技术简介：
酶联接免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过所有人造催化剂，ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。
核心原理：
ELISA必须遵守以下3个核心原理：1.抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持器免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。2.抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。3.酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进行定性或定量分析。在ELISA中酶起到很关键的作用，常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示出生物放大作用。
应用方向：
ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可用于疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。按照待测物性质的不同，ELISA反应可以分为抗原检测反应及抗体检测反应。
在医学领域上，能够进行检测的抗原包括：内分泌方面的雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，血液学方面的凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等，肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），此外还有霍乱弧菌、大肠肝菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素；脑膜炎球菌及淋球菌抗原；检测免疫抑制病人中常见的白色念殊菌
抗原，检测病人或病兽的粪便中的轮状病毒；检测甲肝病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等。
而用ELISA检测抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。在病原微生物方面已用于检测链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体作诊断，也可用于对立克次氏体的种属鉴别，还有用于检测鹦鹉热衣原体抗体的报导。ELISA也可应用于以下病毒抗体检测：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检测方法。此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等。在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。
ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
ELISA检测方法的分类：
一、抗原检测反应：(抗原检测反应的检测方法中包括双抗体夹心法、竞争法)
双抗体夹心法：
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，但要注意的是在一步法（待测抗原与酶标抗体一起加入反应）测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成\"夹心复合物\"出现钩状效应，甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
双抗体夹心法的简要操作步骤为：
1）
2）
先加入抗体，使抗体固定结合于载体表面； 再加样品，使目标检测抗原形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗抗体（第二种动物抗抗原的酶标抗体）;
加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗原的量成正比。
3）
4）
图1 双抗体夹心法测抗原流程示意图
竞争法：
当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。方法的基本原理可见图2：本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，抗原和抗体吸附到固相载体表面的过程，称为包被，也可叫做致敏。经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。 竞争法的简要操作步骤：
1） 2）
先加入抗体，使抗体固定结合于载体表面；
加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗原混合物,同时做只加酶标
抗原的对照组；
3） 加入酶促反应底物，发生显色反应，对比实验组及对照组的显色
差异，计算未知抗原的量。
图2 竞争法测抗原流程示意图
二、抗体检测反应：(抗体检测反应的检测方法中包括双抗原夹心法、间接法、竞
争法、捕获包被法)
双抗原夹心法：
双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
双抗原夹心法的简要操作步骤为：
1） 2） 3） 4）
先加入抗原，使抗体固定结合于载体表面； 再加样品，使目标检测抗体形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗原;
加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正
比。
图3 双抗原夹心法测抗体流程示意图
间接法：
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法的简要操作步骤： 1） 2）
将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。
加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原——抗体复合物。
3） 4）
加酶标抗抗体。
加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正比。
图4 间接法测抗体流程示意图
竞争法：
竞争法测抗体的反应模式与竞争法测抗原类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。
竞争法的简要操作步骤：
1） 2）
先加入特异性抗原，使抗原固定结合于载体表面；
加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗体混合物，并做只加酶标
抗体的对照组； 3）
加入酶促反应底物，发生显色反应，对比实验组及对照组的显色
差异，计算未知抗体的量。
图5 竞争法测抗体流程示意图
捕获包被法：
捕获包被法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，则后者可干扰IgM的测定。因此先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
捕获法测抗体的简要操作步骤： 1）
特异性捕获抗体的包被，先把能特异性结合待测抗原的抗体固定于固相载体表面；
2）
加入待测样品，通过固定在载体表面的针对该抗原的抗体固定于载体表面；
3）
加入特异性抗原以及针对该特异性抗原的酶标抗体；
4） 加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正比。
图6 捕获包被法测抗体流程示意图
除以上7种ELISA测试方法外，近年在亲和素-生物素系统上又发展出ABS-ELISA法 ：
亲和素是一种糖蛋白，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成，生物素为小分子化合物。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与抗体或酶形成生物素标记产物，标记方法颇为简便，并且不影响抗体或酶原有的生物学活性。亲和素生物素系统，简称ABS（avidin-biotin system）。由于亲和素与生物素间的亲和力极强，结合迅速，且极其稳定，使ABS标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径，大大提高了检测的灵敏度，但该方法比普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，因此在临床检验中ABS-ELISA应用不多。ABS-ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。
在LAB法中，将特异性抗体生物素化、酶分子标记在亲和素分子上，生物素化抗体与被检抗原结合后，再借ABS的高度亲和力将酶分子联结到抗原分子上，经酶促反应即可检出抗原，因此提高检测的敏感度。
图7 ABS-ELISA法中的LAB法
ABC法同样将特异性抗体生物素化、酶分子标在生物素上，亲和素和酶标生物素需要先按一定比例形成ABC复合物，这种网络结构结合了大量的酶分子，当亲和素尚未被酶标生物素饱和时，生物素化抗体即可与之结合, 使被检抗原、生物素化抗体和酶标生物素联成一体。
图8 ABS-ELISA法中的ABC法
ELISA实验过程主要分以下三步：
第一：实验设计
1.了解将要测定的样品属于什么类别，选用最佳的ELISA检测方法； 2.选用正确的阴性对照品、阳性对照品、样品标准品等； 3.规划实验中所使用各种试剂的浓度、加入量、反应时间等；
4.再细化实验中每个步骤的开展时间，合理的时间安排能使实验有条不絮的进行。
第二：实验准备
1.实验所使用物料的清点； 2.实验试剂的配备； 3.实验仪器的预约；
第三：实验操作（以双抗体夹心法为例）
1.包被（在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体，使之与板结合） 4℃过夜（大于12小时）或37℃孵育2小时，包被后洗涤一次；
2.封闭（一般使用0.1~2%BSA、5%脱脂奶粉、1%明胶或10%小牛血清等）37℃反应2小时（封闭液体积要大于包被液体积），封闭后清洗3次； 3.加入含有待测抗原的样品，37℃孵育1小时； 4.洗涤，清洗3次；
5.加入酶标液（酶标二抗），37℃孵育1小时； 6.洗涤，清洗5次；
7.加入酶促反应底物，发生显色反应（37℃避光显色5~15min)，终止显色后测量450/630nm吸光值。
注：上面实验共12次清洗，清洗次数可适当增多，同一反应尽量保证使用同一种清洗液，常见清洗液有PBST、TBST、PBS等。 结果判定 定性测定
定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。 间接法和夹心法：
A.阳性判定值： （cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数(0.05)，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。
B.标本/阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。
当待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2时判定为阳性，N为阴性对照孔。 竞争法：
因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。 a. 阳性判定值法
阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX 阳性 A≤阳性判定值 阴性 A＞阳性判定值 b. 抑制率法
抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照 阳性 抑制率≥50%为 阴性 ＜50% 定量测定
ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。
测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
实验中使用的试剂、仪器
常用试剂：
1.包被缓冲液：0.05M PH 9.6 碳酸盐缓冲液、0.1M PH 9.6 碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL 缓冲液等。
2.封闭液：0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等（一般溶于0.15M PBS中）。
3.洗涤液：PBS、PBST、TBST等。
4.抗体稀释液：PBST、0.5~2%BSA（溶于PBST中）等。
5.底物缓冲液：TMB显色液、OPD显色液、ABTS显色液、AP显色液等，根据所使用
的酶标抗体选用对应的底物缓冲液显色。
6.终止液：2M硫酸。
常见仪器：
常见问题及解决方法：
1.阴性对照出现阳性结果
造成该现象的原因有4个：1）试剂或样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒出现交叉污染。——应当更换使用试剂，小心操作；2）酶标板洗板不彻。——尝试用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤，洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净；3）抗体量过多导致非特异结合。——应该根据推荐用量使用抗体，尽量使用较少的抗体；4）夹心法、捕获法中检测抗体与包被抗体/抗原反应。——确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体，两者之间不会互相反应。 2.酶标板整体背景高
造成该现象的原因有4个：1）抗体非特异性结合。——应确保进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液，最好使用5%~10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清，确保板孔经过预处理以防止非特异结合，使用亲和力强、纯度高的抗体，最好经过了预吸收处理；2）底物结合浓度过高或反应时间过长。——应调整底物的浓度，当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应；3）底物溶液不新鲜或被污染。——应检测底物溶液，正常的底物溶液应该是清亮透明的，如果变黄或其他颜色则是被污染的标志；4）底物孵育过程没有避光。——底物孵育应该在避光环境下进行。 3.吸光度数值偏高或偏低
造成的该现象的原因有几个：1）样品中待检抗原含量太低会导致测试结果偏低。——可尝试增加样品的使用量或者更换一个检测更灵敏的方法；2）加入抗体量不合适也会造成结果偏低或偏高——应确定使用的是建议抗体用量，或者为了使结果更好尽可能调整抗体的最适用量；3）孵育时间不够长会导致检测结果偏低。——应适当延长抗体或抗原的孵育时间，确保待测样品与检测抗体能充分结合；4）孵育温度不适合。——应保证抗体在最适宜并且稳定的温度下孵育，一般是室温（25度）。
影响因素的分析：
1.标本的影响
1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 ，可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。所以严重溶血标本禁用。
1.2 标本受细菌污染 ：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
1.3 标本保存不当 ：在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
1.4 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。
1.5 标本凝固不全 ：在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。 2.试剂影响
ELISA检测试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此，选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之。 3.操作技术的影响
3.1 吸量的准确性 :吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗，定期校准。
3.2 温浴影响 :抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。
3.3 加样次序影响 :有时我们在加样过程中，常常会遇到个别标本未离心等情况，为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后等标本分离好后再加标本，这样，竟常常会造成HBeAb和HBcAb的假阴性。因为HBeAb和HBcAb都是竞争抑制法，先加入酶标记的抗体，首先与固相载体上的抗原结合，待加入显色剂后，因酶的存在而显色，故呈阴性。
3.4 洗涤方法对结果的影响 :洗涤是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或
洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔处于阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，洗板机不用时应用去离子水清洗几遍。 4.干扰物质的影响
4.1有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、、交叉反应物质和其他物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。
综上所述，对临床检验ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果，要从多方面进行分析除试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。
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