实验三_小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取

一、实验目的

1、了解小鼠淋巴结的分布特点

2、熟练掌握小鼠淋巴细胞分离技术和显微观察技术

二、实验原理

淋巴结是外周免疫器官，位于淋巴管汇集部位，是淋巴细胞定居和特异性免疫应答发生的场所。淋巴结遍布全身，其中以颈部、腋下、腹股沟，肠系膜淋巴结最容易分离，是获取淋巴细胞的主要组织之一。小鼠颈部和腋下淋巴结分布如图3 所示。淋巴结内，T 细胞占淋巴细胞总数的75％，B 细胞占25％。

三、实验仪器和试剂

1、仪器设备

显微镜、玻片、解剖台、大头针、摄子、剪刀、玻璃平皿、微量移液器、注射器、离心管、筛网等

2、试剂和材料

（1）实验小鼠 （2）生理盐水 （3）75%酒精

四、实验步骤

1、杀鼠：将小鼠颈椎脱臼法处死，75%酒精喷表面，用大头针将鼠四肢固定在解剖台上。

2、分离淋巴结：用剪刀剪开小鼠皮肤，钝性剥开皮肤，仔细寻找小鼠取颈部和腋下淋巴结，并用镊子取下淋巴结，将淋巴结置于盛有3mL 生理盐水的玻璃平皿中。

3、淋巴结淋巴细胞的分离：

（1）淋巴结处理：将淋巴结转移到筛网上，筛网置于原玻璃平皿中，用5mL 注射器内芯轻轻研磨淋巴结，不断从平皿中吸取生理盐水冲洗筛网。

（2）移开筛网，将平皿内的细胞收集于2 个1.5mL 离心管中。

（3）3000rpm 室温离心3min，弃上清。

（4）加入20～100μL 生理盐水，重悬沉淀。

4、显微观察：取出10μL 细胞悬液滴在干净干燥的玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察分离到的淋巴细胞。

五、注意事项

1、要按正确的方法抓小鼠和处死小鼠，避免被小鼠伤害。

2、注意区分淋巴组织和其他组织，取到的淋巴结要足够，至少三个。

3、用注射器内芯研磨淋巴结时，力度一定要准确，避免破坏淋巴细胞。

4、冲洗筛网要干净，避免淋巴浓度过低。

5、装玻片时要记得盖上盖玻片，观察时从低倍镜到高倍镜。

六、结果分析

试验结果如图所示

图中气泡状的小圆点就是淋巴细胞。淋巴细胞布满这个视野，呈均匀分布，且没有其他的杂质细胞，说明试验过程很成功。

七、问题讨论

1、找不到小鼠的淋巴结是什么原因?

答：①没有找到淋巴结所在的正确位置。淋巴结遍布全身，其中以颈部、腋下、腹股沟，肠系膜淋巴结最容易分离 ②小鼠的淋巴结数量小而少，而且比较隐蔽，跟脂肪组织比较相似，难以区分。

2、找不到淋巴结还可以在小鼠哪个部位找到淋巴细胞？

答：淋巴细胞由淋巴器官产生。淋巴器官根据其发生和功能的差异，可分为中枢淋巴器官（又名初级淋巴器官）和周围淋巴器官（又名次级淋巴器官）两类。前者包括胸腺、腔上囊或其相当器官，后者包括脾、淋巴结等。