),开胸腔,先用350mL生理盐水经主动脉快速将动物体内血液冲净,再用40g/L多聚甲醛(pH=7.4)灌注固定后,取大鼠胃及小肠各段,清洗并放入40g/L多聚甲醛后固定;其余大鼠全换用标准饲料饲养,2周后用同样方法取材。1.3󰀁切片的制备与染色观察

将固定好的组织修剪成所需大小后脱水、透明、浸蜡、包埋,将包埋好的组织连续切片(德国LeicaCM1900),片厚6󰀁m。胃和十二指肠、空肠、回肠切片各备2套,其中一套用于HE染色以确认细胞类型;另一套用Ghrelin免疫组织化学SP法染色,染色步骤按试剂盒(北京博奥森SP󰀁0023)说明书进行,第一抗体为兔抗Ghrelin(北京博奥森bs󰀁0467R),工作浓度1∀150;显色液是葡萄糖氧化酶󰀁硫酸镍胺增强型的DAB(DAB和葡萄糖氧化酶均为美国Sigma公司产品),显色后阳性细胞呈现蓝2󰀁结果与分析

2.1󰀁不同营养条件下大鼠胃和小肠中Ghrelin阳

性细胞的定位

对标准营养组大鼠,胃中Ghrelin阳性细胞主要存在于胃底腺区黏膜固有层(图1󰀁A1),呈圆形或锥形,细胞浆或全细胞着色(图1󰀁B1),黏膜上皮层无细胞着色,黏膜下层偶见着色细胞,肌层未见着色细胞;十二指肠中的阳性细胞大部分胞浆着色,在黏膜、黏膜下层和肌层均有分布,上皮层阳性细胞主要呈锥形,是分泌型细胞,固有层中的阳性细胞既有#开放型%也有#闭合型%,呈圆形、锥形或不规则形状(图1󰀁C1),肌层中着色细胞呈圆形或梭状;空肠Gh󰀁relin阳性细胞主要集中在固有层肠腺和黏膜下层,上皮细胞着色不明显;回肠着色细胞分布于黏膜下层(图1󰀁D1),肌层的着色颗粒变淡或逐渐消失。

对于2周高营养组大鼠,胃中Ghrelin阳性细胞主要集中在胃底腺区黏膜层的颈部和体部,着色细胞呈圆形或不规则状,黏膜上皮层、黏膜下层和肌层均无阳性细胞(图1󰀁A2);十二指肠着色细胞为圆形或不规则状,分布于上皮、固有层和黏膜下层,肌层无着色;空肠阳性细胞遍布于各层;回肠阳性细胞主要集中在肠腺的底部(图1󰀁C2),而且肌层着色较浅。

对于4周高营养恢复组大鼠,胃中Ghrelin阳性细胞在黏膜、黏膜下层和肌层均有分布,在胃底腺区较集中,并且单个细胞着色面积大、着色程度深,固有层可见圆形深着色淋巴样细胞(图1󰀁B2),肌层着色浅;十二指肠各部均有Ghrelin阳性细胞分布,且大部分为胞浆着色,固有层中阳性细胞分布较广并可见锥形#开放型%细胞;空肠中阳性细胞在各层均有分布第4期徐󰀁立,等:营养条件对大鼠胃及小肠内Ghrelin表达的影响61

(图1󰀁D2);回肠的阳性细胞集中在黏膜下层。

图1󰀁不同营养条件下Ghrelin阳性细胞在大鼠胃及小肠中的表达(&400)

A1~A3.分别为标准、高、低营养处理2周的胃;B1~B3.分别为标准营养处理4周的胃、4周高营养恢复组的胃、4周低营养恢复组的胃;

C1~C3.分别为标准营养处理2周的十二指肠、高营养处理2周回肠、低营养处理2周的十二指肠;D1~D3.分别为标准营养

处理4周的回肠、高营养恢复组的空肠、低营养恢复组的十二指肠

Fig.1󰀁Ghrelin󰀁ipcellsinthegastrointestinaltractunderdifferentnutritionalcondition(&400)

A1-A3.Immunopositivecellsinthestomachofratsinnormal,high,lownutritionlevel;B1-B3.Immunopositivecellsinthestomachofratsafter4weeksnormal,highandlownutritionaltreatment;C1-C3.Immunopositivecellsintheduodenum,

ileum,andduodenumofratsindifferentnutritionlevel;D1-D3.Immunopositivecellsintheileum,

jejunumandduodenumofratsafter4weeksnutritionaltreatment

󰀁󰀁对于2周低营养组大鼠,胃中Ghrelin阳性细胞遍布于黏膜、黏膜下层、肌肉层和外膜,且在胃底腺区成片大量富集,胃壁细胞着色深,胞浆或全细胞着色,胃主细胞胞浆着色,部分不着色(图1󰀁A3);十二指肠着色细胞大多呈圆形或不规则形,胞浆着色,在肠腺底部有极少的锥形阳性细胞(图1󰀁C3);空肠阳性细胞集中在肠腺和黏膜下层,胞浆着色;回肠着色部位与空肠相当,但肌层不着色。

对于4周低营养恢复组大鼠,胃中Ghrelin阳

性细胞零星地分布于胃底腺区(图1󰀁B3),细胞呈圆形,黏膜下层和肌层也有少量阳性细胞;十二指肠肌层和黏膜下层可见阳性细胞(图1󰀁D3);空肠上皮、62西北农林科技大学学报(自然科学版)第38卷

