动物医学进展。２０１４，３５（１）：３６—４０ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 重组Ｔ７噬菌体生物学特性的研究 王义伟，徐 海，陈 瑾，郑其升，侯继波 （江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京２１００１４） 摘 要：以大肠埃希茵ＢＬ２１为宿主菌研究重组Ｔ７噬茵体生物学特性。将构建好的重组Ｔ７噬菌体扩 增纯化，分析其对ｐＨ、温度及离子浓度的敏感性，并将重组噬菌体与宿主菌以不同比例混合测定最佳感染 复数并绘制其一步生长曲线。结果表明，重组Ｔ７噬菌体的热稳定性较弱，在６０。Ｃ时２０ ｍｉｎ效价明显下降， 在７０℃时５ ｍｉｎ内即会全部失活；ｐＨ ４～ｌ１的范围内重组Ｔ７噬菌体均可稳定存在；培养基中Ｍｇ抖浓度为 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ及Ｃａ 浓度为５ ｍｍｏｌ／Ｌ时最有利于噬斑的形成，出斑率提高了约２０ ；重组噬菌体感染其宿 主大肠埃希茵的最佳感染复数为１０一；其一步生长曲线的潜伏期约３０ ｒａｉｎ，裂解期约１５０ ｒａｉｎ，裂解量为 １２６ ｐｆｕ／ｃｅｌｌ。构建的重组Ｔ７噬茵体具有较强的裂解能力，潜伏期短，裂解量大，对理化因素稳定性好，为进 一步大规模、高效率制造口蹄疫表位疫苗提供了理论基础。 关键词：重组Ｔ７噬菌体；疫苗；生物学特性 中图分类号：Ｒ３８３．２４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１４）Ｏ１—００３６—０５ 噬菌体多年来一直是生命科学中的研究热点。 主要是噬菌体易于培养，基因组小，易于基因操作， 故人们常常以噬菌体作为研究对象来阐明一些生命 现象的基本问题。但是，从现有发表文献资料来看， Ｔ７噬菌体大规模制备相关的研究较少，少量文献集 中于野生型Ｔ噬菌体的生物学特性研究，重组Ｔ７ 噬菌体生物学特性尚未见报道。 本文所用重组噬菌体展示的是猪Ｏ型口蹄疫 病毒中和表位，命名为Ｔ７一ＶＰ１ 。。。为了大规模、 式自动电热压力蒸汽高压锅为ＨＩＲＡＹＡＭＡ公司 产品；隔水式电热恒温培养箱为上海跃进医疗器械 厂产品。 １．２ 方法 １．２．１ 噬菌体的ｐＨ稳定性 噬菌体效价指噬菌 体的浓度，即每毫升样品含噬菌体的个数。通常是 在含敏感菌的平板上形成噬斑进行噬菌体的计数， 以每毫升中含有的噬斑形成单位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕ— ｎｉｔ／ｍＬ或ｐｆｕ／ｍＬ）表示其效价。噬菌体的效价在 一高效率制造口蹄疫表位重组噬菌体疫苗，研究该重 组噬菌体的基本生物学特性是一项基础性研究工 作。本文对重组菌噬菌体的生物学特性研究，包括 热稳定性、ｐＨ稳定性、最佳感染复数和一步生长曲 定程度上反映了噬菌体的存活率，效价与存活率 参照余茂效等『】 方法进行，处理介质为１０ ｇ／Ｌ 蛋白胨溶液，用ＮａＯＨ或ＨＣ１调节溶液的ｐＨ，ｐＨ 由ｐＨ电极测定。将ｐＨ分别为３、４、５、６、７、８、９、 １０、１１、１２的蛋白胨溶液４．５ ｍＬ加入到内径一致的 成正比。 线等。 １材料与方法 １．１ 材料 试管内，置于温度为３７℃的水浴中，待温度完全平 衡后加入０．５ ｍＬ噬菌体悬液，起始效价为５．０× １０。ｐｆｕ／ｍＬ，经２ ｈ处理后用ｄｄＨ２Ｏ做连续１０倍稀 １．１．１ 噬茵体与宿主 重组噬菌体Ｔ７一ＶＰ１ ２。 。 由国家兽用生物制品工程技术研究中心实验室构建 保存；宿主细菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１为Ｎｏｖａｇｅｎ公司产品。 １．１．２主要生化试剂 酵母提取物、蛋白胨为ＯＸ— 释，分别取１０ Ｌ加入到１９０ Ｌ宿主菌ＢＬ２１中，双 层琼脂平板法测定噬菌体的效价。每个ｐＨ做３个 重复。噬菌体效价（ｐｆｕ／ｍＬ）一稀释倍数×噬斑数 ×１００。 ＯＩＤ公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯。 １．１．３ 主要仪器设备 ＴＤＺ５一ＷＳ水平离心机； １．２．２ 噬茵体的热稳性试验 参照文献［２—３］的方 ＡＩＲＴＥＣＨ超净工作台；ＨＩＣＬＡＶＥＴＭ ＨＶＥ一５Ｏ座 收稿日期：２０１３—０８—０６ 法，准备５只装有４．５ ｍＬ １０ ｇ／Ｌ蛋白胨溶液 基金项目：江苏省农业自主创新基金项目Ｅｃｘ（１Ｏ）２１６］ 作者简介：王义伟（１９８７一），男，山东德州人，硕士，主要从事预防兽医学研究。