北方园艺２０１０（２）：１１１～１１３ 植物・园林花卉・ 小菊花色芽变品系、的ＳＲＡＰ鉴定 秦贺兰 ，曹 靖 ，姚士才 ，张西西 （１．北京市同林科学研究所，北京１００１０２；２．山西农业大学园艺学院，山西太谷０３０８０１） 摘要：利用ＳＲＡＰ技术进行小菊粉色花芽变与黄色花对照的ＤＮＡ多态性分析。８８对引物 共扩增出清晰条带１ １６９条，分子量在１４７～７００ ｂｐ之间。芽变品种及对照遗传相似系数为 ０．９９７，遗传物质多态性为０．６８ ，表明芽变与对照在遗传背景上高度的一致。筛选出５对引物， 获得８条可能与花色芽变基因有关的特异条带，粉色花特有条带为１９０，５５０ ｂｐ（Ｍｅ４一Ｅｍｌ０）、５６０ ｂｐ（Ｍｅ５一Ｅｍ１）、４１０ ｂｐ（Ｍｅ６一Ｅｍ７），对照特有条带为５７０、５５７ ｂｐ（Ｍｅ４一Ｅｍ１１）及２２０、３５０ ｂｐ（Ｍｅ６一 Ｅｒａ５）。这些特异条带能够在植物生长早期鉴别芽变品种与对照。推测造成小菊粉色花芽变的 原因很可能是染色体结构的变异。 关键词：小菊；花色芽变；ＳＲＡＰ 中图分类号：Ｓ ６８２．１’＿１文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２０１０）０２～Ｏ１１１－－０３ 菊花是我国的“国花”。芽变是菊花新品种产生的 用６ 的变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳恒定功率为６５ 重要来源。对芽变植物新品种（系）鉴定的现行方法主 Ｗ，电泳２ ｈ。凝胶采用银染法进行染色。 要是参照《中华人民共和国植物新品种ＤＵＳ测试指南 ２结果与分析 （试行稿）》进行的表观性状的测定和描述。近年来快速 ２．１ ＳＲＡＰ引物的扩增结果和遗传相似性分析 发展起来的ＤＮＡ分子标记技术，能够在植物生长早期 ８８对引物共扩增出清晰条带１ １６９条，分子量在 将芽变品种与原始品种区别开来，并能揭示芽变品种与 １４７￣７００ ｂｐ之间（表１）。每对引物组合可扩增的清晰 原始品种的本质区别ｌ】 ］。该试验目的是采用稳定性较 条带数在４～２４条之间，平均为１３．３条。特异条带数为 好、多态率较高的ＳＲＡＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌ— ８条。为进一步说明芽变与对照在遗传物质上的差异程 ｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分子标记技术 。 对选育的栽培小菊粉色花 度，对ＤＮＡ片段多态性进行了分析。采用Ｎｅｉ＆Ｌｉ 芽变品种及黄色花原始品种遗传物质进行分析比较，以 （１９７９）的遗传相似系数（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，ＧＳ）：ＧＳ＝ 期从分子水平揭示花色芽变与原始品种的差异，为芽变 ２Ｎｉｊ／（Ｎｉ＋Ｎｉ），Ｎｉ、Ｎｉ分别为样本ｉ、ｊ的带数，Ｎｉｊ表示公 新品种的早期鉴定和新品种保护提供更加科学、快速的 共带数，遗传距离Ｄ一１一Ｇｓ；多态性（ ）一多态性片段 技术支持；为小菊花色芽变基因的克隆、测序分析和揭 数／总扩增片段数×ｉ００一（Ｎｉ＋Ｎｊ一２Ｎｉｊ）／（Ｎｉ＋ 示花色芽变的分子机理打下基础。 Ｎｊ—Ｎｉｊ）×１００。粉色芽变和原始品种共有条带为１ １６１ ｌ材料与方法 条，各有条带均为１ １６５条。数据结果表明，粉色花芽变 试验于２００８年２～６月在北京市园林科学研究所进 与对照遗传相似系数为０．９９７，遗传距离仅为０．００３，遗 行。用改良ＣＴＡＢ法提取叶片ＤＮＡ，于～２５℃冰箱中保 传物质多态性为０．６８ ，表明芽变与对照在遗传背景上 存备用。ＳＲＡＰ扩增反应体系为２ｏ Ｌ：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ 表１ 芽变及对照８８对引物ＳＲＡＰ扩增结果 ３／￣Ｌ；ＤＮＡ模板２ Ｌ（约５０ ｎｇ）；上、下游引物各２ ｐｔＬ（￣』 物由上海生工合成，碱基序列略）；ｄＮＴＰ（２．５ ｍＭ ｅａｃｈ） ２ Ｌ．ｒｒａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／ Ｉ ）０．３／￣Ｌ；ｄｄ Ｈ２Ｏ ８．７ Ｌ。扩增程序参照Ｉ』和Ｑｕｉｒｏｓ的方法为：９４℃３ ｍｉｎ， ９４℃１ ｍｉｎ，３７℃１ ｍｉｎ，７２℃２ ｍｉｎ，５个循环；９４。Ｃ１ ｍｉｎ， ５０℃１ ｍｉｎ，７２℃２ ｍｉｎ，３５个循环；７２℃５ ｍｉｎ。