高效液相色谱-电喷雾-串联质谱研究四溴双酚A双(2-羟乙基醚)诱导

Vol.35 No.1

Chinese Journal of Chromatography

1〜7

邹汉法研究员纪念专辑（下）•研究论文

DOI: 10.3724/SP.J. 1123.2016.09001

高效液相色谱-电喷雾-串联质谱研究四溴双鼢A双（2-羟乙基醚) 诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞呼吸链氧化磷酸化和能量代谢紊乱

刘倩，胡立刚*，周群芳，江桂斌

(中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京100085)

摘要：四溴双酚A衍生物的毒理学研究亟须开展。已有研究发现四溴双酚A双（2-羟乙基醚）（161^价〇爪〇扮3?匕6-

nol A bis(2-hydroxyethyl ether)，TBBPA-BHEE)可诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12)活性氧（reactive oxygen

species，ROS)的生成。然而TBBPA-BHEE对PC12细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化过程的干扰机制尚不明确， TBBPA-BHEE是否通过破坏线粒体功能干扰细胞能量代谢亟待进一步探讨。建立了基于HPLC-ESI-MS/MS分析 PC12细胞内ATP、ADP、AMP及cAMP(cyclic AMP)浓度的方法，在此基础上评价了 TBBPA-BHEE暴露对PC12 线粒体呼吸链氧化磷酸化过程及能量代谢的影响。研究发现，TBBPA-BHEE可加速PC12线粒体呼吸链氧化磷酸 化过程;TBBPA-BHEE诱导的PC12线粒体功能紊乱可引起细胞能量代谢紊乱。一方面揭示了 TBBPA-BHEE对 PC12潜在的毒性作用机制，另一方面也证实HPLC-ESI-MS/MS是研究细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化及能量代谢

过程的有力工具。

关键词:高效液相色谱-电喷雾-串联质谱；四溴双酚A衍生物;大鼠嗜铬细胞瘤细胞;呼吸链氧化磷酸化;能量代谢 中图分类号:〇658

文献标识码:A

文章编号：1000-8713( 2017) 01-0001-07

Tetrabromobisphenol A bis (2-hydroxyethyl ether) induced dysfunction of the respiratory chain oxidative phosphorylation and energy metabolism in rat pheochromocytoma cells by high performance liquid chromatography-electrospray

ionization-tandem mass spectrometry

LIU Qian，HU Ligang^，ZHOU Qunfang，JIANG Guibin

(State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology，Research Center for

Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085, China)

Abstract： Toxicological effects of tetrabromobisphenol A (TBBPA) derivatives are highly con­cerned due to their increasing usages in diverse fields. It has been reported that tetrabromobis­phenol A bis (2-hydroxyethyl ether) (TBBPA-BHEE)，a representative of TBBPA derivatives， can induce cellular toxicity on rat pheochromocytoma cells (PC12) through reactive oxygen species mediated caspase activation. Nevertheless，underlying molecular mechanisms of intra­cellular reactive oxygen species (ROS) formation and effects of TBBPA-BHEE on PC12 energy metabolism remain unclear. This study developed the method for quantification of ATP，ADP， AMP and cAMP (cyclic AMP) simultaneously in PC12 with HPLC-ESI-MS/MS. The disturbance of TBBPA-BHEE on the respiratory chain oxidative phosphorylation and energy metabolism in PC12 cells was investigated via evaluation of the four compounds. It was shown that the ratio of ADP to ATP (ADP/ATP) decreased in PC 12 cells after TBBPA-BHEE stimulation，implying

收稿日期：2016-08-31

* 通讯联系人.Tel:(010) 62849129,E-mail:lghu@ rcees.ac.cn.基金项目：国家重点基础研究发展计划（“973”）项目（2015CB453102);国家自然科学基金-重点国际（地区）合作研究项目

(21461142001);中国科学院先导专项B( 14040302).

Foundation item： National Basic Research Program of China (No. 2015CB453102) ； National Natural Science Foundation of

China-Major International (Regional) Joint Project ( No. 21461142001)； Strategic Priority Research Pro­gram of the Chinese Academy of Sciences (No. 14040302).

• 2 •

色 谱第35卷

that TBBPA-BHEE accelerated the process of respiratory chain oxidative phosphorylation in PC 12 mitochondria. In addition, the concentrations of cAMP and the ratio of AMP to ATP (AMP/ATP) decreased in PC12 cells upon TBBPA-BHEE treatment, which suggested that TBBPA-BHEE potentially induced the mitochondrial dysfunction and led to the consequent energy metabolism imbalance in PC12. The results not only provided insight in the toxicological effects of TBBPA-BHEE, but also confirmed that HPLC-ESI-MS/MS was a powerful tool for studies on the cellular respiratory chain oxidative phosphorylation and energy metabolism.Key words： high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-M^^MS)； tetrabromobisphenol A (TBBPA) derivatives； rat pheo- chromocytoma cells (PC12) ； respiratory chain oxidative phosphorylation； energy metabolism

四溴双酚 A(tetrabromobisphenol A, TBBPA) 是目前世界范围内产量最大、应用最广泛的溴代阻 燃剂[1]。约有18%的TBBPA用于生产TBBPA衍 生物[2]。工业化生产的TBBPA衍生物包括四溴双 酚 A 双（2-羟乙基醚）（tetrabromobisphenol A bis (2-hydroxyethyl ether), TBBPA-BHEE)、四溴双 酚 A 双（2-缩水甘油醚）（tetrabromobisphenol A

因素。当线粒体氧化磷酸化过程被阻滞时,QH'的 有效浓度上升，诱导生成过量的ROS；当氧化磷酸 化加速进行时,QH•的生成速率上升,也会导致过量

ROS的生成[11]。因此,PC12线粒体功能受到TBB-

PA-BHEE的刺激或抑制均可导致过量ROS的生 成。TBBPA-BHEE诱导PC12细胞ROS生成的分 子机制，及TBBPA-BHEE对PC12线粒体呼吸链氧

化磷酸化过程的干扰机制值得进一步探究。此外, 线粒体是细胞能量代谢的核心，进人线粒体的丙酮 酸经过三羧酸循环（TCA)和呼吸链氧化磷酸化最 终生成ATP[ 14]。ATP水解产物ADP、AMP及转化 产物cAMP( cyclic AMP)也都是能量代谢调节中的 关键因子。TBBPA-BHEE是否通过干扰线粒体功 能对细胞能量代谢产生影响也为了本研究的核心 问题。

bis(glycidyl ether) , TBBPA-BGE)、四溴双酚 A 双

(2-稀丙基醚）（tetrabromobisphenol A bis(allyle-

ther) , TBBPA-BAE)及四溴双酚A双（2-二溴丙基 醚 ) ( tetrabromobisphenol A bis ( dibromopropyl ether) , TBBPA-BDBPE)。TBBPA 衍生物作为反

应型或添加型溴代阻燃剂大量应用于泡沫塑料、高 聚物、环氧树脂、热塑性聚酯、聚氨酯、层合板及聚酯 纤维中[3]。其广泛使用引发了日益增加的环境负 荷及人体暴露风险。研究显示,TBBPA衍生物在水 体、底泥、土壤、鸟类、鸟蛋等多种环境或生物介质中 频繁检出[4_6]。

TBBPA已被证实具有潜在的神经毒性、肝毒 性、免疫毒性和内分泌干扰效应[7_9]。与TBBPA相 比,TBBPA衍生物的毒理学资料非常匮乏。为准确 评价TBBPA衍生物对人体健康的影响，其毒理学 研究亟待进行。作者实验室[1°]基于大鼠嗜铬细胞 瘤细胞（PC12)的研究发现,TBBPA-BHEE (结构式 见图1)对细胞活力的抑制能力大于TBBPA及其他 3种衍生物。以TBBPA-BHEE作为模式化合物的 研究发现,TBBPA-BHEE诱导PC12细胞内活性氧

TBBPA-BHEE： tetrabromobisphenol A bis (2-hydroxyethyl

ether).

研究ATP及其相关代谢产物ADP、AMP、

cAMP等含量的变化是评价外源因素对细胞线粒体

呼吸链氧化磷酸化过程及能量代谢影响的有效手 段。周洁[15]利用ATP含量测定评价新生隐球菌荚 膜多糖毒力因子对小鼠小胶质细胞氧化磷酸化及能 量代谢过程的影响;ATP、ADP、AMP的浓度变化也 用于评价胡桃醌对大鼠肝脏氧化磷酸化及能量代谢 的影响[16]；拟南芥中cAMP含量的变化导致其能量 代谢过程的改变[17]。

化学发光试剂盒检测是生物学实验中最常用的 ATP检测方法。该检测方法波动大,无法同时测定

(reactive oxygen species, ROS)的生成是导致细

胞死亡的重要原因[IQ]。线粒体呼吸链的氧化磷酸 化过程是胞内ROS的主要来源，生成的ROS主要 为超氧化物（〇_.)[11],而呼吸链中CoQH2-细胞色 素c还原酶复合物（复合物m)产生的泛半醌自由 基中间体（QH.)是超氧化物的主要来源[12,13]。QH. 的有效浓度和生成速率成为ROS生成的关键

第1期

刘倩，等:高效液相色谱-电喷雾-串联质谱研究四溴双酚A双(2-羟乙基醚)

诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞呼吸链氧化磷酸化和能量代谢紊乱

ATP、ADP、AMP和cAMP[ls]，且复杂细胞基质对化

学发光检测存在强烈的背景干扰，腺嘌呤核苷酸在 细胞中的含量仅为亚微摩尔级等问题也困扰着 ATP及其代谢产物的准确定量[ls，l9]。HPLC-MS/

胞培养。PC12细胞以4X106个/皿密度接种于多 聚-L-赖氨酸包被的100 mm细胞培养皿中，在37 ^、5% (体积分数）C〇2细胞培养箱中培养。接种 24 h后，完全培养基换为含2% (v/v)胎牛血清的饥 饿培养基，用于细胞暴露实验。本实验室之前的研

究[10]表明，PC12细胞暴露于25 ^mol/L的TBBPA-

MS以分离效率高、检测灵敏度高、特异性好而被认

为是直接检测ATP及其相关代谢产物的有力工 具[2。，2|]。ATP及其相关代谢产物中磷酸基团的存 在导致该类物质极性较强，ESI的应用较好地克服

了这一问题[叫。

BHEE 6 h后，细胞活力在60%以上。其对细胞活

力无影响或亚细胞毒性的浓度适合线粒体干扰效应 的研究。本研究将PC12细胞暴露于25 ^mol/L的

本研究利用HPLC-ESI-MS/MS检测TBBPA-

BHEE 暴露后 PC12 细胞内 ATP、ADP、AMP、cAMP

的含量及相对变化，进而评价TBBPA-BHEE对PC12线粒体呼吸链氧化磷酸化过程及能量代谢的

影响。同时，结合细胞形态的改变进一步阐述了 TBBPA-BHEE的毒性机制。

1实验部分

I. 1

仪器、试剂与材料

Thermo Fisher 3111 型 C02 细胞培养箱，Ther­

mo Fisher HERAEUS FRESCO 21 型离心机 （美国 Thermo Fisher 公司）。OLYMPUS 1x73 型倒置荧 光显微镜（日本OLYMPUS公司）。JY92- n N型超

声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公 司）。Waters alliance 2695高效液相色谱仪，

Waters Quattro Premier XE 质谱仪（美国 Waters

公司）。

PC12细胞（未分化型）购于中国医学科学院基 础医学研究所基础医学细胞中心。RPMI-10细胞 培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清、青霉素和 链霉素（美国Gibco公司），多聚-L-赖氨酸、二甲基 亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO)、TBBPA-BHEE

(CAS No. 4162-45-2，98%)、ATP、ADP、AMP、 cAMP(美国Sigma公司）。苯酚、EDTA(分析纯，

国药集团化学药剂有限公司）。甲醇（色谱级，美国J. T. Baker公司），乙酸铵、甲酸（色谱级，德国

Merck 公司）。

100 mm细胞培养皿、细胞刮（美国Corning公 司），2 mL聚乙稀离心管（美国Axygen公司），0. 22 pm聚偏氟乙稀滤器（美国Millipore公司）。

1.2 PC12细胞的培养及TBBPA-BHEE暴露

100 mm细胞培养皿用10 ^g/mL的多聚-L-赖氨酸包被过夜，弃掉多聚-L-赖氨酸溶液，用无菌水 清洗培养皿，于生物安全柜中吹干。RPMI-10细 胞培养基中加人10°% (v/v)胎牛血清，100 U/mL青 霉素及100 ^g/mL链霉素作为完全培养基用于细

TBBPA-BHEE中，暴露时间分别为1、3、6和24 h， 0. 5% (v/v) DMS0作为溶剂对照组。使用倒置荧 光显微镜对对照组及24 h暴露组的细胞形态进行 观察，其他实验组用于ATP、ADP、AMP和cAMP的

测定。鉴于溶剂对实验结果无显著影响，在实验数 据展示时采用溶剂对照组结果，而不再给出空白对 昭组

1.3 ATP、ADP、AMP 和 cAMP 的提取

暴露实验结束后，弃掉培养皿中的细胞培养基， 用4 t预冷的磷酸盐缓冲液清洗细胞2次。向每个 培养皿中加人500 ^L 4 t预冷的提取缓冲液（10

mmol/L乙酸铵，4 mmol/L EDTA，苯酚饱和溶液，

口只7.5)，用细胞刮将卩612细胞刮下，收集于2爪[ 聚乙烯离心管中，整个操作在冰上进行。将上述细

胞提取液超声(工作时间:5 s;间歇时间：15 s;总时 间:60 s;超声功率:65 W)。将超声后的细胞提取液 溶液于15 000 r/min、4 t离心30 min，取上清液并 经0. 22 ^m滤器过滤得到待测溶液。另外，每个实 验组均设置一个平行处理组，用于暴露实验结束后 的细胞计数。1.4 ATP、ADP、AMP 和 cAMP 的测定 1.4.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C18 色谱柱 (150 mmx4. 6 mm，5 pm，美国 Agilent 公司）；流 动相:含0. 1°% (v/v)甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液 (A)和含0. 1%(v/v)甲酸的甲醇溶液(B)。梯度洗 脱程序:0~5. 0 min，5%B; 5. 0~16. 0 min，5%B ~ 100% B; 16.0 〜21.0 min，5% B。流速：0.8

mL/min;柱温:35 t;进样量:10 pL。

1.4.2质谱条件

离子源:ESI源;检测模式:负离子模式;扫描模 式:多反应监测模式（MRM mode);源温度：120 t; 脱溶剂气温度:450 t;脱溶剂气流量:800 L/h;锥 孔气流量:50 L/min。各化合物的特征离子对设定 如下:八丁卩饥/2'506.6/159.2(锥孔电压:30¥;碰撞 电压:36 V); ADP m/之 426.4/134. 1(锥孔电压:30

色谱第35卷

V;碰撞电压:36 V); AMP m/2 345. 7/79. 0(锥孔电 压：30 V;碰撞电压：30 V); cAMP m/之 328. 5/ 134. 1(锥孔电压:30 V;碰撞电压:36 V)。

种化合物检测6次的相对标准偏差分别为10. 8%、 12. 1%、7.9%和7.0%。与文献[2|,22]报道相比较，4 种待测化合物的仪器响应良好，受待测样品基质干 扰较小，标准曲线线性可满足定量要求。传统的 ATP定量方法为化学发光法，该方法难以实现

2结果与讨论

2.1 HPLC-ESI-MS/MS同时定量测定细胞线粒体呼吸链产物

本研究利用已建立的HPLC-ESI-MS/MS方法 对PC12细胞中ATP、ADP、AMP和cAMP的浓度 ATP、ADP、AMP和cAMP多种物质的同时测定，存

在检测波动大（相对标准偏差<20% )、易受多种阴 离子干扰、测试所需荧光素-荧光素酶试剂容易失 活、耗时长、操作繁琐等不足[18]。与传统定量方法

进行了测定。图 2 为 ATP( 10 pg/mL)、ADP( 10

pg/mL)、AMP( 1 pg/mL)和 cAMP( 1 pg/mL)标

准物质的典型色谱图，图3为PC12细胞提取液中 相应物质的典型色谱图。ATP、ADP、AMP和cAMP 的保留时间分别为5. 5、5. 8、6. 4和13.9 min,标准 曲线的线性回归方程分别为y = 3 223尤-6 360、y = 5 617;r-3 659、y = 29 698;r+1 865 和 y = 43 527;r,线 性相关系数r2分别为0.98、1.00、1.00和1.00。4

1 5. 5

?«/z 506.6^159.2

a

：

— '5.8

L

'

?«/z 426.4^134.1

b

scb^l

m/z 345.7^79.0

/&JSU2-图2 ATP、ADP、AMP和cAMP标准物质的提取离子色谱图

Fig. 2 Extracted ion chromatograms of ATP, ADP, AMP

and cAMP ( cyclic AMP) standard substancesa. 10 pg/mL ATP; b. 10 pg/mL ADP; c. 1 pg/mL AMP; d. 1 ag/mL cAMP； e. total.

相比，HPLC-ESI-MS/MS 方法可实现 ATP、ADP、

AMP和cAMP的同时在线检测，稳定性好,分离效 率高，检测灵敏度高，特异性好。因此，HPLC-ESI- MS/MS是研究细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化及能

量代谢过程的有力工具。

2.2 TBBPA-BHEE加速PC12线粒体呼吸链氧化磷酸化过程

为探究TBBPA-BHEE对PC12细胞线粒体呼

Fig. 3 Extracted ion chromatograms of ATP, ADP,

AMP and cAMP in PC12 cells treated with TBBPA-BHEE (25 ^mol/L，6 h)

a. ATP; b. ADP; c. AMP; d. cAMP; e. total.

第1期

刘倩，等:高效液相色谱-电喷雾-串联质谱研究四溴双酚A双(2-羟乙基醚)

诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞呼吸链氧化磷酸化和能量代谢紊乱

吸链氧化磷酸化过程的影响，本研究利用HPLC-

ESI-MS/MS 对 TBBPA-BHEE (25 |xmol/L)暴露后 PC12细胞内ATP、ADP浓度及二者之比（ADP/ ATP)的变化进行了评价。如图4a所示，对照组、1 h暴露组、3 h暴露组、6 h暴露组的PC12细胞内 ATP 浓度分别为 2. 6x 1〇-15、2. 6x 1〇-15、3. 2x 1〇-15、 3. 7x1〇-15 mol/cell。PC12 细胞内 ATP 浓度随暴露

时间的延长而上升。葡萄糖进人细胞后，先在细胞 质中通过糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸在有氧存在的 (II8/I01U(IP3/

5

T2)

/(dHv v

条件下进人线粒体基质，经过三羧酸循环和线粒体 呼吸链氧化磷酸化过程最终生成ATP和水[14]。

ATP作为线粒体呼吸链氧化磷酸化过程最重要的 产物，常被用于评价呼吸链的运转速率。PC12细胞 中ATP含量的升高暗示着TBBPA-BHEE暴露加快 了线粒体呼吸链氧化磷酸化。图4c中对照组、1 h 暴露组、3 h暴露组、6 h暴露组中PC12细胞胞内 ADP 的浓度分别为 2.3x 1〇-16、2.5x 1〇-16、2.8x 10-16、3. 0x10-16 mol/cell;相应的 ADP 与 ATP 的浓 度比值分别为 9. 1 x 1〇-2、9. 5x 1〇-2、8. 8x 1〇-2、8. 2x 10-2(见图5a)。ATP合成酶利用电子传递产生的 能量将ADP磷酸化为高能ATP，ATP中远离腺苷

的高能磷酸键又可以水解释放能量，同时生成 ADP[14]。ADP作为合成ATP的原料及ATP水解 的直接产物，其浓度及与ATP浓度的比值（ADP/

ATP)可作为评价线粒体呼吸链氧化磷酸化速率的

辅助参数。暴露于TBBPA-BHEE后，PC12细胞中 ADP的浓度上升反映了细胞ATP代谢加速。而 ADP/ATP整体上随暴露时间的延长而降低，即 ATP含量相对于ADP不断升高，进一步暗示了 ATP合成增加，即线粒体呼吸链氧化磷酸化过程的 加速进行。综上所述，TBBPA-BHEE暴露刺激了 PC12细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化。线粒体呼吸 链氧化磷酸化加速进行可能导致QH•的生成速率上 升，超氧化物自由基浓度升高，过量生成的ROS最

终导致细胞的氧化应激和凋亡。

2.3 TBBPA-BHEE干扰PC12线粒体功能导致细 胞能量代谢稳态破坏

为探究TBBPA-BHEE对PC12细胞能量代谢 过程的影响，本研究利用HPLC-ESI-MS/MS对

TBBPA-BHEE ( 25 pmol/L)暴露后 PC12 细胞内

AMP、ATP及cAMP浓度变化进行了测定。如图5b 所示，对照组、1 h暴露组、3 h暴露组、6 h暴露组中 PC12 胞内 AMP/ATP 分别为 2. 8x 10-3、3. 3x 10-3、2. 7x10-3、1. 9x10-3。AMP/ATP 总体上随暴露时间 的延长而降低。AMP激活的蛋白激酶（AMP-acti-

om

201) /

(dovv

(II8/I0m

2

10 1)/

(dpwv

(II8/I0m

210 1)/

(dl/。w)。图 4 PC12 细胞中（a)ATP、（b)ADP、（c)AMP、（d)cAMP 浓度

随 TBBPA-BHEE (25 ^mol/L)暴露时间的变化（w = 3)

Fig. 4 Time courses for (a) ATP, (b) ADP, (c) AMP

and ( d) cAMP concentrations in PC12 cells treated with TBBPA-BHEE (25 ^mol^L) (n = 3)

vated protein kinase，AMPK)是细胞能量稳态调节的关键分子，该激酶响应细胞内ATP耗竭的压力而 激活。当细胞内ATP浓度下降或AMP/ATP上升 时，AMPK将被激活[23]。活化的AMPK促进细胞

对葡萄糖的吸收，刺激脂肪酸氧化和糖酵解作用，并 抑制糖异生及糖原、脂质、蛋白质的合成[24,25]。 TBBPA-BHEE暴露导致PC12细胞内ATP浓度上 升，AMP/ATP下降，这一上游信号抑制了 AMPK的 活化，减缓了 PC12细胞对葡萄糖的吸收，抑制了糖 酵解过程，同时加速细胞内葡萄糖合成糖原。一方 面，TBBPA-BHEE促进了线粒体呼吸链氧化磷酸化 过程使得葡萄糖的消耗量增加;另一方面，TBBPA-

BHEE对AMPK的抑制降低了细胞对葡萄糖的摄

色谱

第35卷

代谢产生干扰。PC12细胞能量代谢的崩溃最终会

/.212 .2ulmlsou导致细胞凋亡。

如图6所示，暴露于TBBPA-BHEE ( 25

rolpmol/L，24h)后，PC12细胞形态改变，细胞大量

死亡。TBBPA-BHEE加速PC12细胞线粒体呼吸

链氧化磷酸化过程，线粒体功能紊乱导致胞内生成 过量ROS，细胞能量代谢平衡破坏，最终导致细胞 oo,_/2.2Um

;.2lm;u30uoo2./

2m

lU.2lmlu90uoo图 5 PC12 细胞中（a) ADP/ATP、（ b) AMP/ATP 和

(c) cAMP/ATP 的浓度比值随 TBBPA-BHEE

(25 ^rnol/L)暴露时间的变化（w = 3)

Fig. 5 Time courses for concentration ratios of

(a) ADP/ATP，（b) AMP/ATP and (c) cAMP/ATP in PC 12 cells treated with TBBPA BHEE (25 ^mol^L) (n = 3)

取，促使游离的葡萄糖合成不能被直接利用的糖原， 这将导致细胞内糖代谢平衡破坏，能量代谢稳态破

坏。此外，图4d中对照组、1 h暴露组、3 h暴露组、 6 h暴露组中PC12细胞内cAMP的浓度分别为7. 1

x1〇，、5. 4x1〇-19、4. 7x1〇-19、7. 8x1〇-19 mol/cell。 TBBPA-BHEE暴露组细胞cAMP浓度与对照组相 比呈下降趋势。除AMPK外，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信号通路也是细胞内调节能量代 谢、决定细胞命运的关键通路。PKA又被称为 cAMP依赖的蛋白激酶。cAMP由腺苷酸环化酶水 解细胞质中的ATP产生，并作为第二信使激活蛋白 激酶A[14]。在细胞质中，活化的PKA通过将特定

底物的丝、苏氨酸残基磷酸化达到促进糖原分解为 葡萄糖的效果;在细胞核中，活化的PKA通过磷酸 化特定的转录因子对cAMP的作用进行应答[14]。

TBBPA-BHEE暴露降低了 PC12细胞中cAMP的 浓度，抑制了 PKA的活性，导致糖原分解减少，游离 葡萄糖减少，能量代谢稳态破坏。综上所述，TBB- PA-BHEE干扰了 PC12线粒体正常功能并对能量

凋亡。

图6 PC12细胞经TBBPA-BHEE处理24 h后的形态学比较

Fig. 6 Morphological changes in PC 12 cells treated by

TBBPA-BHEE for 24 h

a： vehicle control ( 0.5% ( v/v ) dimethyl sulfoxide(DMSO)) ； b. 25 ^moL/L TBBPA-BHEE.

3结论

本研究基于HPLC-ESI-MS/MS的分析，发现

TBBPA-BHEE可加速PC12线粒体呼吸链氧化磷 酸化过程;TBBPA-BHEE暴露干扰PC12线粒体功

能，引起细胞能量代谢稳态破坏。以上研究结果证 明了四溴双酚A衍生物对细胞线粒体的干扰效应， 为新型溴代阻燃剂的使用和管理提供了毒理学数据 支持。在细胞生物标志物的分析方面，HPLC-ESI-

MS/MS与传统的化学发光法相比具有诸多优势，有

望成为研究细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化及能量代 谢过程的有力工具。鉴于细胞内cAMP含量较低， 在后续研究中仍需优化方法以提高该物质的检测灵 敏度。

第1期

刘倩，等:高效液相色谱-电喷雾-串联质谱研究四溴双酚A双(2-羟乙基醚)

诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞呼吸链氧化磷酸化和能量代谢紊乱

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