菌液稀释级数确认的方案

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菌液稀释级数确认方案

888888888 有限公司

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年月

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目录 1 目的

2 适用范围 3 依据

4 验证时间

5 验证小组成员及职责

6 验证所需要仪器设备、培养基、菌种及关键操作文件 7 接受标准 8 测试方法 9 测试结果

10 异常情况及处理 11 结论

12 再验证周期

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1 目的

建立菌液稀释级数确认方案，确定含菌量为 50～100cfu/ml 或 10～100cfu/ml 时， 各试验菌应当稀释的倍数或级数。 2 适用范围

2.1 本确认方案适用于验证试验或日常工作中涉及的菌种稀释操作。 2.2 确认对象为：

50～100cfu/ml ：大肠埃希菌 MCC(B)44102、金黄色葡萄球菌 CMCC(B)2600、3 枯草芽 孢杆菌 CMCC(B)6350、1 白色念珠菌霉 CMCC(F)9800。1

10～100cfu/ml ：乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)5009。4 3 依据

《药品 GMP》现行版、

《药品 GMP指南》国家药监局认证中心编写 2011 年版 《中国药典》现行版。 《中国药品检验标准操作规程》现行版。 4 验证时间

验证方案于 2014 年 月 日批准后，整个验证活动应在 10 个工作日内完成。 5 验证小组成员及职责

小组职务 组长 岗位 姓名 责任 编制验证方案， 编制验证报告； 进行 验证过程及结论的评价与分化验室主任主任 QA主管 析； 组织 协调实施本验证工作。 对编制的方案进行审核 批准再验证方案；评价与分析确认结 果；对验证报告进行最终结监督和复核方案实施过程。 组员 质量部 QA 负责方案的执行。 微检 QC 6 验证所需要的仪器设备、培养基、菌种及关键操作文件

6.1 验证需用仪器设备

器具名称 规格型号 检定日期 检定单位 有效期 细菌培养箱 霉菌培养箱 高压蒸汽灭菌器 架盘天平 水浴锅 净化工作台(阳

性)

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6.2 试验培养基

名称 生产厂家 批号 有效期 营养琼脂培养基 营养肉汤培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 改良马丁培养基 改良马丁琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 6.3 试验菌种

菌珠名称 来源 购入日期 传代次数 大肠埃希菌 MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 白色念珠菌霉 CMCC(F)98001 乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094 6.4 验证所需要关键文件及存放地方

关键资料名称 存放地点

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《细菌培养箱使用和清洁操作规程》

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《霉菌培养箱使用和清洁操作规程》 《高压蒸汽灭菌器使用和清洁操作规程》 《舒筋活血丸质量标准及检验方法》 《微生物限度检查法操作规程》 7 接受标准

7.1 阴性对照组测试结果应为阴性。

7.2 各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。

7.3 各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性， 除高级稀释未检出菌落外， 相邻稀释级的 菌落数应呈约 10 倍关系。 8 测试方法

按药典方法制备菌液，取 1ml 菌液在若干支含 9ml 的 0.9%无菌氯化钠溶液中，逐级 稀释成 10、10、10、⋯⋯10 级数的菌悬液。分别取各级 1ml，注入平皿，倾倒在琼脂 培养，按平皿计数法培养，测定各级菌落数。该试验平行进行 3 次。

0

-1

-2

-8

8.1 菌液制备

8.1.1 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物 分别接种至 3 支 10ml 营养肉汤培养基中，经 32.5 ℃±2.5 ℃培养 18～24h，备用。

8.1.2 取色念珠菌的新鲜培养物至 10ml 改良马丁培养基中，经 25.5 ℃± 2.5 ℃培养 24～ 48h，备用。 8.2 无菌氯化钠溶液的制备

至少准备 9ml/ 支×9 支 0.9%的无菌氯化钠溶液。 8.3 稀释

8.3.1 分别取 1ml 菌液（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门 菌、白色念珠菌）在 1 支含 9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，用吸管吹打约

-1

10 下，即成 10级，吸取该管菌液 1ml 至下支含 9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，用

