脑源性神经营养因子及其临床研究进展

生物技术通讯　　　　　　　

LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.10　No.2　Jun.1999

脑源性神经营养因子及其临床研究进展

牟芝蓉1

(军事医学科学院生物工程研究所　北京　100071)

摘要　脑源性神经营养因子(BDNF)是继神经生长因子(NGF)后发现的第二个神经营养因子,在神经系统的发育、功能维持和神经元群的成形性上起重要作用。国内外正积极开发BDNF用于神经损伤的治疗。本文就BDNF的结构、功能、信号传导以及临床研究等作一综述。

关键词　脑源性神经营养因子;酪氨酸激酶B;分子结构;信号传导;临床试验

Brain-derivedneurotrophicfactoranditsclinicaltrials

MouZhirong

(InstituteofBiotechnology,Beijing100071)

Abstract　Brain-derrivedneurotrophicfactoristhesecondneurotrophinafterNGFwasfirstfound.TheabilityofBDNFtoregulatenervoussystemdevelopment,adultnervousplasticity,andmaintenanceofstructuralintegritysuggeststheuseofthisproteintotreatneuro-degenerationassociatedwithhumandiseases.Manystudyworkshadbeendoneaboutthisprotein,includingmolecularstructure,signaltransduction,clinicaltrials,andsoon.Keywords　BDNF;TrkB;molecularstructure;signaltransduction;clinicaltrials　　神经元的生长必须有来自靶组织的营养因子的支持,这些因子的产生,将使那些生长到错误靶组织或在靶组织错误定位的多余神经元突触和轴突因得不到足够的营养因子而退化[1]。在系统发育中,靶源性的神经营养因子能够控制中枢神经系统相互联系的神经元的数量[2],促进神经元的成熟,促进神经递质的选择和转换过程中的酶系发育[3],促使错误联系的神经元退化、死亡[2],在神经系统的发育生长、功能维持和神经元群的成形性(plasticity)上起着重要作用[18]。

脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfac-髓质、小脑、海马等中枢tors,BDNF)主要分布在大脑皮层、

神经系统,另外在外周的心脏、肺、骨骼肌和坐骨神经也检测到BDNFmRNA的存在[7,28]。成熟的BDNF与NGF有55%同源,且3对二硫键的位置完全相同,同属于NGF家族[3,7,8,14]。

N-糖基化位点和一个位于Arg128之后的二元化切点(diba-siccleavagesite),在该处切开,产生一个由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽,等电点9.99。BDNF相当保守,在人、猪、鼠中成熟蛋白的氨基酸顺序完全相同,尽管编码的核苷酸顺序有些差异[7,8]。

天然的BDNF以同源二聚体的形式存在。平衡超离心研究,即使在蛋白浓度10-10mol/L也没有单体发现[15]。BD-NF的3对二硫键于Cys13-Cys80、Cys58-Cys109、Cys68-和盐Cys111之间形成,对BDNF的稳定和功能起重要作用。酸胍变性BDNF研究其重折叠,分析得到的一系列CD图谱、荧光图谱、SEC图谱表明BDNF主要由B-折叠和无规则二级结构组成[14,15]。亚基之间通过疏水性相互作用强烈结合。

2　受体结构与信号传导

神经营养因子的受体采用酪氨酸激酶家族(Trks)。BD-4/5的最适配体和NT-NF的最适配体为TrkB,它也是NT-3的第二配体[20～22]。

进一步的研究表明[20],TrkB是由821个氨基酸残基组成的高度糖基化分子,受体胞外区包括一个由32个氨基酸残基组成的信号肽,紧接3个串联的富亮氨酸基元(lecuine-　　1现在第三军医大学复合伤研究所　重庆　4000381　结构基础

bdnf基因定位于1号染色体的近端短臂上,为单拷贝基因[3]。从人和猪的资料可知BDNF属于单一外显子结构,不被内含子分割[8]。而小鼠的bdnf基因上游有4个启动子、5个外显子,调节不同组织、不同细胞群的基因表达[9]。人的bdnf基因编码的前体蛋白含有274个氨基酸残基,氨基酸顺序分析表明信号肽部分第121～123位之间有一个潜在的牟芝蓉:脑源性神经营养因子及其临床研究进展

・149・

神经元具有营养作用[18,19]。在Hyman等人的实验中,BDNF降低中脑TH+细胞的体外死亡,暗示它对维持多巴胺神经元存活有直接作用,并拮抗6-羟基多巴胺、4-MPP+(1-甲基-苯基吡啶)对多巴胺神经元选择性的神经毒作用[19]。另外,重组的BDNF能够援救BDNF敲除的小鼠海马的LTP以及基底突触传递的缺陷[16]。近来的研究,BDNF通过增加N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚基1磷酸化而增强突触传递[24]。

多种神经元细胞群BDNFmRNA转录水平比NGFmRNA高,而脑脊液中则相反,BDNF水平低于NGF,一个可能的原因是脑组织中内源BDNF相对低的渗透。已知在中枢神经系统除了全长的TrkB受体,还包括相当丰富的截断形式的TrkB,它们缺少胞内催化区,后者结合BDNF并在脉络膜丛的室管膜表达[22],可能阻止BDNF穿过进入脑脊液,Korhonen的试验亦证实这一点[31]。Korhonen的试验还显示在遭受窒息的新生儿的脑脊液中BDNF增加,而在这些婴儿脑脊液中NGF的水平下降。低氧缺血大脑BDNF上调可能是截断型TrkB受体结合BDNF的能力无效造成的。动物试验结果表明试验性低血糖或局部缺血后,BDNFmR-NA和蛋白在很长一段时间水平上升。另有关于低血糖或局部缺血伴随的神经细胞死亡,NGF和BDNF对其有益影响的报道[30],并且人们发现,BDNF对抗低氧缺血造成脑损伤随着动物年龄而发生变化,而生产早期BDNF的影响最大。这些结果暗示对人类的产期脑病,BDNF可能也有益处。窒息婴儿脑脊液中BDNF水平上升可能是大脑的一种防御机制,保护神经元免受损伤。需要进一步证明的是给新生儿加入外源BDNF是否能够减轻神经病症状,是否对窒息婴儿

有较好的临床效果。

众所周知,学习和记忆与基底前脑的胆碱能神经元以及向大脑皮层、海马投射的神经纤维密切相关。随着年龄的增长或病变的发生,特别是阿尔茨海默病(Alzheimer′s)病,记忆衰退程度与基底前脑胆碱能神经元功能丧失有关。有报道证明,Alzheimer′s病患者的海马中BDNF-mRNA水平降低[11,17]。虽然没有更多的数据说明BDNF与Alzheimer′s病的潜在治疗关系,相信随着对BDNF的研究深入,一定会有更深刻的理解。

BDNF和TrkB在视觉系统广泛分布[29,30],是一个比较活跃的因子。BDNF量的多少受视觉信号输入调节,并且在整个视觉通路都有BDNF反应细胞,它参与视皮质的发育,影响皮质神经元的选择性定位。BDNF在锥体细胞的表达可能调节GABA能神经元神经递质和神经肽的产生[29]。BD-NF和TrkB受体在视网膜等视觉系统同时表达,可以想象TrkB也调节自分泌/旁分泌信号[32]。最近,Herzog研究了BDNF在鸡胚视觉顶盖(optictectum)和视网膜的分布[33],二者是视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGC)所需BDNF的来源。传统的观念认为,BDNF是RGC的靶源性营养因子,RGC的轴突生长、分支到视觉顶盖,与那里的BD-NF反应,BDNF可通过逆行运输到达RGC胞体。Herzog的richmotif,LRM),LRM两端有两个半胱氨酸簇,它包括了Trk受体12个保守半胱氨酸中的8个,这些motif与蛋白-蛋白之间牢固而专一的相互作用有关。胞外近膜区是两个Ig类似结构域Ig-1和Ig-2,TrkB的Ig类似结构域和TrkA、TrkC一样,与一些调节细胞集聚的粘附分子,如N-CAM相似,Trk受体是否有类似的细胞集聚作用还有待考证。一个简单的单一跨膜区之后是酪氨酸激酶(TK)区,胞内区C-端是15个氨基酸残基组成的短尾。TrkA有较高的同源性,其中胞外区达57%(38%完全一致),主要分布在第1、2LRM和Ig-2,同源性最高的是TK区(88%)。

BDNF与TrkB的胞外区结合,明显激活内在的酪氨酸激酶活性,受体胞内区特有的酪氨酸残基为各种胞内信号分子提供锚定位点,并通过与活化的Trk结合或被磷酸化而被活化。Trk受体底物通过SH2区识别专一性磷酸化酪氨酸残基,比较明确的Trk受体底物之一是磷酸酶CC(PLCC),PLCC催化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)分解,产生两种重要的第二信使IP3和DG,分别诱导Ca2+释放[20,21]和活化蛋白激酶C。另一个可能底物是RasGTPase活化蛋白(GAP)。Meyer-Franke等用视网膜神经节细胞的实验证明[35],视网膜神经节细胞对神经营养因子的反应与cAMP的介导有关。TrkB为BDNF的功能性受体,完成其生物学效应。

人们还发现另一种形式的TrkB,它缺少酪氨酸激酶区。完整形式的TrkB主要在神经元中表达,而这种截断形式的TrkB不仅在神经元细胞中表达,在神经胶质细胞中亦高表达。另外,在大脑室系的室管膜和脉络膜丛,也令人惊奇地高表达[22]。截断形式的TrkB可能在其它细胞中建立神经营养因子梯度,或把神经营养因子送到其它细胞的功能性受体上。因它比功能性TrkB有更高的亲和力,在阻止完整形式的TrkB与非最适配体结合的负效应上可能有特殊作用。并且截断形式的TrkB在大脑室和脉络膜丛表达还可能运输配体跨过血脑屏障或作为清除多余配体的“清洁工”。Garner等鉴定了多种形式的TrkB,认为在配体结合或信号传导特性方面不完全一样

[32]

。

有一种最初发现以为是NGF的受体,现称作低亲和力NGF受体(LNGFR),能结合每一种神经营养因子[20～22]。它在神经元细胞以及神经元专一性靶细胞和神经胶质细胞中均表达,认为LNGFR可能作为神经营养因子的递呈分子[20]、增强Trk受体选择性而发挥作用[23]。

3　生物学作用

bdnf基因在成年中枢神经系统的多区域表达,包括纹状体。体内和离体研究证明,BDNF可维持、促进外周神经嵴和外胚层基板来源的多种感觉神经元的发育、生长与分化,支持视网膜神经节的体外存活[7,10,18]。Kn󰀁sel等人的体外实验发现,rhBDNF能够增强基底前脑胆碱能神经元ChAT的活性,若与NGF或bFGF连用,增强效果更明显,并认为,rhBDNF对基底前脑·-氨基丁酸能神经元、中脑黑质多巴胺・150・

试验数据却暗示RGC的BDNF主要来源不是顶盖,而是视网膜本身,并观察到RGC能从周围组织积聚BDNF。进一步研究需要证明BDNF作为靶源因子(target-derivedfactor)和作为输入源因子(afferent-derivedfactor)是否起着不同作用,这些研究将可能用于视神经损伤导致的RGC退化的治疗。

生物技术通讯　　　　　　　

LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.10　No.2　Jun.1999

death)和诱发性损伤所造成的运动神经元死亡;BDNF处理面神经切断的新生大鼠,被切断的运动神经元存活时间延长。由于BDNF和神经营养素(neurotrophin)家族的其他成员在体外都不能促进运动神经元的存活,研究人员们认为,在体外不能挽救运动神经元是因为在试管内缺乏体内有助于这种细胞挽救的重要辅助因素,这些辅助因素是什么还有待于进一步确定。但认为BDNF能拯救被损毁的运动神经元,这种因子在治疗运动神经元疾病和损伤方面有远大前景[25]。

到1995年,在肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)患者的Ⅰ/Ⅱ期临床试验表明BDNF降低病人呼吸能力的恶化,且证明了它的安全性和良好的耐受性。随即Amgen公司开始Ⅲ期临床试验,遗憾的是1997年1月Regenenon-Amgen宣布没有证明BDNF对ALS患者临床有效,即在治疗组和对照组的呼吸能力或存活时间之间没有显示出统计学意义或临床差异。Glaser载文认为,神经生长因子的有效作用在ALS症状出现时可能已经太晚,营养因子只能对病变的(sick)而不是濒临死亡的(moribund)的运动神经元起作用[26],这些结论可以从SOD敲除(knockout)小鼠的试验数据中得出。BDNFⅢ期临床试验的失败还可能与皮下给药途径有关,Amgen公司亦在探索对ALS脊液内直接给药。人们还期望在治疗某些疾病,比如外周神经萎缩(包括糖尿病神经萎缩)帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病以及神经损伤[27]等方面,通过单独或联合用药起到一定作用。

4　基因工程研究现状

人BDNF天然含量极低,每千克组织仅可提取得到微克水平的BDNF,而至今又未找到丰富的组织来源,因此,通过基因工程手段获取BDNF成为这类研究的关键之一。国外的研究状况是:¹19年,Leibrock首次克隆并在猴肾COS细胞表达pBDNF[8];º1991年Rosenthal等在CHO细

胞中表达hBDNF[7],经过阴离子DEAE柱、阳离子S-Sepharose柱,以及S-300Sephacryl凝胶柱和C4反相HPLC,最终得到纯度大于95%的rhBDNF,得率50Lg/LEC50为1ng/ml;Ku󰀁sel在人胚胎肾细胞中表达rhBD-NF[18],5升培养液仅纯化得到1LgBDNF;在哺乳动物细胞中表达真核基因,能得到近似天然蛋白的目的产物,特点是产量太低;»用昆虫细胞表达系统,Meyer在sf-21细胞表达[14],经过CM-Sepharose柱和C4反相HPLC纯化得到EC50为44pg/ml的mBDNF100～150Lg/L;Negro在sf-9细胞表达[34],经过S-Sepharose柱和C8反相HPLC纯化得到2mg/LrBDNF;用昆虫细胞表达系统能得到较高产量的目的蛋白。对BDNF来说,由于成熟的BDNF蛋白没有糖基化,避免了昆虫细胞与哺乳动物细胞的糖基化差异,及可能造成的对人体免疫原性的差异;¼1992年,Neguolt等首次在原核系统大肠杆菌BL21(DE3)中表达mBDNF[11],T7启动子,IPTG诱导,表达水平25%,纯化、复性后仅得到100Lg/L;½1995年,Fukuzono等构建了一株rBDNF的重组大肠杆菌[12],受体菌HB101,分泌型载体,Trp启动子,色氨酸诱导,表达产物仍主要以包含体形式(80%)存在,从包含体纯化每升菌液约得180LgrBDNF,EC50为2ng/ml,从破菌上清纯化每升菌液可得EC50为30pg/ml的rBDNF3.4Lg。从目前的研究进展看,动物细胞表达系统得到的目的蛋白或者大肠杆菌系统以可溶形式表达的蛋白活性较高。但动物细胞培养条件要求高,产率低,成本高;而大肠杆菌表达系统本身较成熟,易培养、成本低,对大规模生产更有利,但是必须解决复性问题。

6　结语

外伤、疾病、中毒、老化等因素都会造成中枢或外周神经系统损伤使人致残,而临床医学至今尚少有效防治手段。神经营养因子的发现似乎是给患者在黑暗中露出的一丝曙光,但由于神经系统本身的特殊性和复杂性,包括神经元细胞的特殊性和血脑屏障等使得临床研究的道路不平坦。科学工作者们正在努力进行神经因子及相关领域的研究,以期给患者带来真正的福音。

参考文献

1　CowanWM,FawcettJW,O′LearyDDMetal.Regressive

eventsinneurogenesis.Science,1984,225:1258

2　YipK,JohnsonJEM.Developingdorsalrootganglionneurons

requiretrophicsupportfromtheircentralprocesses:evidenceforaroleofretrogradelytransportednervegrowthfactorfromthecentralnervoussystemperiphery.ProcNatlAcadSciUSA,1984,81:6245

3　周廷冲.多肽生长因子基础与临床.北京:中国科学技术出版社,

1992.26～27

4　HoferMM,BardeYA.Brain-derivedneurotrophicfactorpre-ventsneuronaldeathinvivo.Nature,1988,331:2615　临床研究现状及前景

目前,国外开发BDNF比较引人注目的是Amgen和Regeneron两家公司的合作,他们从1990年开始合作。早期的动物试验证明,BDNF用于新生大鼠被切断的骨神经时,可防止这种切割后通常出现的运动神经元的大量死亡;在鸡胚内BDNF可防止由细胞程序性死亡(programmedcell牟芝蓉:脑源性神经营养因子及其临床研究进展

5　JohnsonJE,BardeYA,SchwabMetal.Brain-derivedneu-rotrophicfactorsupportsthesurvivalofculturedratretinalganglioncells.JNeurosci,1986,6:3031

6　BardeYA,EdgarD,ThoenenH.Purificationofanewneu-rotrophicfactorfrommammalianbrain.EMBOJ,1982,1:97　RosenthalA,GoeddelDV,NguyenTetal.Primarystructure

andbiologicalactivityofhumanbrain-derivedneurotrophicfac-tor.Endocrinology,1991,129:12

8　LeibrockJ,LottspeichF,HohnAetal.Molecularcloning

andexpressionofbrain-derivedneurotrophicfactor.Nature,19,341:1499　TimmuskT.

Identificationofbrain-derivedneurotrophic

factorpromoterregionsmediatingtissue-specific,axotomy-,andneuronalactivity-inducedexpressionintransginicmice.JCellBiol,1995,128:185

10　ChristineA,KendallS,RobertAetal.Recombinanthuman

brain-derivedneurotrophicfactor(rHuBDNF)disulfidestruc-tureandcharacterizationofBDNFexpressedinCHOcells.IntJPeptideProteinRes,1993,41:8

11　NegroltA,CorsatV,MorettoCetal.Synthesisandpurifica-tionofbiologicallyactiveratbrain-derivedneurotrophicfactorfromEschericacoli.BiochemBiophyResCom,1992,186:155312　FukuzonoS,FujimoriK,ShimizuN.Productionofbiologically

activematurebrain-derivedneurotrophicfactorinEschericacol-i.BiosciBiotechBiochem,1995,59:1727

13　RadziejewskiS,RobinsonRC,DiStefanoPSetal.Dimeric

structureandconformationalstabilityofbrain-derivedneu-rotrophicfactorandneurotrophin-3.Biochemistry,1992,31:443

14　MeyerSL,LangDM,ForbesMEetal.Productionand

CharacterizationofRecombinantMouseBrain-DerivedNeu-rotrophicFactorandRatNeurotrophin-3ExpressedinInsectCells.JNeurochem,1994,62(3):825

15　PhiloJS,RosenfeldR,ArakawaTetal.Refoldingofbrain-de-rivedneurotrophicfactorfromGuanidineHydrochloride:Kinet-ictrappinginacollapsedformwhichisincompetentfordimer-ization.Biochemistry,1993,32:10812

16　PattersonSL,AbelT,DeuelTASetal.RecombinantBDNF

rescuesdeficitsinbasalsynaptictransmissionandhippocampalLTPinBDNFKnockoutmice.Neuron,1996,16:113717　HellwegR,Jockers-Scher󰀁blM.Neurophicfactorsinmemory

disorders.LifeScience,1994,55:2165

18　Kn󰀁selB,WinslowJW,RosenthalAetal.Promotionofcen-tralcholinergicanddopaminergicneurondifferentiationbybrain-derivedneurotrophicfactorbutnotneurotrophin-3.ProcNatlAcadSciUSA,1991,88:961

19　HymanC,HoferM,BardeYAetal.BDNFisaneurotrophic

factorfordopaminergicneuronsofthesubstantianegra.Na-ture,1991,350:230

・151・

20　BsrbacidM.StructuralandFunctionalPropertisofteTRK

FamilyofNeurotrophinReceptors.AnnNYAcadSci,1995,Sep:442

21　BlanquetPR,LamourY.Brain-derivedneurotrophicfactor

increasesCa2+/Calmodulin-dependentproteinkinase2activityinHippocampus.JBiolChem,1997,270:24133

22　GlassDJ,YancopoulosGD.Theneurotrophinsandtheir

riceptors.TrendsCellBiol,1993,3:262

23　KleinR.Roleofneurotrophinsinmouseneuronaldevelop-ment.FASEBJ,1994,8:738

24　SuenPC,WuK,LevineESetal.Brain-derivedneurotrophic

factorrapidlyenhancesphosphorylationofthepostsynapticN-methyl-D-aspartatereceptorsubunitlProcNatlAcadSciUSA,1997,94:8191

25　Biotech.News,1993,2(12):4

26　GlaserV.ALSclaimsanothervictim.NatureBiotech,1997,

15:212

27　Novikova,NovikovL,KellerthJO.Brain-derivedneurotrophic

factorreducesnecroticzoneandsupportsneuronalsurvivalafterspinalcordhemisectioninadultrast.NeurosciLett,1996,220:203

28　RiazSS,TomlinsonDR.Neuotrophicfactorsinpiripheralneu-ropathiespharmacologicalstrategies.ProgNeurobiol,1996,49:125

29　CelleriooA,MaffeiL.Theactionofneurotrophinsinthe

developmentandplasticityofthevisualcortex.ProgNeurobi-ol,1996,49:53

30　PringleAK,SundstromLE,WildeGJCetal.Brainderived

neurotrophicfactor,

butnotneurotrophin-3,preventsis-chaemia-inducedneurolcelldeathinorganotypicrathippocam-palslicesultures.NeurosciLett,1996,211:203

31　KorhonenL,RiikonenR,NawaHetal.Brain-derivedneurotro-phicfactorisincreasedincerebrospinalfluidofchildrensuffer-ingfromasphyxia.NeurosciLett,1998,240:151

32　GarnerAS,MenegayHJ,BoeshoreKJetal.Expres-sionof

TrkBreceptorisoformsinthedevelopingavianvisualsystem.JNeurosci,1996,16(5):1740

33　HeraogKH,vonBartheldCS.Contributionsoftheoptictec-tumandtheretinaassourcesofbrain-derivedneurotrophicfac-torforretinalganglioncellsinthechickembryo.JNurosci,1998,18(8):21

34　NegroA,TavellaA,GrandiCetal.Productionandcharacteri-zationofrecombinantratbrain-derivedneurotrophicfactorandneurotrophin-3frominsectcells.JNeurochem,1994,62:47135　Meyer-FrankeA,KaplanMR,PfriegerFWetal.Charact-erizationofthesignalinginteractionsthatpromoteinsurvivalandgrowthofdevelopingretinalganglioncellsinculture.Neu-ron,1995,15(4):805

(1999-02-14　收稿)