固有层和黏膜下层有阳性细胞分布;回肠中只有少量阳性细胞分布于上皮、固有层和黏膜下层。2.2󰀁不同营养条件对大鼠胃和小肠中Ghrelin阳

性细胞数量的影响

在2周标准组大鼠中,十二指肠Ghrelin阳性细胞数量较胃少(P<0.05),但远比空肠多(P<0.01);空肠Ghrelin阳性细胞数量远少于回肠(P<0.01)(图2A)。随着饲养时间的延长,4周标准组胃Ghrelin阳性细胞数量和细胞着色强度均大于2周标准组(P<0.01);十二指肠Ghrelin阳性细胞数量比胃少(P<0.01),与2周标准组十二指肠Ghre󰀁lin阳性细胞数量差异不大;空肠Ghrelin阳性细胞数量与十二指肠差异不明显,但远多于2周标准组空肠(P<0.01),其肠腺底部周围细胞着色深;回肠Ghrelin阳性细胞表达量与空肠无明显差异(图2B)。

2周高营养组大鼠中,胃Ghrelin阳性细胞数量

最多;十二指肠与2周标准组着色相当;空肠Ghre󰀁lin阳性细胞数量与十二指肠无差异,极显著多于2周标准组空肠(P<0.01);回肠与2周标准组回肠无明显差异(图2C)。

4周高营养恢复组大鼠中,胃中Ghrelin阳性细胞数量较多,与2周高营养组相比,Ghrelin阳性细胞数量无明显差异(P>0.05);十二指肠中Ghrelin阳性细胞数量较4周标准组的高(P<0.05);空肠Ghrelin阳性细胞数量与4周标准组差异不显著;回肠与2周高营养组Ghrelin阳性细胞数量无显著差异(图2D)。

2周低营养组大鼠中,胃Ghrelin阳性细胞着色均较2周标准组和2周高营养组胃深(P<0.05);十二指肠Ghrelin阳性细胞数量比胃少(P<0.01),与2周标准组十二指肠相当;空肠Ghrelin阳性细胞着色与十二指肠无显著差异;回肠Ghrelin阳性细胞数量与空肠相当(图2E)。

图2󰀁不同营养条件下大鼠胃肠道Ghrelin阳性细胞灰度值的比较

A.2周标准组;B.4周标准组;C.2周高营养组;D.4周高营养恢复组;E.2周低营养组;F.4周低营养恢复组

Fig.2󰀁GraylevelofGhrelin󰀁ipcellsingastrointestinaltractunderdifferentnutrition

A.Controlgroup2weeks;B.Controlgroup4weeks;C.Highnutritionalgroup;D.Hightonormalgroup;

E.Lownutritionalgroup;F.Lowtonormalgroup

󰀁󰀁4周低营养恢复组大鼠中,胃Ghrelin阳性细胞数量和单细胞着色面积均与2周低营养组差异极显著(P<0.01),与4周高营养恢复组差异显著(P<0.05);十二指肠Ghrelin阳性细胞数量较4周高营养恢复组少(P<0.05),与2周低营养组十二指肠差异不显著;空肠Ghrelin阳性细胞数量与4周标准组空肠差异不显著;回肠细胞着色与空肠之间差异不显著(图2F)。

3󰀁讨󰀁论

Ghrelin自发现之日起便成为研究热点。随着研究的不断深入,人们发现Ghrelin对动物激素分泌、饮食和代谢都有影响。Kobelt等

[13]

发现,对大

鼠进行外周Ghrelin注射可引起下丘脑背侧核Fos的表达,从而刺激动物采食;此外,还有研究者发现,能量变化会对Ghrelin的分泌和表达产生影响,如禁食会使Ghrelin的分泌量增加,而重新进食后Gh󰀁relin表达水平下降[14󰀁17]。第4期徐󰀁立,等:营养条件对大鼠胃及小肠内Ghrelin表达的影响63

本研究对大鼠进行不同营养处理,在各组均恢复到标准营养状态后,用免疫组织化学SP法对大鼠的胃肠道内的Ghrelin阳性细胞进行研究。结果表明,Ghrelin分泌细胞存在于大鼠胃的底部,且#开放型%和#闭合型%同时存在,但以#闭合型%为主。在低营养状态下,大鼠胃中Ghrelin阳性细胞增多,表明糖类、蛋白等营养物质的不足,会导致动物胃中Ghrelin分泌增加;与胃相比,其对小肠肠中Ghrelin阳性细胞数量的影响较小。糖类、蛋白等营养物质供给充足后,胃中的Ghrelin阳性细胞数量明显减少,从而进一步验证了上述结论。Sakata等[18]曾报道,大鼠的十二指肠及回肠段存在分泌Ghrelin的细胞。本研究结果证实,高糖、高脂、高蛋白使得十二指肠和回肠中分泌Ghrelin的细胞减少。这一结果为糖类、脂类等营养物质可以抑制十二指肠和回肠中Ghrelin的分泌提供了组织学依据。

作为生长激素促分泌受体的内源性配体存在的Ghrelin,越来越多的证据表明其在胃肠道生物活性调节中发挥着重要作用。幽门螺杆菌导致的慢性胃炎患者和短肠综合征体内的Ghrelin浓度会降低[19]。Ghrelin受体(GHS󰀁R)2种亚型都存在于胰岛中,胰岛也可以分泌Ghrelin,提示Ghrelin可能通过胰岛素来调节糖代谢。对小鼠的研究结果也显示,其体内的Ghrelin可通过胰岛素增强对葡萄糖的消耗作用

[20]

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。由于Ghrelin分布广泛,同时其又

在不同的激素调节中发挥作用,所以进一步研究

Ghrelin对营养物质代谢的控制作用机理,可为胃肠道调节和保护药物的开发提供参考。[参考文献]

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