v〇l 27, n〇. 12, June 2〇, 2018 China Pharmaceuticals
.硏究.
Drug Research
•
检验检测•
doi： 10. 3969/j. issn. 1006 -4931. 2018. 12. 006
青蒿琥酯及其制剂中有关物质的测定方法探讨*
赵画12,曾令高1A
(1.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121; 2.上海市食品药品包装材料测试所，上海201203)
摘要：目的建立分离及测定青蒿破酯及其制剂中有关物质含量的高效液相色谱法。方法采用Dikma Diamonsil Ci8柱（250 mm x 4.6mm，5 pm)，以磷駿缓冲液（pH = 3.0)-乙腈（56:44)为流动相，流速为1.0mL/min，外标法测定，检测波长为216nm。结果青蒿 琥酯与已知杂质A，B，I能完全分离，相对保留时间一致，并可通过简单加热破坏方法得到杂质I，用于定性检测。结论该方法准确、快 速、专属性强，适用于青蒿琥酯及其制剂中有关物质的测定。
关键词：青蒿琥酯制剂；高效液相色谱法;双氢青蒿素;青蒿素；脱水双氢青蒿素;含量测定
中图分类号：R284.1;R286.0
文献标识码：A
文章编号：1006-4931(2018)12-0019-03
Content Determination of Related Substances in Artesunate and Its Preparations
Zhao Hua1，2, Zeng Linggao】牗1. Chongqing Institute for Food and Drug ControlChongqing, China
,
401121; 2. Shanghai Food and Drug Packaging Material Control Center
,
Shanghai, China 201203)
Abstract： Objective To establish an HPLC method for content determination of related substances in artesunate and its prepara
tions. Methods The Dikma Diamonsil C18 column (250 mmx4. 6 mm, 5 ^m) was adopted with external standard method, the mobile phase was composed of buffer (pH =3.0) - acetonitrice(56 : 44), the flow rate was 1.0 mL/min, and the detection wavelength was 216 nm. Results
Artesunate could be completely separated from the known impurities A, B, I, and the relative retention time was con
The method is
sistent, and the impurity I could be obtained by a simple heating failure method for qualitative detection. Conclusion
accurate, rapid and specific, which is suitable for the determination of related substances in artesunate and its preparations.Key words: preparation of artesunate; HPLC; dihydroartemisinin; artemisinin; dehydrated dihydroartemisinin; content determination
青蒿素是从中药青蒿中提取的有过氧基团的倍半
萜内酯类化合物，具有抗疟疾作用，由我国在20世纪 70年代独立研制，并于1986年获批为国家一类新药。 由于其生物利用度低，后续研发出双氢青蒿素、青蒿琥 酯等半倍萜内酯化合物青蒿素的衍生物,均作为一类新 药获准上市[1]。青蒿琥酯作为其衍生物之一，具有更好 的生物利用度，临床用于疟疾、寄生虫病甚至肿瘤、病毒 等的治疗[2-9]。其合成工艺大多以青蒿素为起始原料, 合成过程中易引人起始原料青蒿素、中间体双氢青蒿素 及降解产物等潜在杂质，在合成及储存过程中受热易分 解产生双氢青蒿素、脱水双氢青蒿素等降解产物。因此, 对青蒿琥酯及其制剂的工艺杂质及降解产物进行研究 和控制十分有必要。目前,016年版《国际药典》和2015 年版《中国药典(二部)》[10犦收录了青蒿琥酯及其制剂中 有关物质的检查方法,但杂质I的获取和结构表征未见 报道。本研究中对已收载的检测方法进行了比较及优 化，最终确定了适合青蒿琥酯及其片剂和注射用制剂的 检测方法,并对难以获得对照品的杂质1(脱水双氢青 蒿素)提供了定性获取方法。现报道如下。
1
仪器与试药
(梅特勒公司,感量为0. 01 mg/0. 1 mg) ;CP224型电子天
平(赛多利斯公司）；D240型烤箱(德国宾德公司牘。1.2 试药
青蒿琥酯(市售品）青蒿琥酯片(市售品，规格为每 片50 mg或100 mg);注射用青蒿琥酯(市售品，规格为 每瓶60mg);青蒿琥酯对照品(批号为100200 -201003), 双氢青蒿素对照品（批号为100184-200401),青蒿素 对照品（批号为100202 -201004),均购自中国食品药 品检定研究院;脱水双氢青蒿素对照品（上海药明康德 新药开发有限公司，含量为83. 73% )乙腈为色谱纯； 试验用水为超纯水;其余试剂均为分析纯。
2
方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验
色谱条件:色谱柱为Dikma Diamonsil C18柱(250 mm x 4. 6 mm,5 pm);流动相为磷酸盐缓冲液(pH = 3. 0)-乙 腈(56 : 44);流速为1. 0mL/min;检测波长为216nm;柱温为30 °C ;进样量为20 pL。青蒿琥酯无共轭吸收，参考 《国际药典》标准，樹则波长选用216nm。采用外标法测定。
系统适用性试验:取经100 C热破坏30 min的青 蒿琥酯原料干粉0. 101 90 g,青蒿素对照品0. 010 71 g, 双氢青蒿素对照品0.012 11 g,置100 mL容量瓶中，用 乙腈溶解并稀释至刻度，即得系统适用性试验溶液，取
1.1
仪器
Waters 2695型高效液相色谱仪;XS205型电子天平
*基金项目：全球基金项目-国家药品标准提高课题[GF2012 -42]。
第—作者:赵画，女，硕士研冗生，工程师，主要从事药物、辅料和包装材料分析工作，（电子信箱）cry -927@ 163. com。 △通信作者：曾令高，男，硕士研究生，主任药师，研究方向为药品标准及质量控制，（电子信箱）243910029@qq.com。
19
•研究•
Drug Research
2018年6月20日第27卷第12期
China Pharmaceuticals
Vol. 27, No. 12, June 20, 2018
20吣进样，色谱图见图1。双氢青蒿素（峰2)和青蒿琥 酯(峰3)分离度为2. 97,各杂质峰相对于青蒿號酯的保留 时间，双氢青蒿素为0. 57和0. 91，青蒿素为1. 31，杂质I 为 2. 74。
AU
图1
青蒿琥酯系统适用性试验色谱图
2.2 溶液制备
供试品溶液：取青蒿琥酯或注射用青蒿琥酯粉末
40 mg，分别置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻 度，摇匀，作为青蒿琥酯相应供试品溶液;取青蒿琥酯 片，研为细粉，取适量（约相当于青蒿琥酯40 mg)置 10 mL容量瓶中，加乙腈适量，振摇或超声15 min使溶 解，冷却，用乙腈稀释至刻度，摇匀，用0. 45 pm滤膜滤 过，取续滤液，作为青蒿琥酯片供试品溶液。
对照溶液:精密量取青蒿琥酯、注射用青蒿琥酯和 青蒿琥酯片供试品溶液各1 mL，分别置100 mL容量瓶 中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，分别作为其对照溶液。2.3 测定方法
精密量取供试品溶液和对照溶液各20叫，分别 注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的 4倍。
2.4 方法学考察
专属性试验：1)酸破坏，取青蒿琥酯约100 mg，置 25 mL容量瓶中，加1 mol/L盐酸溶液5 mL，水浴加热 5 min，取出放冷，用氢氧化钠溶液调至中性，加乙腈至 刻度，滤过;2)碱破坏，取青蒿琥酯约100 mg，置25 mL 容量瓶中，加0. 1 mol / L氢氧化钠溶液5 mL，振摇 5 min，用盐酸溶液调至中性，加乙腈至刻度，滤过;3)氧 化破坏，取青蒿琥酯约40 mg，置10 mL容量瓶中，加 30%乐〇2溶液2 mL，水浴加热10 min，取出放冷，加乙 腈至刻度，滤过;4)光破坏，取青蒿琥酯，在4 500 lx光 强度照射下，7 d后取样40 mg，加乙腈10 mL溶解； 5)高温破坏，取青蒿琥酯置平皿中，敞口放于100 °C培 养箱中，6 h后，取样40 mg，加乙腈10 mL溶解。按上述 有关物质检查法各进样20叫测定，记录色谱图。结果 表明，上述高效液相色谱(HPLC)法能使按强制破坏方 法获取的各杂质与青蒿號酯有效分离，专属性强。
耐用性试验:照2. 1项下色谱条件和方法配制系统 适用性溶液，分别考察了在不同品牌填料的色谱柱中青20
蒿琥酯峰与10-异构-双氢青蒿素峰的分离情况。结 果各型号色谱柱均能达到分离要求，表明该色谱系统适
用于目前市场上的绝大多数C18色谱柱。
相对响应因子考察:称取青蒿琥酯、双氢青蒿素、青 蒿素和杂质I(含量83. 73% )对照品0. 010 18,0. 01009, 0.010 42,0.010 14 g，置同
一
10 mL容量瓶中，用乙腈
溶解并稀释至刻度。按2. 1项下色谱条件测定，计算各 峰与青蒿琥酯峰的响应因子。因考虑到双氢青蒿素在乙 腈中溶解度不好，故未考察4 mg/mL的质量浓度响应 因子。结果见表1。
表1
相对响应因子考察结果
名称
峰面积称样量比值双氢青蒿素（面积和）578 6240. 010 090. 81青蒿琥酯718 5170.010 181.00青蒿素654 5300. 010 420. 92杂质I
7 275 004
0. 008 490 2
10.13
定量限及检测限测定:取相对响应因子考察项下溶液
5. 0 mL，置100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得双 氢青蒿素、青蒿素和杂质I质量浓度分别为0. 050 45, 0.052 10,0.050 70 mg/mL 的溶液，量取 5 —L 进样，记 录色谱图。以信噪比（W
)为3或10计算检测限及定
量限，双氢青蒿素为0. 105 4 pg和0. 351 3 pg，10 -异 构-双氢青蒿素为0. 299 1畔和0. 997 0畔，青蒿素为 0. 182 6 pg 和 0. 608 6 pg，杂质 I 为 0. 031 4 pg 和 0. 104 8 pg。
2.5 杂质I结构确认
在热破坏中发现，相对保留时间2. 7处有1个较大 杂质，2016年版《国际药典》中提出其为杂质C(脱水双 氢青蒿素），2015年版《中国药典》命名为杂质I。为确保 热破坏产生的杂质即为杂质I，对其进行了结构确认。
定性获取:采用Waters2695型高效液相色谱仪试验。 色谱条件为 Phenomenex Luna C18(2)色谱柱（100 mm X 4. 6 mm，3 pm)，流速1. 0 mL/min,流动相为磷酸缓冲液
(pH = 3. 0)-乙腈(56 : 44)。为确保热破坏获得的杂质I
满足检测限要求，首先采用极限破坏试验，取100 C加 热破坏31 h的原料干粉0. 01 g，置25 mL容量瓶中，用 乙腈溶解并稀释至刻度，得供试品热破坏溶液。在长时 间热破坏条件下，青蒿琥酯峰绝大多数降解为杂质I。保留时间确认:取杂质I对照品适量，用乙腈配置 成质量浓度为1 g/L的溶液，取此溶液和供试品热破坏 溶液各20 pL，进样，色谱图见图2。结果保留时间
一
致。
二级质谱确认:取杂质I对照品和供试品热破坏溶 液进行分子量确认。仪器为Waters TQD - UPLC型超高 效液相质谱联用仪。质谱条件为，电喷雾正离子化，喷雾 电压3 kV，锥孔电压35 V;二级质谱扫描子离子模式，
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Drug Research
AU
A
1.杂质I
A.杂质I对照品溶液
B.青蒿琥酯供试品热破坏溶液
图2
杂质I确认高效液相色谱图
碰撞能量8 eV。色谱条件为，AIQUITY UPLC BEH Ci8柱 (100 mm X 2. 1 mm, 1. 7 pm)，流速为 0. 5 mL/min，流动 相为乙腈-水(44 : 56)。通过对2种溶液中杂质I的一 级质谱及二级质谱的比对，发现其质谱裂解行为一致。相对分子质量确认:对供试品热破坏溶液中杂质I
的分子量进行确认。仪器为Waters四极杆飞行时间串 联质谱-超高效液相色谱仪。质谱条件为，电喷雾正 离子化，喷雾电压3 kV，锥孔电压35 V。色谱条件为
AIQUITYUPLCBEHC18 色谱柱(50mmx2. 1mm，1. 7|xm)，
流速为0. 5 mL/min，流动相为乙腈-水(44 : 56)。结果 推测出来的相对分子质量为267. 157 8,提供的结构式 仅为I15H23〇4,这与2011年版《国际药典》提供的杂质I (脱水双氢青蒿素）的分子式和相对分子质量一致，确认 热破坏的杂质峰即为杂质I。2.6 样品有关物质测定
取青蒿琥酯、青蒿琥酯片和注射用青蒿琥酯供试 品，照2. 1项下系统适用性试验方法处理，结果有不同 程度的杂质检出。结果见表2。
3
讨论
对青蒿琥酯进行强制降解试验，并对其降解产物进 行分析，发现青蒿琥酯对强光条件稳定。在高温条件下，容 易降解产生杂质脱水双氢青蒿素;在强氧化，强酸和强碱 条件下均不稳定，产生双氢青蒿素及其他未知杂质，通过 对已知杂质对照品的液相保留时间确认确定了双氢青蒿 素、青蒿素的出峰顿序和与青蒿琥酯的相对保留时间。
由于市售脱水双氢青蒿素对照品难以购买，《中国 药典》采用相对保留时间对杂质I进行定位。但在实际 检验中，以相对保留时间定位杂质可能会出现混淆，难 以对特定杂质进行准确定位。为更准确定位杂质I，采
表2
青蒿琥酯原料及其制剂有关物质测定结果(％ )
有关物质(％
)
剂型批号双氢青青蒿素杂质I 最大单杂质 蒿素
(X0.07)
个杂质总和青蒿琥酯1208010.05000. 060. 108原料
12080200.081000.0811208030.040000. 040注射用青1206170. 1100. 02300. 13蒿琥酯
1207110. 01900. 01700. 036120903
0. 1500. 01500. 17青蒿琥酯1207010. 10. 0680. 01300. 78片剂
1207050. 0700.01100. 181205020. 2200. 01900. 08120702
0. 087
0.081
0. 017
0
0. 24
用热破坏后，与对照品保留时间和二级质谱的方法同时
对其进行确认，并经过试验发现，热破坏30 min即可产生杂质I，在不采用杂质对照品的同时准确定位杂质I，便于检测过程中进行定性控制。
通过杂质对照品和二级质谱的方式对已知杂质进行了确认，发现其相较主要成分保留稳定，并对其检测限和定量限进行了测试，结果表明，该方法可以准确地分析样品中的已知和未知杂质。
参考文献：
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(收稿日期=2017 -12 -28)
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