-2-8

刻度管吹打约 10 下， 即成 10 级，依次，逐级稀释直至 10 级数，每递增一个稀释级，必须换一个吸管。 8.4 注皿

分别吸取上述各菌各级菌悬液 1ml 于平皿中，平行制备 2 个皿，金黄色葡萄球菌、大 肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌倾倒约 15ml 的营养琼脂培养基，白色念珠 菌倾倒玫瑰红钠琼脂培养基。按《微生物限度检查法操作规程》中的平皿法，培养，测定 各皿各菌菌落数。

9 测试结果： 见附表 1、 2、 3。

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10 异常情况及处理：

质量负责人： 验证小组组长：

QA

11 结论

11.1 按照本确认方案，确定了各菌达到规定含菌量时的稀释级别

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菌珠名称 大肠埃希菌

含菌量 确定的稀释级别

MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌

CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 白色念珠菌霉 CMCC(F)98001 乙型

副伤寒沙门菌

50～100cfu/ml

CMCC(B)50094

质量负责人： 12 再验证周期

10～100cfu/ml

验证小组组长： QA ：

12.1 当操作人员或接种方法发生变化时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。 12.2 国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。

12.3 定期验证暂定为二年

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附表 1

菌液稀释级别确认记录（单位： cfu ）

第 1 次试验

试验日期： 报告日期：

营养琼脂培养基 培养皿性质 金黄色葡萄球 菌 玫瑰红钠 培养基 乙型副伤寒沙 门菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 培养温度℃ 培养时间 级数 皿号 平 1 平 1 平 1 平 1 平 1 2 均 2 均 2 均 2 均 2 均 -010 -110 -210 -310 -410 -510 -6 -610 -710 -810 接受标准 50～100cfu/ml 10～ 100cfu/ml 50～ 100cfu/ml 符合要求的级 数 分析： 1、阴性对照组，即 10

-0

级，测试结果应为阴性。 结果：□符合要求 □不符

2 、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：□符合要求 □不符合要求

3 、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释 级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：□符合要求 □不符合要求

检验人：

复核人：

质量部 QA:

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合要求

2 、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：□符合要求 □不符合要求

3 、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：□符合要求 □不符合要求

检验人：

复核人：

质量部 QA:

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附表 2

菌液稀释级别确认记录（单位： cfu ）

第 2 次试验

试验日期： 报告日期：

营养琼脂培养基 培养皿性质 金黄色葡萄球 菌 玫瑰红钠 培养基 乙型副伤寒沙 门菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 培养温度℃ 培养时间 级数 皿号 平 1 平 1 平 1 平 1 平 1 2 均 2 均 2 均 2 均 2 均 -010 -110 -210 -310 -410 -510 -6 -610 -710 -810 接受标准 50～100cfu/ml 10～ 100cfu/ml 50～ 100cfu/ml 符合要求的级 数 分析： 1、阴性对照组，即 10

-0

级，测试结果应为阴性。 结果：□符合要求 □不符

2 、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：□符合要求 □不符合要求

3 、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释 级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：□符合要求 □不符合要求

检验人：

复核人：

质量部 QA:

编号： 888888

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合要求

2 、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：□符合要求 □不符合要求

3 、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：□符合要求 □不符合要求

检验人：

复核人：

质量部 QA:

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附表 3

菌液稀释级别确认记录（单位： cfu ）

第 3 次试验

试验日期： 报告日期：

营养琼脂培养基 培养皿性质 金黄色葡萄球 菌 玫瑰红钠 培养基 乙型副伤寒沙 门菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 培养温度℃ 培养时间 级数 皿号 平 1 平 1 平 1 平 1 平 1 2 均 2 均 2 均 2 均 2 均 -010 -110 -210 -310 -410 -510 -6 -610 -710 -810 接受标准 50～100cfu/ml 10～ 100cfu/ml 50～ 100cfu/ml 符合要求的级 数 分析： 1、阴性对照组，即 10

-0

级，测试结果应为阴性。 结果：□符合要求 □不符

2 、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：□符合要求 □不符合要求

3 、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释 级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：□符合要求 □不符合要求

检验人：

复核人：

质量部 QA:

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合要求

2 、各菌种的菌落形态在不同稀释级的平皿上应固定、一致。 结果：□符合要求 □不符合要求

3 、各菌种的菌落数在各稀释级应呈等比线性，除高级稀释未检出菌落外，相邻稀释级的菌落数应呈约 10 倍关系。 结果：□符合要求 □不符合要求

检验人：

复核人：

质量部 QA: