动物医学进展，２０１４，３６（３）：５－８ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 禽流感病毒Ｈ ５、Ｈ ７和Ｈ ９亚型一步法 多重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立 屈素洁，莫胜兰，邹联斌，胡 杰，张步娴，梁 媛，粟艳琼，施开创，李 军 （广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁５３０００１） 摘 要：为了建立能同时检测Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亚型禽流感病毒（ＡＩＶ）的方法，参考ＧｅｎＢａｎｋ中Ｈ５、Ｈ７ 和Ｈ９亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列的保守区域，利用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件设计３对分别针对ＡＩＶ Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９ 亚型的特异性引物，预期特异扩增Ｈ５ ＡＩＶ片段大小为３８０ ｂｐ、Ｈ７ ＡＩＶ为５０１ ｂｐ、Ｈ９ ＡＩＶ为７３２ ｂｐ。经 过反应条件的优化，建立了同时检测Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亚型ＡＩＶ的一步法多重ＲＴ—ＰＣＲ方法。该方法特异性 强，对其他亚型ＡＩＶ和禽呼吸道病原体检测结果为阴性；敏感性高，Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亚型ＡＩＶ ＲＮＡ的最低 检出量分别为１Ｏ＿。、１０＿。、１０ 拷贝／ Ｌ。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亚型禽流 感病毒的分子生物学诊断方法。 关键词：禽流感病毒；Ｈ５亚型；Ｈ７亚型；Ｈ９亚型；一步法多重ＲＴ—ＰＣＲ 中图分类号：￥８５２．６５９．５；￥８５４．４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１５）０３—０００５—０４ 禽流感（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＡＩ）是由正黏病毒科 ，（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）Ａ型流感病毒属中不同亚型病 收稿日期：２０１４—０２—１９ 基金项目：广西区水产畜牧兽医局科技项目（桂渔牧科１２０４９３６） 作者简介：屈素洁（１９８２一），女，广西南宁人，硕士，主要从事畜禽传染病学及分子病毒学研究。 ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，４２（５）：２０５４—２０６４． ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｖａｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，１６ （１１）：１６６５－１６７４． ［１０３ Ａｍｒｏｕｃｈｅ Ｔ，Ｂｏｕｔｉｎ Ｙ，Ｍｏｒｏｎｉ Ｏ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ—ｂｉｆｉｄ０ｂａｃｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｏ－ｃｕｈｕｒｅ ［１２］Ｒｅｙｎａ—Ｂｅｌｌｏ Ａ，Ｃｌｏｅｃｋａｅｒｔ Ａ，Ｖｉｚｃａｉｎｏ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈ，２００６，６５（１）：１５９—１７０． ［１１］ Ｎｅｉｍａｎ Ｍ，Ｈａｍｓｔｅｎ Ｃ，Ｓｃｈｗｅｎｋ Ｊ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｅｏｉｄｅｓ ｓｕｂ— ｓｐ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｍａｌｌ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｅｎｚｙｍｅ— ｍａｊｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ５ ｆｏｒ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ａｎａ— ｐｌａｓｍｏｓｉｓ ｉｎ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，５ （２）：２５９—２６２． Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＳｄｒＤ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏｆ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ￥ Ｄｕ Ｘｉｎ—ｊｕｎ，ｗＡＮＧ Ｘｕｅ—ｌｉａｎ，ＬＩ Ｐｉｎｇ，ＧＥＮＧ Ｊｉｅ—ｊｉｅ，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｊｕａｎ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕｏ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ，３００４５７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＳｄｒＤ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙ— ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｒａｉｎ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ａ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ２ ０４３ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ＯＲＦ ｗａｓ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ２６ｂ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＰＴＧ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ９ ９ ｋｕ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｉｚｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａ１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＥＬＩＳＡ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｒｅａｃｈｅｄ １：２３ ０００．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｌａｙｓ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓ ｎ Ｚ０ｃ０ｆｃ ｓ ａｕｒｅｕｓ；ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳｄｒＤ ｇｅｎｅ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ６ 动物医学进展２０１４年第３６卷第３期（总第２６１期） 毒引起的禽类感染和疾病的总称。禽流感病毒 （ＡＩＶ）为单股负链ＲＮＡ病毒，基因组有８个独立 的ＲＮＡ节段组成，根据其表面血凝素（ＨＡ）和神经 氨酸酶（ＮＡ）的抗原性差异，可分为ｌ６个ＨＡ亚型 和９个ＮＡ亚型ｌ＿１ ］，ＡＩＶ抗原变异性强，宿主范围 广泛，且亚型之间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴 发。高致病性禽流感主要是由Ｈ５或Ｈ７亚型ＡＩＶ 引起的，潜伏期极短，突然暴发，多不见任何临床症 状而突然死亡，发病率和病死率高达１００ ［３］，另外 还可感染人，甚至导致死亡［４－５］。目前，我国部分地 区以Ｈ９亚型为主的中低致病性禽流感的流行，给 养禽业造成很大的经济损失，已引起国内各界学者 的广泛关注 ］。早期快速检测无疑是预防、控制禽 流感的关键。 禽流感的诊断，包括病原的分离鉴定、琼脂扩 散试验、血凝和血凝抑制试验、免疫荧光法和 ＥＬＩｓＡ等常规方法发挥了重要作用，但这些方法 操作比较繁琐，费时、费力。聚合酶链反应（ＰＣＲ）方 法不仅特异、敏感，而且简易、快速。多重ＰＣＲ是一 种特殊ＰＣＲ形式，其最突出特点是可同时检测、鉴 别出多种病原体 ］，极大地缩短禽流感病毒的检出 时间，为ＡＩＶ早期快速诊断提供了敏感、快速、实用 的方法。本试验采用了多重ＲＴ－ＰＣＲ技术，建立了 能同时检测Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亚型ＡＩＶ的一步法多重 ＲＴ—ＰＣＲ方法。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１毒株和质粒 禽流感病毒（ＡＩＶ—Ｈ１毒株、 ＡＩＶ—Ｈ３毒株、ＡＩＶ—Ｈ５毒株、ＡＩＶ—Ｈ６毒株、ＡＩＶ— Ｈ９毒株）、鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性支气管 炎病毒（ＩＢＶ）、传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）、鸡毒 支原体（ＭＧ）及鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）均 由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心保存； ＡＩＶ—Ｈ７亚型质粒由哈尔滨兽医研究所提供。 １．１．２试剂 ＲＮＡ提取试剂盒、ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒、 胶回收试剂盒、ｐＭＤ１８一Ｔ载体，宝生物工程（大连） 有限公司产品；ＤＨ５ａ感受态细胞，Ｔｉａｎｇｅｎ公司产 品；其他试剂均为国产分析纯。 １．２ 方法 １．２．１ 引物设计 参照ＧｅｎＢａｎｋ中公布的Ｈ５、 Ｈ７和Ｈ９亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列，通过 ＭｅｇＡｌｉｇｅｎ软件进行比对，应用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件设 计３对引物（表１），引物由宝生物工程（大连）有限 公司合成。 １．２．２病毒ＲＮＡ的提取参照ＲＮＡ提取试剂盒 操作说明书进行。 表１多重ＲＴ—ＰＣＲ引物 Ｔａｂｌｅ １ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ 引物 引物序列 产物大￣，／ｂｐ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ １ｅｎｇｔｈ Ｈ５—３８０Ｕ ５ ＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧ ３ ３８Ｏ Ｈ５—３８０Ｌ ５ 一ＡＡＣＴＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＡＴ一３ Ｈ７ ５０１Ｕ ５ ＡＡＴＧＣＡＣＡＲＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴ一３ ５０１ Ｈ７—５０１Ｌ ５｜＿ＴＧＡＹＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡ一３ Ｈ９—７３２Ｕ ５ｌ＿ＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴ一３ ７３２ Ｈ９—７３２Ｌ ５ 一ＴＣＣＣＧＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＴＡＣＣＡ一３ １．２．３ 一步法多重ＲＴ—ＰＣＲ反应 参照一步法 ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒操作说明，ＲＴ—ＰＣＲ反应体系，即 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２“Ｌ，２×ｓｔｅｐ ｂｕｆｆ ｅｒ ２５ ｇＬ，上、下游引物各１ Ｌ（１０／￣ｍｏｌ／Ｌ），ＲＮＡ 模板１０ Ｌ，加ｄｄＨ Ｏ至５０ Ｌ。反应条件，即５０ ℃３０ ｍｉｎ；９５。Ｃ ２ ｍｉｎ；９４℃４５ Ｓ，５５。Ｃ ４５ Ｓ，７２ ℃１ ｍｉｎ，共３５个循环。反应结束后取产物５ Ｌ ～１０ Ｌ用１２ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增 结果。 １．２．４ ＰＣＲ产物测序 用胶回收试剂盒，从琼脂 糖凝胶中回收ＰＣＲ产物，将回收产物与ｐＭＤ１８一Ｔ 载体连接，转化ＤＨ ５ａ感受态细胞后，送宝生物工 程（大连）有限公司进行序列测定。 １．２．５ 特异性试验 用上述方法对禽流感病毒 （ＡＩＶ—Ｈ１毒株、ＡＩＶ—Ｈ３毒株、ＡＩＶ—Ｈ６毒株）、鸡新 城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、传 染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）、鸡毒支原体（ＭＧ）及鸡 传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的病毒材料进行进行 特异性检测试验。 １．２．６ 敏感性测定 将Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９亚型ＡＩＶ 的ＲＮＡ做１Ｏ倍系列稀释后进行多重ＲＴ—ＰＣＲ，测 定该一步法多重ＲＴ—ＰＣＲ对ＲＮＡ的最低检测量。 ２ 结果 ２．１ ＲＴ—ＰＣＲ扩增结果 禽流感病毒Ｈ５、Ｈ７和Ｈ９型扩增后获得的片 段与预期大小完全一致，分别为３８０、５０１、７３２ ｂｐ （图１）。 ２．２ 测序鉴定 分别将测得的Ｈ５亚型序列同ＧｅｎＢａｎｋ登录 号为ＨＭ１７２４５５、ＪＸ５３４５４９等５株，Ｈ７亚型序列同 ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＪ４１５８２５、ＫＦ４２０２９６等５株， Ｈ９亚型序列同ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＤＱｏ６４３６６、 ＤＱＯ６４３６６等５株亚型序列同源性比较，结果都大 于８Ｏ ，证明ＰＣＲ所扩出的片段分别为Ｈ５、Ｈ７ 和Ｈ９亚型的特异性片段。 ８ 动物医学进展２０１４年第３６卷第３期（总第２６１期） 捷，谢芝勋，彭 宜，等．Ｈ１和Ｈ３亚型禽流感病毒二重 参考文献： ［１］甘孟侯．禽流感［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００２：１２—１０． ［８］郭ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］．动物医学进展，２０１２，３３（１２）：３１—３４． ［２］ Ｆｏｕｅｈｉｅｒ Ｒ Ａ，Ｍｕｎｓｔｅｒ Ｖ，Ｗａｌｌｅｎｓｔｅｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃ— ｔｅｒｉｅａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｓｕｂｔｙｐｅ ［９］Ｔａｎｇａ Ｑ Ｄ，Ｗａｎｇ Ｊ Ｌ，Ｂａｏａ Ｊ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉ０ｎ ｏｆ ａｖｉａｎ Ｈ３ Ｈ５ ａｎｄ Ｈ９ （Ｈ１６）ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｌａｃｋ－ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌｓ［ＪＪ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００５，７９： ２８１４－２８２２． ｓｕｂｔｙｐｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ，２０１２，１８１（２）：１６４—１６９． ［３］付朝阳，邢大昌，唐秀英，等．高致病力禽流感的流行与防制 研究进展口］．中国预防兽医学报，２００１，２３（５）；３９３—３９５． Ｅ４］Ｈｉｅｎ Ｔ Ｔ，Ｌｉｅｍ Ｎ Ｔ，Ｄｕｎｇ Ｎ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ５ＮＩ）ｉｎ １０ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｖｉｅｔｎａｍ￣Ｊ］．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００４， ３５０：ｌｌ７９—１ｌ８８． ［１Ｏ］Ｚａｍｂｏｎ Ｍ，Ｈａｙｓ Ｊ，Ｗｅｂｓｔｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｏ ｃｏｎ ｆｉｒｍｅｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，２００１，１６１（１７）：２１Ｉ６－２１２２． ［¨］Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ Ｄ Ａ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ［５］卢体康，秦智锋，陈兵。等．Ｈ７亚型禽流感病毒实时荧光定 ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９。２５８：１—２ｏ． ［１２］Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ Ｔ，Ｋｗｏｎ Ｈ Ｊ，Ｋｉｍ Ｈ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｏｎ— 量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］．动物医学进展，２０１２，３３（３）： ９－１３． ［６３ 包红梅，王秀荣．Ｈ９亚型禽流感病毒ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建 ｅｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ， ２０１３，１８８（１－２）：４１—４６． 立［Ｊ］．中国兽医科学，２０１０，４０（４）：３８４—３８９． ［７］Ｅｌｆａｔｈｍ Ｅ，Ａｈｍｅｄ Ｍ Ａ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ： ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖｉｒｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｍｉ— ｅｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２０００，１３：５５９—５７Ｏ． ［１３］Ｃｈａｈａｒａｅｉｎ Ｂ，Ｏｍａｒ Ａ Ｒ，Ａｉｎｉ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ５ Ｈ７ ａｎｄ Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅ— ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１． Ｒａｓ，２００９，１６４（２）：１７４—１７９． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ－ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｈ５ Ｈ７ ａｎｄ Ｈ９ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｑｕ Ｓｕ—ｊｉｅ，ＭＯ Ｓｈｅｎｇ—ｌａｎ，ＺＯＵ Ｌｉａｎ—ｂｉｎ，ＨＵ Ｊｉｅ，ＺＨＡＮＧ Ｂｕ—ｘｉａｎ， ＬＩＡＮＧ Ｙｕａｎ，ＳＵ Ｙａｎｇ－ｑｉｏｎｇ，ＳＨＩ Ｋａｉ—ｃｈｕａｎｇ，ＬＩ Ｊｕｎ （Ｇｕａｎｇｘｉ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎａｎｎｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｘｉ，５３００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒａｐｉｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ５，Ｈ７，Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅ ＡＩＶ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｒｉｍｅｒ ５．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ５。Ｈ７，Ｈ９ ｓｕｂ— ｔｙｐｅ ＡＩＶ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｏｎｅ ｓｔｅｐ—ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆ— ｉｃ ｂａｎｄｓ ｏｆ ３８０ ｂｐ，５０１ ｂｐ ａｎｄ ７３２ ｂｐ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈ５。Ｈ７ ａｎｄ Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅ ＡＩＶ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｏｎｅ ｓｔｅｐ—ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ５，Ｈ７，Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅ ＡＩＶ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ １０一 ｃｏｐｉｅｓ／￣Ｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｈ５．１０一 ｃｏｐｉｅｓ／／ｚＬ ＲＮＡ ｏｆ Ｈ７ ａｎｄ １０ ｃｏｐｉｅｓ／￣Ｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｈ ９ ｓｕｂｔｙｐｅ ＡＩＶ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｃｒｏｓｓ—ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｆｔｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａ— ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｈ５，Ｈ７ ａｎｄ Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ａ— ｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｒａｐｉｄｌｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；Ｈ５ ｓｕｂｔｙｐｅ；Ｈ７ ｓｕｂｔｙｐｅ；Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅ；ｏｎｅ ｓｔｅｐ－ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ—ＰＣＲ