扩增产物 第一作者简介：秦贺兰（１９７１一），女，硕士，高级工程师，现从事花卉 育种和栽培研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｎｈｅｌａｎ７１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ。 基金项目：北京市科委重大资助项目（ＤＯ７Ｏ５ｏＯ３Ｏ４Ｏｌ２１）。 收稿日期：２ｏｏ９一Ｏ９—２０ 注：（）内是观测发现的差异带数。 １１１ ・园林花卉・植物 北方园艺２０１ｏ（ｚ）：１１１￣１１３ Ｍｅ５一Ｅｍｌ、Ｍｅ６一Ｅｍ７扩增结果中，分别在１９０、５５０（ＩＮ １ 中所示２１Ｓ孑Ｌ道）、５６０（图２所示０１Ｓ孔道）、４１０ ｂｐ（图２所 高度的一致。据此推测，造成小菊粉色花芽变的原因很 可能是因染色体异位、插人、缺失或突变而造成的染色 体结构上的微小变异而非ＤＮＡ片段拷贝数的增加 ］。 ２．２特异片段的筛选和分析 示１８Ｓ孑Ｌ道）处具有特异带，对照品种缺失；对照品种在 Ｍｅ４－Ｅｍ１１、Ｍｅ６－Ｅｍ５扩增结果中，分别在５７０、５５７（图１巾 所示２２Ｃ孔道）、２２０及３５０ ｂｐ（冈２所示１６Ｃ孔道）处有特 ８８对引物中５对引物组合：Ｍｅ４一Ｅｍｌ０、Ｍｅ４一Ｅｒａ１１、 Ｍｅ５一Ｅｒａ１、Ｍｅ６～Ｅｍ５、Ｍｅ６一Ｅｍ７扩增结果具有多态性（图 １、２），引物有效性５．６８ 。粉色芽变品种在Ｍｅ４一Ｅｍｌ０、 异带，粉色芽变品种缺失（图ｌ、２箭头指示）。这些特异条 带，推测可能包含着形成花色芽变的突变基因。 图ｌ粉色芽变和对照２２对引物ＳＲＡＰ电泳图谱 注：Ｏ１～１ｌ引物对依次为Ｍｅ３一Ｅｍｌ，Ｍｅ３一Ｅｒｎ２，Ｍｅ３～Ｅｒａ３ Ｍｅ３一Ｅｒａ４， Ｍｃ３一Ｅｍ５．Ｍｅ３一Ｅｒａ６，Ｍｅ３一Ｅｒａ７，Ｍｅ３ Ｅｒａ８，Ｍｅ３一Ｅｒａ９．Ｍｅ３一Ｅｍｌ０． Ｍｅ３一Ｅｒａ１１：１２￣２２引物依次为ＭＰ４ Ｅｍｌ，Ｍｅ４一Ｅｒｎ２，Ｍｅ４一Ｅｒａ３，Ｍｅ４ Ｅｒａ４， Ｍｅ４ Ｅｒａ５，ｂｌｅ４ Ｅｍ６，Ｍｅ４一Ｅｍ７．Ｍｃ４一Ｅｍ８，Ｍｅ４ Ｅｒａ９，Ｍｅ４一Ｅｍｌ０． Ｍ融一ＥｍｌＩ。Ｍ为Ｍａｒｋｅｒ，左侧孔道Ｃ为对照，右侧孔道Ｓ为花色突变 体．一指示特异ＤＮＡ片段。 ３结论与讨论 作为芽变新品种鉴定的一种辅助手段，ＳＲＡＰ技术 是以叶片中提取的ＤＮＡ为材料进行ＤＮＡ水平的分析 从而给出发生芽变的本质差异。借助此技术能够在植 物生长早期而不必等到盛花期将花色芽变品种与原始 品种鉴别开来。虽然如此，花色芽变品种与对照在遗传 物质组成上高度的一致（相似系数为０．９９７），相比之下， 遗传物质多态性变化位点仅占０．６８ ，造成花色芽变的 基因可能仅在于庞大基因组ＤＮＡ很小的位点上。通过 对特异性片段的ＤＮＡ克隆、测序和进一步分析，很可能 获得花色芽变机理的进展。 参考文献 ［１］朱呖，潘一山，郑少缘，龙柚芽变系的ＲＡＰＤ分析鉴定ｌＪ］．漳州师范 学院学报（自然科学版），２００８（２）：９９—１０１． Ｅｑ谢吉容，梁国鲁，李树发．等．月季“金银岛”红花芽变品系的分析鉴 １１２ 图２粉色芽变和对照２２对引物ＳＲ 图谱 注：叫～１】引物对依次为Ｍｅ５ Ｅｍｌ，Ｍｅ５一Ｅｎ）２，Ｍｅ５一Ｅｒａ３．Ｍｅ５一Ｅｍ；ｔ。 Ｍｅ５一Ｅｎ１５．Ｍｅ５一Ｅｎ１６，Ｍｅ５ Ｅｎ１７，Ｍｅ５一Ｅｍ８，Ｍｃ５一Ｅｍ９，Ｍｅ５ Ｅｍ１０，Ｍｅ５一 ＆ｎＵ：ｌ２—２２ ｉｓ Ｍｅ６一Ｅｍｌ，Ｍｅ６一Ｅｒｎ２，Ｍｅ６一Ｅｒａ３，Ｍｅ６一Ｅｒａ４，Ｍｅ６一Ｅｍ５．Ｍｅ６～ Ｅｍ６，Ｍｅ６ Ｅｎ订．Ｍｅ６一Ｅｎ儡．Ｍｅ６ Ｅｍ９，Ｍｅ６一Ｅｍ１０，Ｍｅ６ Ｆｍ１ｌ。Ｍ为Ｍａｒｋ～ ｅｒ，左侧孔道ｃ为对照，右侧孔道ｓ为花色突变体，一指示特异ＤＮＡ 片段 定［Ｊ］．北方同艺．２００７（１１）：１８６—１８８． Ｅｓ］申屠文月，陈析丰，马伯军．３个［１１茶花变异品种的彤态鉴定和 ＲＡＰＤ分析＿＿Ｊ］．浙江师范大学学报（自然科学版），２００６．２９（３）：３ｌ ７ ３２１． Ｅ４］张西西，徐进，：Ｅ涛，等．万寿菊杂交一代遗传多态性的ＳＲＡＰ标记 分析０］．同艺学报，２００８．３５（８）：１２２１—１２２６． 』５］Ｆｅｒｒｉｏｌ Ｍ，Ｐｉｏｃ Ｂ，ｄｅ Ｃｏｒｄｏｖａ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｐ．ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄ如ｅｒｓｉｂ ｏｆ ａ ｇｅｒｍｐｌａｓｒｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｑｕａｓｈ（Ｃｕｃ ｕＨ）ｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＳＲＡＰ ａｎｄ ＡＦＩ Ｐ ｎ￣，ｒｋｅｒ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ［＇ｋ＇ｉｅｎｃｅ．２００，１．４４：６５３ ６６４． ［６］Ｌｉ Ｇ，Ｑｕｉｒｏｓ Ｃ Ｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｋ￣Ｉｘ，ｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＰ，ＡＰ），ａ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ａｎ ａ ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｆｆｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＩＯ ｍａｐ ｐｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ＥＪ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐ ｌｌｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ２００１．１０３：４５５ ４６１． ［７］贾兵，朱立武，余兴，等．猕猴桃品种”皖翠”芽变位点的ＳＣＡＲ标记 研究ＥＪ］．安徽农业大学学报，２００７，３４（２）：２５１—２５５． Ｅ８］Ｔｒｉｉａｎｏ Ｒ Ｎ，Ｓｔａｒｔ Ｍ Ｃ，Ｃａｃｔａｎｏ Ｇ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏ ｆｉｌｅｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｍａｔｉｃ ａｎｄ ｒａｄｉａｌｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｐｏｒｌｓ ｏｆ ｃｈｒｙ∞ｍｈｅｎ１ｕｍｒＪ］．Ｊ Ａ／ｎｅｔ Ｓｏｃ Ｈｏｒｔ ｓｄ，ｌ９９８．１２３：６４２ ６４６． 北方园艺２０１０（２）：１１３～１１５ 植物・园林花卉・ 春兰杂交育种初探 王俊萍 ，章丹峰 （１．杭州灵隐管理处（杭州花圃），浙江杭州３１０００７；２．杭州植物园，浙江杭州３１００００） 摘要：精选名品春兰进行种内杂交及自交人工辅助育种，研究春兰遗传规律及蒴果生长过 程。结果表明：成果率与受精后栽培养护关系很大，在受精后４０ ｄ左右幼果容易损失，８～９月份 是关键期，兰株易染病，容易导致蒴果夭折。 关键词：春兰；杂交育种；杂交；自交 中图分类号：Ｓ ６８２．３１文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２０１Ｏ）０２—０１１３一Ｏ３ 传统的兰花繁殖方式是分株繁殖，但通过观察发现 １材料与方法 野生兰花是靠种子繁殖的。长期以来人们选育春兰的 １．１杂交时机 优良品种主要是在野生春兰的自然变异株中选择。自 按照杂交育种的一般要求，精选生长健壮的父母本 然变异中的优良变异非常稀少，且现在春兰野生资源已 放于适宜的光温条件下，并施入长效肥，杂交最佳时期 遭到了严重破坏，仅靠从野生兰花里选育品种不能满足 为花开后３ ｄ上午１Ｏ时左右。 人们对新品种的需要，因此迫切需要人为创育新品种。 １．２操作方法 因春兰的名贵品种市场价位较高，而在常规育种方法 用镊子去掉父本的舌瓣，取下花粉，去掉花粉盖，取 中，人工辅助杂交育种方法的目的性强、成功率高、危害 出４个花粉块，同时去掉母本的花粉块和舌瓣，用镊子 性小、最适合名贵春兰育种。２００３年３月，开展名贵春 把父本花粉块放人母本合蕊柱下的柱头处（凹处），柱头 兰人工辅助杂交育种试验，开始探索名品春兰的遗传规 粘液就会粘住花粉块。一般一个柱头可用１～２块花粉 律，并认真仔细地观察了春兰蒴果的整个生殖生长 块授粉，如果父本充足，则可多放几块，以产生群体效应 过程。 有利于授粉成功。授粉后不必套袋，做好标签并记下杂 交时间及父本名称。 第一作者简介：王俊萍（１９７１），女，山东临邑人，本科，助理工程 １．３种内杂交和自交 师，现从事兰花栽培管理工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｄｆｌ２０７＠１６３．ｃｏｉｎ。 采用了５个杂交组合和４个自交品种进行试验。 收稿日期：２Ｏ¨０９一Ｏ８—２Ｏ 育种目标：探索人ｍｇ，ｌ育春兰新品种的方法，期望杂交 ＳＲＡＰ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｎｋ Ｆｌｏｗｅｒ Ｓｐｏｒｔ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｗｉｔｈ Ｓｍａｌｌ Ｆｌｏｗｅｒｓ Ｑ１Ｎ Ｈｅ－ｌａｎ ，ＣＡＯ Ｊｉｎｇ ，ＹＡＯ Ｓｈｉ—ｃａｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉ—ｘｉ （１＿Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０２；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ，Ｓｈａｎｘｉ ０３０８０１） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｐｉｎｋ ｆｌｏｗｅｒ ｓｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｆｌｏｗｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ＳＲＡＰ．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １ １ ６９ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ８８ ｐａｉｒ ｐｒｉｍｅｒ，ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ １４７ ｂｐ ｔｏ ７００ ｂｐ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（ＧＳ）ｗａｓ ０．９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｗａｓ ０．６８％．ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ５ ｐａｉｒ ｐｒｉｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ８ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｂａｎｄｓ，ｏｆ ｗｈｉｃｈ １９０，５５０ ｂｐ（Ｍｅ４一Ｅｍｌ０），５６０ ｂｐ（Ｍｅ５一Ｅｍ１）ａｎｄ ４１０ ｂｐ（Ｍｅ６ Ｅｍ７）ｗａｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎｌｙ ｉｎ ｓｐｏｒｔ，ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ ５７０ ｂｐ，５５７ ｂｐ（Ｍｅ４－Ｅｍ１１）ａｎｄ ２２０，３５０ ｂｐ（Ｍｅ６一Ｅｍ５）ｗａｓ ｏｎｌｙ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏ１． Ｔｈｅｓｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｏｗｅｒ ｃｏｌｏｒ ｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｐｉｎｋ ｆｌｏｗｅｒ １ｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒｏ１ ｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｉｅｒ ｓｔａｇｅ．Ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒ－ｃｏｌｏｒ－ｓｐｏｒｔ ｒｅａｓｏｎ ｗａｓ ｍａｙｂｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ＤＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｆｌｏｗｅｒｓ；ｆｌｏｗｅｒ－ｃｏｌｏｒ－ｓｐｏｒｔ；ＳＲＡＰ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １１３