重庆医学２Ｏｌ４年１月第４３卷第２期 １４７ 论著・临床研究 人真皮成纤维细胞诱导分化研究 郭常敏，王达利△，魏在荣 （遵义医学院附属医院烧伤整形外科，贵州遵义５６３０９９） 摘 要：目的 体外分离培养人包皮成纤维细胞（ＨＦＦ），探讨其成骨、成脂、成软骨分化潜能，为骨创伤或其他修复治疗提供 新的种子细胞来源。方法 采用机械法结合酶消化法分离、培养ＨＦＦ。取第３代细胞用免疫细胞化学法检测其波形蛋白（Ｖｉｍ— ｅｎｔｉｎ）和角蛋白１９（ＣＫ１９）的表达。通过向成骨、成脂、成软骨细胞诱导分化（诱导培养基根据说明书配制），鉴定其多向分化潜 能。结果 原代细胞２４ ｈ内完全贴壁，细胞形态不规则，多为圆形或多角形，传代后细胞形态均一，基本为长梭形，鱼群样、漩涡 样生长。免疫细胞化学结果显示该细胞表达Ｖｉｍｅｎｔｉｎ，不表达ＣＫ１９，经诱导可以向成骨、成脂、软骨细胞方向分化。结论组织工程学提供理想种子细胞。 关键词：成纤维细胞 真皮；波形蛋白 角蛋白１９；诱导分化 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１ ８３４８．２０１４．０２．００７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１ ８３４８（２０１４）０２—０ｌ４７ ０３ ＨＦＦ 在特定条件能多向分化，其本身也参与骨折愈合的全过程，加之来源方便，增殖能力强，有望为骨折或较大骨缺损患者修复治疗及 Ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｕｏ Ｃｈａｎｇｍｉｎ，Ｗａｎｇ Ｄａｌｉ ，Ｗｅｉ Ｚａｉｒｏｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｕｒｎｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｚｕｎｙｉ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ５６３０９９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＨＦＦ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒ。ｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｎｅｗ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｓｅｅｄ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ｔｒａｕｍａ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｒｅｐａｉｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｍｅｔｈａｎｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ＨＦＦ．Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ ＣＫ１ ９ ｂｙ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ． Ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ，ａｄｉｐｏｂｌａｓｔ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔ（ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎ— ｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ），ｔｈｅ ｍｕｌｔｉ—ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｉｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｗｉｔｈｉｎ ２４ ｈ，ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｈａｐｅｓ ｗｅｒｅ ｉｒｒｅｇｕｌａｒ，ｍｏｓｔ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｒｏｕｎｄ ｏｒ ｐｏｌｙｇｏｎａｌ，ａｆｔｅｒ ｐａｓｓａｇｅ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｈａｐｅｓ ｗｅｒｅ ｕｎｉｆｏｒｍ，ｕ— ｓｕａｌｌｙ ｌｏｎｇ ｓｐｉｎｄｌｅ－ｓｈａｐｅ，ｇｒｅｗ ｉｎ ｆｉｓｈ ｓｈｏａｌ—ｌｉｋｅ ａｎｄ ｓｗｉｒｌ—ｌｉｋｅ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ ｎｏｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＣＫ１９．Ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃ ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，ａｄｉｐｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＨＦＦ ｃａｎ ｍｕｌｔｉ—ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｕｎｄｅｒ ｃｅｒｔａｉｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ｗｈｉｃｈ ｉｔｓｅｌｆ ａｌｓｏ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｆｒａｃｔｕｒｅ ｈｅａｌｉｎｇ，ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉ— ｔｙ，ＨＦＦ ｉｓ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｉｄｅａｌ ｓｅｅｄ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｐａｉｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｆｒａｃｔｕｒｅ ｏｒ ｌａｒｇｅｒ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ｄｅｒｍｉｓ；Ｖｉｍｅｎｔｉｎ；ｋｅｒａｔｉｎ－１９；ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ 真皮成纤维细胞是来源于中胚层间质细胞的终末分化细 胞［＿１ｊ，分布广泛，取材方便，是创伤修复中的主要细胞之一 ］。 ０．１２５ 胰蛋白酶～０．０２ 乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）购自美国 Ｓｉｇｍａ公司，完全培养液（Ｌ—ＤＭＥＭ培养液中含１Ｏ 胎牛血 清、１ Ｌ一谷氨酰胺、１００ ｕ ｍＬ的青霉素、链霉素）购自美国 Ｇｉｂｉｃｏ公司。免疫细胞化学小鼠抗人波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、角 蛋白１９（ＣＫ１９）单克隆抗体、二步法抗兔（鼠）通用型免疫组织 化学试剂盒购自基因科技（上海）有限公司，成骨、成脂、成软骨 细胞诱导培养基购自美国Ｃｙａｇｅｎ公司。 １．３细胞分离培养 于超净台中将包皮组织用含１００ Ｕ／ｍＬ 双抗的磷酸盐缓冲液（【）ＩＰＢＳ）清洗３～５次，剪切成５ ｍｍ左右 的组织片，用０．４ 的中性蛋白酶于３７℃消化２５～３０ ｍｉｎ，剪 去表皮及皮下组织，将真皮组织剪为糊状后用０．４ Ｉ型胶原 酶３７℃水浴摇床中消化２ ｈ，完全培养基终止消化，２００目钢 之前普遍认为真皮成纤维细胞没有分化潜能，只能用于皮肤移 植等简单的创面修复，近来有相关研究表明真皮成纤维细胞在 特定条件下可以向成骨、成脂、成软骨、胰岛细胞、心肌细胞等 方向分化。Ｈａｎｎａ等 的动物实验已经证明真皮成纤维细胞 可以作为诱导性多潜能干细胞（ｉＰＳ）的种子细胞用于治疗镰刀 形红细胞贫血。本实验选取人包皮成纤维细胞作为研究对象 并对其进行免疫学鉴定及成骨、成脂、成软骨细胞方向诱导分 化，以期为骨创伤或组织工程学种子细胞的来源提供稳定的诱 导培养体系。 １材料与方法 １．１标本来源经患者及家属知情同意，无菌条件下取本院 网过滤，１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，倒掉上清，加入完全培养基 重悬细胞，按２×１０ ／ｃｍ 的密度接种于７５ ｍＬ培养瓶中，放 附属医院泌尿外科正常成年男性包皮环切术后废弃包皮组织。 患者无其他器质性疾病。 １．２主要实验试剂０．４ Ｉ型胶原酶、０．４ 中性蛋白酶、 置于含５ ＣＯｚ、３７。Ｃ饱和湿度孵箱中培养。首次换液在培养 ２４ ｈ后，以后每隔２～３ ｄ换液１次。待原代细胞生长融合达 ＊ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１０６０１５ ７）。 作者简介：郭常敏（１９８７一），医师，在读硕士研究生，现工作于成都市第五人民医 院。 通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｄａｌｉｗａｎｇｚｙ＠ｓｉｎａ．ＣＯＮ。 重庆医学２０１４年１月第４３卷第２期 ２．２ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和ＣＫ１９的表达细胞免疫化学法检测真皮成 纤维细胞特异性标志物Ｖｉｍｅｎｔｉｎ表达阳性，对照组为阴性， ＨＦＦ不表达表皮细胞特异性标志物ｃＫ１９，见图３。 ２．３体外诱导ＨＦＦ细胞向成骨、成脂、成软骨细胞分化向 成骨方向诱导：成骨诱导１周可见钙盐及钙结节出现，随着诱 导时间延长，钙盐沉积增加。诱导培养至３周末进行茜素红染 色可见细胞外基质中存在大量钙结节（图４Ａ）。向成脂方向诱 导中：成脂诱导中细胞体积逐渐变大，至１周左右出现小脂滴， 随着诱导时间延长脂滴增多，３周末出现脂肪细胞，油红Ｏ染 色阳性（图４Ｂ）。向成软骨诱导：见细胞团块由之前的２ ｍｍ 增加至３．５ ｍｍ左右，经包埋、切片，阿利辛蓝染色阳性（图 ４Ｃ）。 ３讨 论 骨折是最简单最常见的骨创伤，其最常见的愈合过程经血 肿形成期、纤维骨痂形成期、骨性骨痂形成期、改造塑形期几个 阶段，成纤维细胞参与骨折愈合的全过程，发挥了极其重要的 作用［４］。并且，在骨折愈合后骨断端却没有瘢痕形成，不存在 成纤维细胞，因此有学者推断成纤维细胞有可能分化成了骨细 胞，成纤维细胞可能也具备多向分化潜能。 成纤维细胞起源于间充质细胞，主要存在于体内疏松结缔 组织中，广泛分布于人体，在组织创伤修复中起主要作用。成 纤维细胞取材方便，体外培养增殖能力强，不易老化，被视为有 效且数量大的“种子细胞库” ］。以往的观点认为成纤维细胞 是终末分化细胞，不具备多向分化潜能，科学家们将成纤维细 胞作为种子细胞，利用导入基因的方法产生诱导多能干细胞。 ２００７年Ｏｋｉｔａ等 ］、Ｙｕ等 分别将Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ—Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４基 因和Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８基因导人真皮成纤维细胞，成 功诱导出多能干细胞，此后众多科学家将不同的基因组合导入 成纤维细胞，添加不同试剂，使多能干细胞转化率和有效性明 显提高ｌ８］。目前对成纤维细胞的认识和应用又达到一个新的 层面，Ｂｒｅｎｄｅｌ等 的研究表明，成纤维细胞在一定条件下可 以向其他细胞分化，具有多向分化潜能。最近，有更多的学者 发现成纤维细胞的多向分化潜能，Ｃｈｅｎ等 ～一的报告也表明成 咖～一ｍｓ 一二～一ｂ霎 ］¨州一～ 桃一纤维细胞能够分化成其他细胞。Ｙａｍａｎａｋａｌ１ 的实验也证实 成纤维细胞能够向三胚层组织细胞分化。上述实验均已经证 明成纤维细胞具有多向分化潜能。因此，当骨折较严重或骨折 块缺损时就可以用成纤维细胞诱导分化成骨以取代自体骨或 异体骨移植，从而减少手术创伤和排斥反应，目前所面临的问 题是成纤维细胞在怎样的环境下可以诱导分化为成骨、成脂、 成软骨等细胞，为了探讨这一问题，进行了本实验。 本实验分离出的ＨＦＦ细胞为贴壁生长的长梭型细胞，贴 壁２４ ｈ后以多角形为主，细胞体积较小，贴壁３ ｄ以后及传代 后体积较大，胞质丰富，胞核清晰，呈漩涡状或鱼群状生长。 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ作为成纤维细胞的相对特异性标志 ，通过免疫细 胞化学法对其鉴定呈阳性表达，而表皮细胞的标志物ＣＫ１９不 表达，说明分离出的细胞为成纤维细胞。根据Ｈｅｎｇ等 Ｊ、 ｔｅｎｎｉｎｇ等［１ ］、Ｅｓｔｅｓ等 “ 的研究表明成软骨细胞的诱导需要 添加地塞米松、ＴＧＦ－￣、抗坏血酸以及ＢＭＰ ６等。邓丹等 对 脂肪来源干细胞的研究中也提到相关诱导液的添加物，本课题 组前期研究中 ” 亦用到诱导培养基。本实验参照干细胞诱导 分化研究，进行多向诱导分化。所用诱导培养基均为市场所 售，根据说明书具体配制，应用即可。参照干细胞的诱导条件 对ＨＦＦ细胞进行３周的成骨、成脂和成软骨诱导分化，分别用 茜素红、油红Ｏ和阿利辛蓝进行染色，结果呈阳性，说明培养 体系成立，为骨创伤或组织工程修复种子细胞的来源提供了一 ｌ４９ 定的科学基础。成软骨诱导培养过程中，需注意勿将细胞团块 摇散，每次换液前加入ＴＧＦ／３３，成脂诱导过程中注意两种培养 基不同成分勿混淆，整个细胞培养过程中严格注意操作，防止 污染。 创伤和烧伤是日常生活常见的皮肤损伤，愈合后常留有瘢 痕，影响患者功能、美观，造成心理压力。本实验进行了向成 骨、成脂、成软骨方向的诱导分化，其他实验也未见诱导成纤维 细胞向上皮细胞分化，如果提供特定的微环境，真皮成纤维细 胞是否可以向上皮细胞分化。如果可以，皮肤组织损伤则可以 达到无瘢痕愈合，为瘢痕的治疗提供新的希望和前景。 参考文献 一～眦ａ ｅｏｍｐｅ～一～一剐 —ｔ一ｅｎｔｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｅｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２００７，４４８（７１５１）：３１３－３１７．［７］ Ｙｕ Ｊ，Ｖｏｄｙａｎｉ 一Ｓ ｋ Ｍ，Ｓｍｕｇａ—Ｏｔｔｏ Ｋ，ｅｔ一～一一 一 ～一ｌ重ｇ ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏ— ｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８）：１９１７ １９２０． ［８］ 施昱晟，顾呜敏．诱导多能干细胞的研究现状及应用前景 ［Ｊ］．诊断学理论与实践，２０１２，１１（３）：３１２ ３１６． ［９］ Ｂｒｅｎｄｅｌ Ｃ，Ｋｕｋｌｉｃｋ Ｌ，Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｏ。ｅｔ ａ１．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｃＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒ— ｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ９ ６００ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ，２００５，１２（４／５／ ６）：２４５－２５７． ［１ｏ］Ｃｈｅｎ ＦＧ，Ｚｈａｎｇ ＷＪ，Ｂｉ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ （一）ｖｉｍｅｎｔｉｎ（＋）ｔｒｍｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ ２８８３． ［１１］Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｆｏｕｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｐｍｌｉｆ，２００８，４１ Ｓｕｐｐｌ １：５１－５６． ［１２７杨志明．组织工程学［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００２： １５５—１５８． ［１３］Ｈｅｎｇ ＢＣ，Ｃａｏ Ｔ，Ｌｅｅ ＥＨ．Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ ｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｅ ｌｉｎｅａｇｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２００４，２２（７）：１１５２—１１６７． （下转第１５１页） 一～重庆医学２０１４年１月第４３卷第２期 面积收缩率大于或等于９Ｏ 时，判断为创面愈合 。 １．４统计学处理采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行统计学分析。计 察创面面积收缩率发现观察组创面愈合的速度明显优于对照 组，这说明持续利福霉素溶液冲洗创面，可始终保持药液在创 面的有效浓度，持续发挥杀菌作用。反观对照组，创面的利福 霉素药液会很快被外层敷料吸附及渗出液稀释，而迅速降低， 不能发挥持续的杀菌作用。 量数据以 ± 表示。干预前创面面积指标比较，方差齐时采 用单因素方差分析，方差不齐时采用Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ检验分 析。干预后的各项检测指标的组间比较进行重复测量方差分 析。Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。 ２结 果 综上所述，封闭负压引流和利福霉素联合干预疗法可迅速 地增加创面血流量、提高创面血管化程度，减轻炎性反应，显著 促进溃疡型淋巴结核创面的愈合，具有广泛的临床应用前景。 参考文献： 干预期间，观察组各时相点创面收缩率均显著高于对照 组，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。实验第３Ｏ天时，观察组创 面达愈合标准。见表１。 表１ 创面面积收缩率变化情况｛ ±５， 一３９） ［１］田磊，徐宁．病灶清除加腔内填塞换药治疗脓肿、溃疡型 淋巴结核［Ｊ］．临床军医杂志，２００９，３７（５）：８８４—８８５． ｎｇ ［２］ Ｓｅｍｅｎｚａ ＧＬ．ＨＩＦ １ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ ｓｅｎｓｉ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ（）ｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００１，１３（２）：１６７ ｌ７１． 观察组 ２５．７ｌ－＿－－ｂ１．６９ ５１・２７￣２・７９ ７４・４５±３・３６ ９３・３３±１－９６ ＿ｒ３］ Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｗ，Ｓｔｒｅｃｋｅｒ Ｗ，Ｂｏｍｂｅｌｌｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｖａｃｕｕｍ ｓｅａｌｉｎｇ ａｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｏｐｅｎ ｆｒａｃ 对照组 ｌ５．０２±１．０６ ３２．１８±１．２９ ５１．５３±１．６４ ６６．７６士２．０２ ｔｕｒｅｓＥＪ］．Ｕｎｆａｌｌｃｈｉｒｕｒｇ，１９９３，９６（９）：４８８ ４９２． ３讨 论 ｒ４］Ｍｏｒｙｋｗａｓ ＭＪ，Ａｒｇｅｎｔａ ＬＣ，Ｓｈｅｈｏｎ Ｂｒｏｗｎ Ｅ１，ｅｔ ａ１．Ｖａｃ— ｋｌＵｍ—ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｌｏｓｕｒｅ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＷＯＵｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ 溃疡型淋巴结核由于脓腔壁与周围正常组织粘连较重，且 与脓腔相连的窦道具有深、长、多的特点，如需完全彻底清除病 灶，患者将承受手术范围大、组织损伤程度重、易伤及神经血管 ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ａｎｉｍａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ，１９９７，３８（６）：５５３ ５６２． 