实验三-蛋白质的两性反应与等电点的测定

实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定

一、 目的和要求

1. 了解蛋白质的两性解离性质。 2. 初步学会测定蛋白质等电点的方法。 二、 原理

蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。 三、 试剂和器材 1. 试剂

0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸；0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液 2. 器材

试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml） 四、 操作方法 1. 蛋白质的两性反应

（1） 取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，

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混匀。观察溶液呈观的颜色，并说明原因。

（2） 用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发

生，此时溶液的PH接近与酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 （3） 继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。 （4） 再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。

继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？ 2. 酪蛋白等电点的测定

（1） 取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。

加入每种试剂后应混合均匀。 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 蒸馏水（ml） 2.4 3.2 — 2.0 3.0 — — 3.5 1.5 2.75 3.38 — — — — — — 加 1N醋酸溶液 1.6 0.8 — 入 0.1N醋酸溶液 — — — 4.0 2.0 1.0 — — — 0.5 — — 的 0.01N醋酸溶液 — 试 酪蛋白醋酸钠 2.5 1.25 0.62 1.0 5.9 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 5.0 5.3 5.6 剂 溶液最终PH 3.5 3.8 4.1 4.4 4.7 沉淀出现情况 （2） 静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++

符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪一个PH是酪蛋白的等电点？ （3） 该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。 五、 思考题

1. 在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶

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体性质加以说明。

2. 在本试验中，酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必然沉淀出来。上面这种结论对吗？为什么？请举说明。

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