＊通讯作者 王义伟等：重组Ｔ７噬菌体生物学特性的研究 ３７ （ｐＨ ７．Ｏ）的试管放人不同温度的恒温水浴（４Ｏ、５０、 菌体悬液，起始效价为４．２×１０ ｐｆｕ／ｍＬ，在５、１０、 １５、２０ ｍｉｎ取样，冷却至相同温度后，用ｄｄＨ Ｏ适当 倍比稀释后，按双层琼脂平板法计数噬菌体，观察噬 箱中吸附５ ｍｉｎ后１０ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心３０ Ｓ，弃去上 ６ ５ ４ ３ ６０、７０、８Ｏ℃）中，待温度平衡后，分别加入０．５ ｍＬ噬 清；用新鲜的ＬＢ培养基洗涤２次，然后重悬沉淀于 ＋ ＋ ＋ ＋ Ｏ Ｏ ０ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ ０ Ｏ Ｅ Ｅ Ｅ Ｅ １０ ｍＬ ＬＢ培养基中并充分混匀，迅速置于３７℃摇 ８ ８ ８ ８ 床中１６０ ｒ／ｍｉｎ培养，同时开始计时，在０ ｍｉｎ及每 隔１５ ｍｉｎ取样５Ｏ Ｌ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ Ｓ，吸取 菌体效价的变化，试验重复３次。 １．２．３ 噬菌体最佳感染复数的测定 感染复数 （ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｍ０Ｉ）是指初始感染时加 上清用ｄｄＨ Ｏ作倍比稀释后双层琼脂平板法测定 噬菌体效价。每个取样点做２个重复，取平均值，同 时设立单独培养噬菌体和单独培养宿主菌组做空白 对照。试验重复３次。最后以感染时间为横坐标， 噬菌体效价为纵坐标，绘制噬菌体的病毒特征性增 殖曲线，即为一步生长曲线，并计算出噬菌体的潜伏 期、裂解期和裂解量。 入噬菌体的数量与宿主菌数量的比值，也称感染倍 数ｌ＿４］。参照文献［５—６］的方法，取２ ｍＬ ＢＬ２１菌液接 种于２００ ｍＬ Ｓ０Ｂ培养基中，３７℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床 培养４ ｈ，此时细菌数约为１×１０ ｃｆｕ／ｍＬ，按照感染 复数分别为１０～、１Ｏ一、１Ｏ一、１Ｏ一、１０＿“、１Ｏ＿ 、 １０＿。、１Ｏ～、１Ｏ。和ｌ０ 的比例加人噬菌体，混匀， ３７℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４ ｈ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，取上清测定噬菌体效价。每一比值做２个重 复，结果取平均值，同时设空白对照，产生最高噬菌 体效价的样品对应的ＭＯＩ为最佳感染复数。 １．２．４ Ｍｇ抖、Ｃａ 对噬茵体效价的影响 参考文 ２ 结果 ２．１重组噬菌体的ｐＨ稳定性 所有样品起始效价均为５．０×１０。ｐｆｕ／ｍＬ，经 ３７℃水浴２ ｈ后取样测定效价，观察噬菌体效价的 变化。其中，ｐＨ为６的试管中，测得的噬菌体效价 为５．５×１０。ｐｆｕ／ｍＬ，在所有样品中最高；ｐＨ为３ 和１２的试管中，测得的噬菌体效价为０；其他ｐＨ的 献［７—８］，在底层琼脂和顶层琼脂中加入Ｍｇ抖，使终 浓度分别为５、１０、１５、２０、２５、３０、４０ ｍｍｏｌ／Ｌ，稀释噬 试管中噬菌体的效价与起始效价相比，没有明显的 变化，始终维持在同一数量级上。 结果表明，重组Ｔ７噬菌体在ｐＨ ４～ｐＨ １１时 噬菌体比较稳定，说明噬菌体对ｐＨ的适应范围比 较广泛。ｐＨ小于４或大于１１时，噬菌体的数目迅 速下降；该噬菌体在ｐＨ ６左右时最稳定，存活率最 菌体悬液到１０。ｐｆｕ／ｍＬ，然后取０．１ ｍＬ加入 ０．２ ｍＬ宿主菌中，双层琼脂平板法测定出斑情况。 同时设不加Ｍｇ。 的空白对照。Ｃａ 方法同上。试 验重复３次。 １．２．５ 噬茵体一步生长试验参照文献［９］，在宿 高。所以其最适ｐＨ为６。ｐＨ对该噬菌体的影响 见 图１。 主菌液中加入ＭＯＩ一１０的噬菌体悬液，３７℃恒温 詈董 ｊ鼻｝皇 捆 镡 ３ ４ ｐＨ 图１噬菌体的ｐＨ稳定性 Ｆｉｇ．１ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｐＨ ２．２重组噬菌体的热稳性试验 ２．３ 重组噬菌体的最佳感染复数 噬菌体经不同温度处理不同时间后，其效价不 重组噬菌体Ｔ７一ＶＰ１ 。¨ 。最佳感染复数结果如 图３所示。感染复数为１０时，噬菌体感染宿主菌 后产生子代噬菌体的效价最低，随着感染复数的降 低，噬菌体的效价越来越高，当感染复数为０．