等风险，因此临床上一般不主张手术治疗［７ 。目前对溃疡型淋 巴结核的治疗多采用早期积极抗结核治疗及全身支持治疗，后 期局部脓腔穿刺抽液及腔内注入异烟肼、链霉素等疗法，但此 ［５］Ａｒｇｅｎｔａ ＬＣ，Ｍｏｒｙｋｗａｓ ＭＪ．Ｖａｃｕｕｍ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｌｏｓｕｒｅ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｗｏｕｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘ— ｐｅｒｉｅｎｃｅ［Ｊ￣．Ａｎｎ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ，１９９７。３８（６）：５６３—５７６． ［６］邓贱晚，王维平．创面封闭负压引流技术促进伤口愈合的 作用机制研究进展［Ｊ］．中山大学研究生学刊：自然科学、 医学版，２００４，２（２）：ｌ一７． 方法因为结核病灶未清除，留有残腔，局部引流不完全，且易合 并感染，很难取得满意效果＿８ 。 封闭负压吸引技术是一种利用负压吸引装置与医用高分 子泡沫材料连接，间歇地或持续地在创面处产生低于大气压的 压力，从而促进创面愈合的物理疗法，具有疗效明显、操作简便 ［７］张自鹏，陈绍宗，李学拥，等．封闭负压引流联合局部给氧 治疗兔耳缺血性创面的实验研究［Ｊ］．现代生物医学进 展，２Ｏ１ｌ，１１（１０）：１８５１ １８５４，１８７６． 和成本低廉等优点，在慢性难愈性创面治疗中得以广泛应 用 。本研究结果表明，观察组创面收缩率显著高于对照组 （Ｐ＜０．０１），说明封闭负压吸引技术对溃疡型淋巴结核创面的 ［８］彭卫生．新编结核病学［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社， １９９４． 愈合具有显著的促进作用，其原因在于封闭负压吸引技术对创 面及创周组织的血流量和组织缺氧程度的影响不同。郑敏 等 在对猪的新鲜和肉芽创面模型研究时发现，持续负压下 局部血流量迅速增加，峰值可达到基线血流的４倍。同时，封 ［９］马玛，朱莉贞，潘毓萱．结核病［Ｍ］．北京：人民卫生出版 社，２００６． ［１Ｏ］郑敏，甘秀妮．局部氧疗联合封闭负压引流对豚鼠Ⅲ期压 疮创面愈合的影响究［Ｊ］．上海交通大学学报：医学版， ２０１２，３２（７）：９１１ ９１６． 闭负压吸引技术可降低创面氧分压，在创面周围形成局部缺氧 环境，迅速诱导血管内皮生长因子ｍＲＮＡ的表达 ，促进血 管生长，增加创面血供，利于组织修复。显然，这些因素决定了 ［１１］许龙顺，陈绍宗，乔骋，等．负压对创面血流量的影响［Ｊ］． 第四军医大学学报，２０００，２１（８）：９７６—９７８． 观察组创面愈合的速度优于对照组。 利福霉素是一种强效抗结核药物，具有高效杀灭结核杆菌 的作用。局部使用利福霉素，药物浓度高，可有效杀灭局部组 织及渗出物中的结核杆菌，消除炎性反应＿］ 。本研究通过观 ［１２］莫晨玲．利福霉素钠胸腔内注射治疗结核性胸膜炎疗效 观察［Ｊ］．实用新医学，２００９，１０（８）：３２１—３２２． （收稿日期：２０１３－０９ ２０修回日期：２０１３ ｌＯ ２４） （上接第１４９页） ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ６［Ｊ １．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２００６，５４（４）：１２２２—１２３２． ［１４］Ｈｅｎｎｉｇ Ｔ，Ｌｏｒｅｎｚ Ｈ，Ｔｈｉｅｌ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎ— ｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｃｏｒｒｅ— Ｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｌｔｅｒｅｄ ＴＧＦｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＢＭＰ ｐｒｏｆｉｌｅ ［－１６］邓丹，刘伟，曹谊林．脂肪来源干细胞的特性鉴定［Ｊ］．组 织工程与重建外科杂志，２００９，５（５）：２９５ ２９７． ａｎｄ ｉｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂｙ ＢＭＰ一６ ＥＪ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７，２１１ （３）：６８２—６９１． ［１７］王达利，朱晶晶，邓呈亮，等．人瘢痕疙瘩来源干细胞的生 物学特性鉴定［ｊ］．中华烧伤杂志，２０１１，２７（３）：２１０ ２１４． （收稿日期：２０１３ ０９—１９修回日期：２Ｏｌ３－１卜０２） ｒ１５］Ｅｓｔｅｓ ＢＴ，Ｗｕ ＡＷ，Ｇｕｉｌａｋ Ｆ．Ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｎ— ｄｒｏｃｙｔｉｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｕｈ
