双水相体系萃取纯化紫甘蓝色素

双水相体系萃取纯化紫甘蓝色素

李治城1，李靖靖1，潘晓静1，展亚莉2，常秀莲1，*

（1. 烟台大学生命科学学院，烟台 2005；2. 青岛鹏远康华天然产物有限公司，莱西 266612）

摘 要：采用聚乙二醇（PEG）/硫酸铵双水相体系萃取纯化紫甘蓝中的花青素。通过单因素实验优化了硫酸铵、PEG、粗提液的质量分数和体系的pH，通过正交实验确定各因素对花青素选择性系数的影响程度，粗提液的质量分数＞pH＞硫酸铵的质量分数＞PEG的质量分数。实验最佳提取条件为：粗提液的质量分数为12%，硫酸铵质量分数为20%，pH为3.5，PEG的质量分数为15%，花青素的选择性系数为750.26。关键词：紫甘蓝；天然色素；双水相萃取；选择性系数

中图分类号：TS202.3/TS2.4 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2019）09-0077-05

Separation of anthocyanidins from red cabbage by aqueous two-phase system

LI Zhi-cheng1，LI Jing-jing1，PAN Xiao-jing1，ZHAN Ya-li2，CHANG Xiu-lian1，*

（1. School of Life Sciences，Yantai University，Yantai 2005；

2. Qindao Pengyuan Kanghua Natural Products Company，Co. Ltd.，Laixi 266612）

Abstract：The anthocyanins in red cabbage were extracted by PEG/ammonium sulfate aqueous two-phase system. The mass fraction of ammonium sulfate，PEG，crude extracts and the pH value of the system were optimized by

single factor experiment. The effect of various factors on the selectivity coefficient of anthocyanins were determined by orthogonal experiment in an order of crude extract mass fraction ＞ pH ＞ mass fraction of ammonium sulfate ＞ mass fraction of PEG. The optimum extraction conditions were as follows：the crude extracts 12%，the ammonium sulfate 20%，pH 3.5，PEG 15%. Under the above conditions，the anthocyanin selectivity coefficient was 750.26.Key words：red cabbage；natural pigment；aqueous two-phase extraction；selectivity coefficient

紫甘蓝（Brassica oleracea L.）又名赤甘蓝、红甘蓝，属于十字花科，芸薹属甘蓝种的一个变种。十字花科植物当中含有较为丰富的多酚类物质，紫甘蓝中的多酚类化合物主要是花青素［1］，花青素在植物体内主要以糖苷的形式存在，紫甘蓝中的花色苷类化合物主要为矢车菊色素的糖 苷［2］。花青素具有抗氧化、抗癌和降血糖等生理

活性［3-5］，同时紫甘蓝花青素在酸性到中性范围内可以实现颜色由红到紫的转变，可以广泛应用于糖果、饮料等食品生产当中，因此将紫甘蓝花青素开发成为食品添加剂具有很高的社会效益和经济效益。

双水相萃取是一种新型的物质分离技术，与传统分离方法相比，具有条件温和、产品活性损

收稿日期：2019-04-25 *通讯作者

基金项目：横向课题（SK18H08，SK18H09，SK19H21）；烟台大学2019年开放实验室（从紫甘蓝废渣中分离果胶）。作者简介：李治城（1995-），男，汉族，硕士研究生，主要研究方向为天然产物的分离提取。

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2019年第9期China Food Additives中国食品添加剂

试验研究

失小、分离步骤少、无有机溶剂残留、操作简单等优点［6］，国内外广泛应用于蛋白质的纯化［7］和抗生素的提取［8］，近些年来逐渐应用于天然色素的分离纯化研究［9］，国内对于使用双水相萃取纯化紫甘蓝色素的研究相对较少，国外有相关的报道，但并未对其萃取条件进行优化［10］。

紫甘蓝色素生产时，粗提液中含有大量的糖类杂质，极大地影响了色素的品质和稳定性。传统工业对于植物花青素的提取主要采用酸水浸提法、溶剂法，还有超声波法［11］。花色苷溶液中含有大量的单糖、二元糖、低聚糖和多糖等杂质。目前，柱色谱、高速逆流色谱和大孔吸附树脂广泛应用于花青素的分离、纯化［12-13］，可以实现色素与其糖类物质的分离，但与双水相萃取相比，成本较高、时间较长、对操作要求严格。因此使用双水相萃取的方法实现植物花青素与其糖类杂质的分离属于一种新型、快速、低成本的操作方式。本研究尝试使用双水相萃取技术，将紫甘蓝色素与糖类物质分离，通过选择性系数表征此方法的有效性。

1 材料和方法

1.1 实验仪器

pH211酸度计，意大利哈纳公司；TDL-60B低速大容量离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；HY-6双层振荡器，中外合资深圳天南海北有限公司；752S紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；AR1530分析天平，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司。1.2 实验材料

紫甘蓝，青岛鹏远康华天然产物有限公司提供；PEG6000配制成400 g/L；苯酚为优级纯；其他试剂均为分析纯。1.3 分析方法

1.3.1 紫甘蓝色素属于花色苷类，按照美国化学工程师协会（AOAC）对花青素类天然色素中花色苷总量的方法进行测定［14］

，以矢车菊-3-葡

萄糖苷计。

总花色苷（ mg/L）=

AMD1000

1ε

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2019年第9期式中：

吸光度A = （A520-A700）pH1.0 −（ A520-A700）pH 4.5M：矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2 g/mol；

D：样品储备液的稀释倍数；

1：光路长，cm，测试中采用1 cm 光路长的比色皿；

ε：26900，矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，L·mol-1·cm-1；

1000：由g换算成mg的转换系数。1.3.2 使用苯酚-硫酸法对上下相中总糖含量进行测定［15］。

1.3.3 选择性系数1ε

k的计算。 k

K花

K 糖

K糖C下花

其中：K花C上花C ，KC上糖

糖 下花C下糖

式中：

K花：花青素的分配系数；K糖：多糖的分配系数；

C上花：上相中花青素的质量浓度，mg/L；C下花：下相中花青素的质量浓度，mg/L；C上糖：上相中糖类物质的质量浓度，mg/mL；C下糖：下相中糖类物质的质量浓度，mg/mL。1.4 试验方法

1.4.1 紫甘蓝色素粗提液制备

取适量紫甘蓝洗净、切碎，使用榨汁机榨取原汁，100目滤布过滤，3000 r/min离心15 min，取上层清夜冷藏保存，使用前调pH。1.4.2 双水相体系建立

固定体系质量为30.0 g。在50 mL离心管中分别加入一定质量的硫酸铵和PEG6000原液，加入一定质量预先调过pH的色素粗提液，加水补至体系质量为30.0 g，置于振荡器上300 r/min于室温下震荡10 min后取下，读取上下相体积，用移液管分别移取上下相溶液于30 mL比色管中。1.4.3 花色苷含量的测定

精密吸取上下相溶液，分别用pH=1.0的氯化钾缓冲溶液和pH=4.5醋酸钠缓冲溶液稀释适当倍数，以蒸馏水做空白，分别在520 nm和

700 nm下测吸光值。根据1.3.1中公式计算上下相中花色苷含量，进而计算出K花。在700 nm波长下测定吸光度值是为了校正混浊对测定结果的干扰。

1.4.4 多糖含量的测定

以葡萄糖为对照，采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。回归方程为：y =8.1114x-0.0069，

R2= 0.9983。分别精密吸取上下相样品稀释液 1.0 mL于试管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，迅速加入浓硫酸溶液5.0 mL，摇匀，放置10 min后于40℃水浴加热10 min，取出后冷水浴5 min，以相应试剂为空白，在490 nm处测定吸光度，计算得到K糖。1.4.5 正交实验设计

由于各因素（即硫酸铵质量分数、PEG的质量分数、体系pH、粗提液质量分数）之间有相互协同作用，如表1所示，进行正交实验并分析，图1中硫酸铵的浓度在最高值18%时，选择性系数最大，因此正交实验设计硫酸铵浓度继续增高，为18%、19%、20%三个水平。

表1 正交实验水平因素表

Table 1 factors and levels of orthogonal experiments

因素

水平

硫酸铵质量PEG的质量分数%分数% pH

粗提液质量（A）（B）

（C）分数%（D）

118152.511219163123

20

17

3.5

13

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 硫酸铵的质量分数对选择性系数k的影响

在50 mL离心管中加入15.0 g PEG6000原液，4.2 g色素粗提液，分别加入3.0 g、3.6 g、4.2 g、4.8 g、5.4 g硫酸铵，调节体系pH为5，双水相萃取结果如图1所示。

由图1可知，随着硫酸铵质量分数的增加，选择性系数k呈上升趋势，选择性系数在硫酸铵质量分数为18%时达到最高。随着硫酸铵质量分

试验研究China Food Additives中国食品添加剂

数的增加，增强了上下两相物质的分相，提高了上相中花青素的浓度，同时提高了糖类杂质在下相的含量，增加了对色素的纯化程度。

700600500k400300200

10

1214161820

硫酸铵质量分数（%）

图1 硫酸铵的质量分数对选择性系数的影响 Fig. 1 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on

selectivity coefficient

2.1.2 PEG的质量分数对选择性系数k的影响

在50 mL离心管中加入5.4 g硫酸铵（硫酸铵的质量分数为18%），4.2 g色素粗提液，分别加入9.0 g、10.5 g、12.0 g、13.5 g、15.0 g PEG原液，调节体系pH为5，双水相萃取后的选择性系数和花青素与糖类杂质的分配系数结果如图2所示。