０００ ０１ 时，噬菌体的效价达到９．３×１０¨ｐｆｕ／ｍＬ，在１０个 同。温度越高，处理时间越长，噬菌体效价越低。在 ４０℃和５０℃时噬菌体的活性相对稳定；在６Ｏ℃ 时，随着处理时间的延长，噬菌体的效价下降很多； 在７０℃和８Ｏ℃时，５ ｍｉｎ内噬菌体即全部失活。 因此，重组Ｔ７噬菌体对高温敏感，抗热能力较弱。 温度对该噬菌体的影响见图２。 感染复数中效价最高，因此可以确定噬菌体的最佳 ＭＯＩ为０．０００ ０１。 ３８ 动物医学进展２０１４年第３５卷第１期（总第２４７期） ５．ｏ０Ｅ＋ｌＯ －◆＿４０℃＋５０℃＋６Ｏ℃＊７０℃ ８０℃ ８ 。 盖骞 暑 ３．００Ｅ＋１０ 柏 加 ∞ ∞∞ …霎ｌ＿００Ｅ＋１０ Ｏ ｌＯ ｌ５ ２Ｏ 时间／ｍｉｎ Ｔｉｍｅ 图２ 噬菌体热稳定性的测定结果 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｈａｇｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｉｌｉｔｙ １．ＯｌＥ＋１２ ｆ、 茎 誊 １．０Ｅ＋０１ １．０Ｅ＋００ １．０Ｅ－０１ １．０Ｅ一０２ １．０Ｅ－０３ １．ＯＥ－０４ １．０Ｅ－０５ １．０Ｅ－０６ １．０Ｅ－０７ １．０Ｅ－０８ 感染复数 Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ） 图３ 噬菌体最佳感染复数的测定 Ｆｉｇ．３ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅ ２．４ Ｍｇ抖、Ｃａ。 对噬菌体效价的影响 将不同浓度的Ｍｇ抖、Ｃａ抖加入培养基中，对噬 菌体的存活率均产生较大影响，效价影响率以加入 离子浓度为０ ｍｍｏｌ／Ｌ时记作１００ ，随着离子浓度 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ及Ｃａ。 浓度为５ ｍｍｏｌ／Ｌ时噬菌体效价 最高，随着离子浓度的进一步升高，噬菌体的效价出 现了明显的下降。总的来说，钙镁离子的添加对于 噬斑的形成还是有一定的促进作用，结果如图４所 的增加，噬菌体的效价逐步增大，在Ｍｇ 浓度为 示。 撰 魍 智 离子浓］￣／ｍｍｏｌ／Ｌ Ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎ缸ａｔｉＯｎ 图４ 离子浓度与噬菌体产斑的关系 Ｆｉｇ．４ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ２．５重组噬菌体的一步生长试验 离心洗涤的过程中除去掉，因此可以认为最终得到 的宿主菌初始浓度即为３．８×１０ ｃｆｕ／ｍＬ。不同时 在总量为１．９×１０ ｃｆｕ的宿主菌中按照ＭＯＩ 一１０加入噬菌体，３７℃温育１５ ｍｉｎ后离心、洗涤。 用５ ｍＬ ＬＢ培养基重悬沉淀，则培养基中宿主菌 ＢＬ２１的初始浓度为３．８×１０。ｃｆｕ／ｍＬ，在此过程 间段连续取样测定噬菌体效价，得到其一步生长曲 线，如图可知，重组噬菌体Ｔ７一ＶＰ１ ¨ 。感染宿主菌 的潜伏时间约为３０ ｍｉｎ，暴发时间约为１５０ ｍｉｎ，结 合裂解量计算公式：裂解量一裂解末期噬菌体效价／ 感染初期宿主菌浓度，计算得出其裂解量为 中，由于接种的感染复数很高，所有的宿主菌都会被 噬菌体所吸附感染，而那些未吸附的噬菌体则会在 王义伟等：重组Ｔ７噬菌体生物学特性的研究 ３９ １２６ ｐｆｕ／ｃｅｌｌ（图５）。 １．０ＯＥ＋１２ ‘昌 １．ＯＯＥ＋１０ 囊 １．ＯＯＥ＋Ｏ９ 嚣 １．ＯＯＥ＋Ｏ８ ０ ３０ ６０ ９０ １２０ １５０ １８０ ２１０ 町ｌ甘Ｊ／ｒａｉｎＴｉｍｅ 图５ 噬菌体一步生长试验 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｏｎｅ—ｓｔｅｐ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ Ｏｆ ｐｈａｇｅ Ｔ７一ＶＰ１ １２ｏ一１６ｏ ３ 讨论 Ｔ７噬菌体是感染大肠埃希菌的小型烈性噬菌 体，直接分泌到培养液中。具有操作简便、复制周期 短、容易培养、生长迅速、系统稳定等优点ｍ］。利用 其Ｃａ抖，可提高噬菌体对宿主菌的吸附能力ｍ ，有 稳定噬菌体一宿主菌系统的作用；Ｍｇ抖对噬菌体的 活性也有较大的影响，适量加入培养基可以提高噬 菌体的效价，并能使噬斑更易产生。本试验结果表 噬菌体展示技术将猪Ｏ型口蹄疫病毒中和表位展 示在噬菌体头部，构建重组噬菌体Ｔ７一ＶＰ１ ¨ 。，已 明Ｍｇ抖、Ｃａ。 的加入，可使噬菌体效价提高２Ｏ％ｏ２Ｅ 右，这与报道的结果是一致的，但是过高的离子浓度 经证明其具有良好的免疫学活性，因此，研究该重组 噬菌体的生物学特性，可以为大规模制备该噬菌体 提供理论依据。 温度和ｐＨ能够显著影响重组噬菌体Ｔ７一 ＶＰ１ 。。 。的稳定性，在温度低于７０℃时，其具有较 反而会抑制噬斑的形成，其原因一方面可能与噬菌 体的种类不同有关，另一方面，离子浓度过高时可能 影响了其宿主菌ＢＬ２１的生长，间接导致了效价的 降低。 噬菌体为非细胞型微生物，其增殖方式表现为 强的耐受性，温度高于７０℃时，５ ｍｉｎ内噬菌体即 全部失活，受高温因素影响明显；该重组噬菌体最适 “一步生长”的特点。对于噬菌体来说，一步生长曲 线是极具代表性的特征，每种噬菌体都有其独特的 ｐＨ为６，ｐＨ适应范围为ｐＨ ４～ｐＨ １１，对一定范围 内的酸碱处理具有一定的耐受性，这些特点有利于 噬菌体疫苗的加工和生产，其不会因为温度或其他 理化因素的变化而失活…］。 感染复数是衡量病毒投入与产出之间量效关系 的一个重要生物学指标。以不同的感染复数接种相 同数量的宿主菌，所得到的子代噬菌体的最终产量 一步生长曲线，不同的噬菌体所表现出来的一步曲 线是有很大区别的。有人总结有尾噬菌体的潜伏期 从１１ ｍｉｎ到４０ ｈ，裂解量范围从２个～２ ０００个不 等 。测定的噬菌体一步生长曲线，可以实现在最 短的生产周期内达到最大化的收益，对于提高工业 生产效率具有重要意义。本试验测得Ｔ７一ＶＰ１ ｚ ｓ。 的潜伏时间约为３Ｏ ｍｉｎ，裂解量为１２６ ｐｆｕ／ｃｅｎ，表 会有所不同，其中存在一个最佳感染复数。不同噬 菌体的最佳感染复数不同，在一些研究诸如基因组 的提取，目的蛋白的浓缩纯化，以及噬菌体呈现技术 等等，需要制备大量的噬菌体，此删４定最佳感染 明该重组噬菌体的裂解能力是非常强的，有利于噬 菌体的规模制备。 参考文献： 口 ［２］Ｓｈｉｇｅｎ。ｂ Ｍ，徐星等’多粘芽孢杆菌噬菌体的分离及特性的 ￣，１９７４，１４（２）＝２１６－２２３．复数对于经济高效的制备研究所需的噬菌体具有重 要的指导意义。本试验测得的噬菌体的最佳感染复 数为０．０００ ０１，崔尹赡 等分离的一株假单胞菌属低温噬菌体最佳感染复数为０．１，Ｏｎａｎｏｎｇ Ｐ等 ］ 等测得食窦魏斯氏菌噬菌体感染宿主菌的最佳感染 复数为０．Ｏｌ’与之柑比较，可知重组噬菌体Ｔ７＿ Ｙａｓｕｄａ Ｍ，Ｎｉ ｈｉｋ ｈ，。ｔ。ｌ＿Ｅｘｐｅｒｉ ｅｎｔ ｌ ｐｒ０ｔｅｃｔｉ。 。ｆ ｉ 。 ｇ ｉｎｓｔ ｌｅｔｈ ｌ Ｓｔ。ｐｈ ｌ。 …。… ｉ ｆ。 一 ｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＭＲｌｌＥＪ］．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００３，１８７ ‘ ）：６１３－６２４． ［ 伟’韩剑一 ’等’ 冲热海一株栖热菌裂解性噬菌 ２０１０５０（３）．．３２２－３２７．＿４］体的分离及其特征口１，，ＷａｎｇＰ Ｗ，ｕ Ｌ， ＣｈＧｕｔｃ。ｍｐｌｅｔ…—ｑｕｅａｎｄｅｖ． ＶＰ１１２０－１ ６０具有强大的裂解能力。 据报道，浓度在ｍｍｏｌ／Ｌ水平ｈ的二价离子尤 。ｌｕｔｉ。 ａ ｙ ｇ。 。ｍｉ １ｙ。ｉ。。ｆ ｔｈ Ｐｓｅｕｄ。 。 。 ｇ 。 ｔｒａｎｓＤ０ｓａｂｌｅ ｂａｅｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｄ３１１２ ｒＩ］．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１ｏ ２００４，１８６ ４０ （２）：４００—４１０． 动物医学进展２０１４年第３５卷第１期（总第２４７期） ｎ Ｎ Ｔ，Ｈｕ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅ— ［１１］ Ｃｈａｎｇ Ｋ Ｃ，Ｌｉｒｉｏｐｈａｇｅ ＡＢＩ，ａ ＫＭＶ—ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅ５］成靓，吴晓伟，胡琼之．理化因素及感染复数对噬菌体ＭＳ２ 活性的影响ＥＪ３．环境科学与管理，２０１２，３７（１）：１４０—１４２． ［６］Ｇｕｐｔａ Ｒ，Ｐｒａｓａｄ Ｙ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐ一２７／ ＨＰ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ￡口ｐ＾ Ｚ０ｃ￡ｃｃ“ｓ ａｕｒｅｕｓ ａｓｓｏ— Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，９７（４）：２４９— ２５５． ［１２］ 崔尹赡，易 萍，许忠福，等．一株假单胞菌属低温噬菌体的 ｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１，６２（１）： ２５５—２６Ｏ． 分离及其特性研究［Ｊ］．中国微生态学杂志，２０１３，２５（３）：２４９— ２５３． ［７］Ｃｈａｔｅｒ Ｋ Ｆ，Ｃａｒｔｅｒ Ａ Ｔ．Ａ ｎｅｗ，ｗｉｄｅ ｈｏｓｔ—ｒａｎｇｅ，ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（Ｒ４）ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｏｒｎ Ｐ，Ｎｕｔｔｉｋａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒ— ［１３］ Ｏｎａｎｏｎｇ Ｐ，Ｎｕｔｔａｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ—ｐｈａｇｅ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｍｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ—ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９７９，１１５（２）：４３１－４４２． ｃｉｂａｒｉａ Ｎ２２ ｆｒｏｍ Ｎｈａｍ，ａ Ｔｈａｉ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｐｏｒｋ ｓａｕｓａｇｅ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１，２８（３）：５１８－５２５． ［８］李维泉，姚鹤鸣，沈美娟，等．地中海拟无枝菌酸菌专一的噬菌 体￣ＭＭＲ１的研究［Ｊ］．病毒学报，１９９９，Ｉ５（２）：１７２—１７９． Ｅ９］Ｗｅｉｓｓ Ｂ Ｄ，Ｃａｐａｇｅ Ｍ Ａ，Ｋｅｓｓｅｌ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒ— ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｆｏｒ Ｘａｎ— ｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ［１４］ Ｌａｎｇ Ａ Ｓ，Ｂｅａｔｔｙ Ｊ Ｔ．Ｇｅｎｅｔｉｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｇｅｎｔ ｏｆ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ￣Ｊ］．Ｐｒｏｅ Ｎａｔｌ Ａｅａｄ Ｓｅｉ ＵＳＡ，２０００，９７（２）：８５９— ８６４． ｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９４， １７６（１１）：３３５４—３３５９． ［１５］ 刘斌。Ｇｉｉｎｔｅｒ Ｊ，Ｊｕｌｉａｎｅ Ｓ，等．源于克雷伯氏菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＡＣ一１１的３株噬菌体的生物学特性［Ｊ］．海洋学报：中文 版，２０１Ｉ，３３（４）：１４７—１５４． ［１Ｏ］贾盘兴．噬菌体分子生物学［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１： １２０—１２１． Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ７ Ｐｈａｇｅ ＷＡＮＧ Ｙｉ—ｗｅｉ，ＸＵ Ｈａｉ，ＣＨＥＮ Ｊｉｎ，ＺＨＥＮＧ Ｑｉ—ｓｈｅｎｇ，ＨＯＵ Ｊｉ—ｂｏ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ，２１００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ７ ｐｈａｇｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １ ａｓ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ），ｔｈｅ ｏｎｅ—ｓｔｅｐ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｐＨ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｏｎｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｒｅ— ｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ７ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏ—ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍ— ｂｉｎａｎｔ Ｔ７ ｐｈａｇｅｓ ｗａｓ ｗｅａｋ，ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ａｆｔｅｒ ｈｅａｔｉｎｇ ａｔ ６０℃ｆｏｒ ２Ｏ ｍｉｎｕｔｅｓ ａｎｄ ｈｅａｔｉｎｇ ｆｏｒ ５ ｍｉｎｕｔｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ７０。Ｃ ｃｏｕｌｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ ｉｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｈａｄ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ｓｔａ— ｂｉｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐＨ ４ ｔｏ １ １．Ｔｈｅ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ７ ｐｈａｇｅｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ ａｎｄ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ 。ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｌａｑｕｅｓ ｗｅｒｅ ａｂｏｕｔ ２０ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍｇ ｏｒ Ｃａ ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＭＯ１ ｗａｓ １０～．Ｔｈｅ ｏｎｅ—ｓｔｅｐ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌａｔｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｅ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｗｅｒｅ ａｂｏｕｔ ３Ｏ ｍｉｎ ａｎｄ １ ５０ ｍｉｎ，ｒｅ— ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｂｕｒｓｔ ｓｉｚｅ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １２６ ｐｆｕ／ｃｅｌ１．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ７ ｐｈａｇｅ ｈａｓ ｓｈｏｒｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ，ａｐｐａｒｅｎｔ ｂｕｒｓｔ ｓｉｚｅ，ｇｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｈｅｏｒｅｔ— ｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｌａｒｇｅ—ｓｃａｌｅ，ｈｉｇｈ—ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ７ ｐｈａｇｅ；ｖａｃｃｉｎｅ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ
