荧光分析法测定VB2

（2学时）

一、实验目的

1．了解荧光分光光度计的基本原理、仪器结构和使用方法。 2．学习和掌握荧光光度分析法测定VB2的基本原理和方法。

二、实验原理

当物质的分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射光子的过程，称之为荧光。荧光分析中包括激发光谱和发射光谱，是荧光物质的两个重要的性能指标。激发光谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况；荧光光谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析法。

对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系： F＝K c

式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。

VB2(即核黄素)在430～450 nm光的照射下发出荧光，其峰值波长为530 nm左右。VB2的荧光在pH = 6～7时最强，而且其荧光强度与其溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测VB2的含量。

三、仪器和试剂

1．仪器：荧光光度计，荧光比色皿、棕色容量瓶、移液管 试剂：核黄素 VB2药片

2．10.0 mg/LVB2标准溶液：准确称取10.0 mgVB2，将其溶解于少量的1% HAc中，转移至1 L容量瓶中，用1%HAc稀释至刻度，摇匀。该溶液应装于棕色试剂瓶中，置阴凉处保存。

3．待测液：取市售VB2一片，用1% HAc溶液溶解，定容成1000 ml，贮于棕色试剂瓶中，置阴凉处保存。

四、实验步骤

1. 打开电脑，打开荧光分光光度计电源，打开仪器光谱扫描软件。 2. 点击“Setup”图标，选择模式，设置仪器参数，扫描VB2的激发光谱和发射光谱，确定最佳激发波长和发射波长。

3. 标准溶液的测定：开启标准曲线模式，设置适当的仪器参数，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度，得到VB2的浓度与荧光强度的线性回归方程。

4. 未知试样的测定：分别取待测液2和4 mL置于100 mL容量瓶中，用1% HAc稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。

5. 测试完成后，取出比色皿，洗净。关上主机盖板；

6.选择文件类型保存， 关闭电脑，关主机电源，盖好仪器防尘罩。

五、数据处理

1．根据VB2的激光光谱和发射光谱确定VB2的最佳激发波长和最大发射波长。

2．根据标准工作曲线上给出的样品浓度，计算VB2药片中VB2的含量。

六、实验注意事项

1. 在测试样品时，应注意样品的浓度不能太高，否则由于存在荧光猝灭效应，样品浓度与荧光强度不呈线性关系，造成定量工作出现误差。

2. 在测定系列标准溶液的浓度和荧光强度时顺序要从稀到浓，必须按顺序

放入测定。

3. 拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，避免接触光学面。同时注意轻拿轻放，防止外力对比色皿的影响，产生应力后破损。

4. 盛装溶液时，高度为比色皿的1/2处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头纸或丝绸擦拭。

5. 在光谱范围设定时，要注意避开瑞利线、拉曼线以及倍频线。

七、思考题

1、VB2在pH = 6～7时荧光最强，为何本实验在酸性条件下测定？