700k4001.0K花680K糖0.8300k660花0.6糖KK02000.46200.2121416182010022PEG质量分数（%）

图2 PEG的质量分数对选择性系数的影响 Fig. 2 Effect of mass fraction of PEG on selectivity

coefficient

由图2可知，随着PEG质量分数的增加，花青素与糖类杂质的分配系数都呈下降的趋势，花青素的降低幅度更大一些，选择性系数k存在先下降后上升再下降的趋势，在PEG质量分数为

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2019年第9期China Food Additives中国食品添加剂

试验研究

16%达到最高。

2.1.3 pH对选择性系数k的影响

在50 mL离心管中加入5.4 g硫酸铵，12.0 g PEG6000原液（PEG质量分数为16%），4.2 g色素粗提液，分别调节体系pH为1、2、3、4、5，双水相萃取结果如图3所示。

650600550500k450400350123456pH

图3 pH对选择性系数的影响

Fig. 3 Effect of pH on selectivity coefficient

如图3可知，随着pH的增大，选择性系数先升高后降低，在pH为3时达到最高，原因可能是因为紫甘蓝色素属于矢车菊类色素，在pH为3时色素大多呈分子状态存在，更易被萃取到上相中，因此使得测得的K花最大。2.1.4 料液加入量对选择性系数k的影响

在50 mL离心管中加入5.4 g硫酸铵，12.0 g PEG6000原液（PEG质量分数为16%），调节体系pH为3，分别加入1.8 g、2.4 g、3.0 g、3.6 g、4.2 g色素粗提液，双水相萃取结果如图4所示。

700600500k4003002006810121416料液加入量（%）

图4 粗提液质量分数对选择性系数的影响 Fig. 4 Effect of mass fraction of crude extract on

selectivity coefficient

80

2019年第9期如图4可知，随着料液加入量的增多，选择性系数呈现先升高后下降的趋势，在料液加入量为12%时，选择性系数达到最高。当料液加入量超过12%时，下相当中花青素的含量开始上升，导致K花开始下降，选择性系数k开始呈现下降趋势。

2.2 正交实验结果及分析

表2 正交实验结果

Table 2 The results of orthogonal experiments

实验号ABCDk11111388.6121222577.26313330.32123508.8652231495.2562312501.5173132750.26832139.4993321435.16

K11506.2317.731439.611319.02K21505.6216221521.281829.03K31734.911477.031785.871598.71k1502.08 9.24 479.87439.67 k2501.87 0.67 507.09 609.68 k3578.30 492.34 595.29532.90 极差R76.43

56.9

115.42

170.00

主次顺序D＞C＞A＞B最优水平A3B1

C3

D2

最优组合

A3B1C3D2

从上表可以看出，硫酸铵的添加量依然是越多，选择性系数越高，但实验过程不宜再增加

了，原因是一方面过高的硫酸铵浓度容易在下相析出结晶，另一方面增加了生产成本和在上相色素中的残留量，因此确定为20%。四个因素的影响次序为：粗提液的用量＞pH＞硫酸铵的用量

试验研究China Food Additives＞PEG的用量，综合单一因素实验，最佳实验条件：粗提液的质量分数为12%，硫酸铵质量分数为20%，pH为3.5，PEG的质量分数为15%，花青素的选择性系数为750.26。

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中国食品添加剂

3 结论

采用PEG/硫酸铵双水相体系萃取纯化紫甘蓝中花青素。正交实验最佳的萃取条件为：粗提液的质量分数为12%，硫酸铵质量分数为20%，pH为3.5，PEG的质量分数为15%，花青素的选择性系数为750.26。虽然使用PEG6000/硫酸铵双水相体系对紫甘蓝色素有很好的选择性，能够实现紫甘蓝色素与其糖类物质的分离，并且花青素的分配系数K花对选择性系数的影响程度远大于多糖的分配系数K糖，但后续如何实现聚合物和花青素的分离仍是企业生产所面临的难题。

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第二十四届中国国际食品添加剂和配料展览会暨第三十届全国食品添加剂生产应用技术展示会Food Ingredients China 2020展出时间：2020年3 月 17 日—19 日展出地点：国家会展中心（上海），崧泽大道333号详情请登陆：www.cfaa.cn812019年第9期