ａｙ ｏｆ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ，ｄｅｓｉｒａｂｌｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ ａｎｄ Ｓｅｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓｍｉｘｅｄ ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．ｔｈｅ ｅｔＴＯＩ葛ｉｓ ａｂｏｕｔ ｌ％ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｗｈｉｌｅ ａｂｏｕｔ ３％ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．（３）Ｅａｃｈ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｘｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｅｖｅｒｙ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｗａｙ，ｉｓｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｅｎｓｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｎ 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：原矽 口ｇ年乃月ｆ乒日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 签名：景磅 曙年易月ｌ酽日 第１章引言 第１章引言１．１氨基酸概述【１，２】 氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，其主要存在形式有两种：一种为游离态，主要存在于体液（如血液）和食品药品中；还有一种是结合态，主要存在于肽和蛋白质中。作为游离态的氨基酸是构建生物机体的众多生物活性大分子，是构建细胞、修复组织的基础材料，并且还是合成神经介质的不可缺少的前提物质。不同氨基酸在生物体中具有不同的作用，如色氨酸可转化生成人体大脑中的一种重要神经传递物质：精氨酸可以增加肝脏中精氨酸酶的活性，有助于将血液中的氨转变为尿素而排泄出去。此外，含有氨基酸的食品和药品也被大量生产，相关产品主要有食品补充剂，动物营养补充剂，临床营养制剂，氨基酸注射液，口服液等，其中氨基酸成分多为混合氨基酸。准确、快速地测定氨基酸的含量有重要的理论和实际意义。 ２０世纪初，费歇尔（Ｅ．Ｆｉｓｈｅｒ）等对氨基酸进行过系统阐述。构成一般蛋白质的氨基酸有２０种（半胱氨酸和胱氨酸另计），空间立体构型均属Ｌ一型，且均为。一氨基酸（即氨基连在与羧基直接相连ａ碳原子上）。ａ一氨基酸都是白色晶体，具有较高熔点（２００。Ｃ以上）。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。Ｑ一氨基酸通式见式（１．１）。 ￥矿Ｏ Ｒ—Ｃ—Ｃ一０Ｈ Ｉ Ｎ‟Ｈ２ （１．１） 大多数氨基酸在水中存在式（１．２）所示的电离平衡，在水溶液中，氨基酸的存在形式包括偶极离子、正离子和负离子三种。当氨基酸以偶极离子的形式存在时，分子所带电荷为零，氨基（一ＮＨ３）和羧基（－ＣＯＯＨ）的存在形式分别为一Ｈ
３盯和－－Ｃ００一，所以偶极离子形式的氨基酸在水中既可以作为质子供体，也可以作为质子受体，具有酸碱两性。而正离子形式的氨基酸可看作多元酸；同样，负离子形式的氨基酸可看作多元碱。 Ｈ，Ｎ＋一ｃＨ—ＣＯＯＨ当Ｈ，Ｎ＋一ｃｐ—ＣＯＯ一；兰塾兰Ｈ２Ｎ—ｃｐ—ＣＯＯ一 矗 矗 矗 Ｙ＋正离子 Ｙ„偶极离子 Ｙ„负离子 （１．２） 第ｌ章引言 式（１．２）中，各基团的表观离解常数按酸性减弱的顺序，以ｐＫａ－（即ｐＫｃｏｏＨ）、ｐＫａ：（即ｐ＾，Ｎ｝ｔ２）表示。当氨基酸分子所带的净电荷为零时，溶液的ｐＨ值为氨基酸的等电点（ｐＩ）。等电点下，两性离子正负电荷数值相等，氨基酸分子中一Ｈ３Ｎ＋基团和－－ＣＯＯ一基团的离解度相同，因此等电点值即氨基酸在等电点前后两个ｐＫａ值的算术平均值，各氨基酸的ｐＩ值参见表１．１。 表１．１氨基酸在水溶液中的离解常数（２５℃）„„“ 分类戛鬻缩写符号 脚 ｐ№ ３．６５ ９ ６７ ２ ７７酸性氨基酸委螽茎酸 ＡＧｓｈｐ ：嚣 ４．２５ ９．６７ ３．２２ 组氨酸 Ｈｉｓ １．８２ ６．０ ９．１７ ７．５９ ｌＯ．５３ ９ ７４碱性氨基酸赖氨酸 Ｌｙｓ ２．１８ ８．９５ 精氨酸 Ａｒｇ ２．１７ ９．０４ １２．４８ ｌＯ ７６ 丝氨酸 Ｓｅｔ ２ ２１ ９．１５ ５ ６８ 苏氨酸Ｔｈｒ ２．０９ ９．１０ ５．６０ 天冬酰氨 Ａｓｎ ２．０２ ８．８０ ５．４１ 谷氩酰氨 ＧｌｒＩ ２．１７ ９．１３ ５．６５ 酪氨酸Ｔｙｒ ２．２０ ９．１ｌ １０．０７ ５．６６ 半胱氨酸 Ｃｙｓ １．９６ ８．１８ １０．２８ ５．０７ 甘氨酸 Ｇｌｙ ２．３４ ９ ６０ ５．９７中性氨基酸霪茎墓 竺 爱 篙 篡 亮氨酸Ｌｃｕ ２．３６ ９ ６０ ５．９８ 异亮氨酸 １１ｅ ２．３６ ９ ６８ ６．０２ 苯丙氨酸Ｐｈｅ １．８３ ９．１３ ５．４８ 蛋氨酸 Ｍｅｔ ２．２８ ９ ２１ ５．７４ 脯氨酸Ｐｒｏ １．９９ １０．６０ ６ ３０ 色氨酸Ｔｒｐ ２．３８ ９．３９ ５ ８９ 氨基酸的分类形式有多种，根据其在中性溶液中侧链的解离状态，可分成酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸三类。其中，酸性氨基酸含有两个羧基一个氨基，在中性溶液中，羧基完全解离并呈酸性，分子带负电荷，其等电点ｐＩ＜３．５，因此可将酸性氨基酸看作酸；碱性氨基酸则含有两个氨基一个羧基，在中性溶液中这些基团可质子化并呈碱性，分子带正电荷，其ｐｌ＞７．５，因此将碱性氨基酸看作碱：而中性氨基酸一般只含有一个氨基和一个羧基，在中性水溶 ２ 第１章引言液中多以偶极离子形式存在，具有酸碱两性，其ｐＩ值在５～６．５间。综上，大多数氨基酸都呈现不同程度的酸性或碱性，所以既能与酸结合成盐，也能与碱结合成盐。在常见的２０中氨基酸中，属于酸性氨基酸的只有谷氨酸和天冬氨酸，而碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸三种，其余的都为中性氨基酸（具体见表１．１）。 此外，氨基酸也可按有机化合物分类法，分为脂肪烃氨基酸、芳香烃氨基酸和杂环烃氨基酸。在营养学上，氨基酸可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。并且还可根据氨基酸的侧链结构和极性对其分类，这里不做过多描述。１．２氨基酸的测定方法 氨基酸的测定在理论上和实际应用中都有重要的意义。目前，氨基酸的测定方法主要有：化学分析法、光谱分析法、电化学分析法和色谱分析法。下面对各类氨基酸的测定方法进行简要介绍。１．２．１化学分析法Ｈ１ 常采用的化学分析法是甲醛滴定法和凯氏定氮法。甲醛滴定法是利用氨基酸的氨基与甲醛反应，形成羟甲醛基衍生物从而降低了氨基酸的碱性，滴定终点在ｐＨ＝９附近，这是指示剂酚酞的变色范围。此法主要用于测定中性和碱性氨基酸，具有简便易行的优点，但由于滴定终点难以
把握，准确度较差。凯氏定氮法是通过测定样品中氮的总量，从而确定样品中含氮氨基酸或蛋白质的含量。该法准确度较高，但操作步骤复杂，试剂消耗量多，测定周期长。１．２．２光谱分析法 光谱分析主要包括紫外一可见分光光度法和荧光止夤舛确ǎ⑶以诎被岵舛ㄉ嫌薪瞎惴旱挠τ茫延欣没Ъ屏抗馄追ú舛ê钢职被峄旌弦旱睦樱?５１。紫外分光光度法是利用某些氨基酸具有较强的紫外吸收能力的性质（如酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸）进行测定，已有利用该法测定农药洗发水的混合物中半胱氨酸的报道【６１。一般适合紫外分光光度法测定的氨基酸中的Ｒ基团都含有苯环共轭双键系统，对紫外波有吸收。 荧光分光光度法是利用化学物质能产生荧光的特点进行分析测定的【７‟８１ ｏ一般可选择适当的衍生剂与氨基酸分子中的氨基、羧基或其他活性基团进行衍生 第１章引言化反应，形成能产生荧光的物质，即可通过相关仪器测定相应的求得氨基酸的含量。 光谱法测定氨基酸有快速方便准确的特点，但该法对所测氨基酸需具备相应的特征官能团，如紫外分光光谱法中的待测物需具备紫外吸收基团，因此该法的测定对象有较大局限性。１．２．３电化学分析法 电化学分析法测定氨基酸的主要方法包括直接电化学分析法和间接电化学分析法。直接电化学分析法是利用某些氨基酸在电极上氧化时所表现出的电活性进行测定，对于半胱氨酸等具有电活性的氨基酸可用此法进行测定【９·１０１。而对于其他没有电活性的氨基酸则采用间接电化学分析法，该法的基本思路是利用某些化学反应改善氨基酸的电活性，使其能满足电化学分析的要求。一般可采用衍生物与氨基酸反应，形成具有电活性的物质，通过测定这种物质的含量，推算出样品中氨基酸的含量；也可选择适当的金属离子与氨基酸形成电活性的配合物，提高氨基酸的检测灵敏度【“ｌ。另外也可采用电致化学发光分析测定氨基酸，其基本原理为：具有电致化学发光活性的物质处于一定电位时，与溶液中的氧化还原性物质相互作用，所形成的物质处于不稳定的激发态，当回到基态时，能量以光的形式释放出来，通过测定光强度即可推算出待测物质的含量。在电位滴定分析方面，由于氨基酸是弱酸，故通常采用非水滴定法进行测定【１”。１．２．４色谱分析法 色谱分析在氨基酸测定中也有诸多应用ｆＢ】，主要包括纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。其中纸色谱法采用不同的层析液和检测用显色剂，可对３０多种氨基酸及其衍生物进行分析，具有操作简单、分析效能较高、所需仪器设备廉价的优点。实际中，常利用硅胶等薄层板及相应的展开剂对氨基酸进行分离，然后分别采用紫外、荧光或可见光光度法进行检测。该法可对６０多种氨基酸及其衍生物进行分离分析，具有开快、分离效能高、灵敏度高、耐腐蚀的特点。 气相色谱法将所分析的氨基酸衍生为易于气化的物质，和质谱连用可测定多组分的混合氨基酸〔１４ｌ。液相色谱法中常用的有离子交换色谱，即利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子的性质，在阳离子交换柱中对其进行分离，将分离后 ４ 第１章引言的氨基酸进行衍生，产生在紫外可见光区内有吸收的物质，利用紫外可见光度检测器进行定量分析，具有准确、可靠、重现性好的优点，能测定大量氨基酸及其同系物。随着高效液相色谱法的发展，ＨＰＬＣ逐步占据了氨基酸分析仪市场的主导地位【１５】，近年来还出现了ＨＰＬＣ和质谱联用测定氨基酸的相关报道【Ⅷ。１．２．５其它测定方法 近几年来，随着科技的发展，越来越多的尖端技术被应用于各领域氨基酸的分析分离。如连续在线毛细管电泳测定氨基酸【１”，活性合成膜分离芳香族氨基酸四。此外还有关于电化学发光法四，量热滴定法，以及核
磁共振滴定法〔２０，２１】测定氨基酸的应用。并且根据情况，将适用于氨基酸的各测定方法联用具有更好的实用性，如毛细管电泳和荧光联用测定茶叶、饮料中的氨基酸【２”，ＨＰＬＣ和荧光联用测定氨基酸【２３〕等。１．３多元校正滴定法概述 多元校正滴定法又称为恒电位或恒ｐＨ滴定法，在滴定过程中，一般取等ｐＨ或等电位步长，即选取某一恒定间隔的ｐＨ或电位值记录滴定剂体积。１９８８年，Ｌｉｎｄｂｅｒｇ和Ｋｏｗａｌｓｋｉ首次将多元校正引入滴定分析中Ⅲ】，并由此产生了多元校正滴定法。 在实际应用上，当待测溶液只含有一种组分时，常采用单电位滴定法，即取某一电位或ｐＨ，配制一系列浓度的溶液，根据所选取的电位或ｐＨ处消耗的滴定剂的体积与待测物的浓度间的比例关系，便可算出待测溶液中该组分的浓度。这样的方法易于处理数据，但是只能测定单组分溶液。 当待测溶液含有多种组分时，则采用多电位滴定法。即选取一系列的电位或ｐＨ，在每个电位或ｐＨ处，所消耗的滴定剂的体积与待测物的浓度都存在着比例关系，据此便可计算出待测溶液中各组分的浓度。实际中，多电位滴定法也可用于测定单组分待测溶液。 多元校正滴定法最早用于极弱酸和极弱碱（Ｋａ或Ｋｂ＜１０。８）的ｐＨ滴定法中测定酸碱浓度吲。由于使用传统滴定方法测定酸或碱时，需要滴定曲线有明显突跃，而极弱酸和极弱碱的滴定曲线不会出现这种突跃，故多元校正滴定法是一个很好的选择【２６】。这种滴定法方法的优势在于它突破了传统滴定的限制，无需滴定曲线出现明显的突跃，不必考虑滴定过程中具体的化学反应，因而不需 第１章引言要建立具体化学反应的数学模型，仅通过电位滴定所得到的信息和数据就能够设法计算出待测物各组分的含量，用数学方法代替了繁琐费时的化学掩蔽和分离法。国内外很多学者如Ｎｏｓｚａｌ、Ｈａｒｄｃａｓｔｌｅ，、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、倪永年、朱仲良„２７－３２１等，在这方面做了许多工作，进一步完善和发展了多元校正滴定法的理论。 随着计算滴定分析化学的发展，多元校正滴定法在分析化学领域得到较广泛的应用，如被运用于配位滴赳３３－４０ｌ和沉淀滴定【“１，尤其适合测定金属离子，而且在环保领域也有应用〔４２】。 刘婷婷的硕士学位论文【４３１采用氢离子选择性电极，将多元校正滴定法应用于单组分以及双组分混合氨基酸溶液的测定，取得了较理想的效果。且实验步骤简单，成本低廉，无需大型仪器。１．４本文所做的工作 。１．４．１实验构想 文献〔４３】已在多元校正滴定法测定氨基酸方面做了较为系统的阐述，但存在的问题是，其仅利用了氨基酸的酸性，对大多数氨基酸只采用碱作为滴定剂，且基本上只考虑了直接滴定这一种滴定形式。既然前文中阐述过氨基酸在水中既可以作为质子供体，也可以作为质子受体，理论上既可以用碱滴定也可以用酸滴定，因此对于不同酸碱性质的氨基酸应考虑相应的最佳滴定形式。对于滴定形式而言，一般除了直接滴定，还可以在溶液中预先加入一定量的酸，然后用碱返滴定；或者在溶液中预先加入一定量的碱，然后再用酸返滴定。用碱返滴定氨基酸时，由于溶液中存在过量酸，氨基酸被完全质子化，此时氨基酸可被看作多元酸，存在多步电离，失去的质子个数增加，与碱反应的能力增强；同理，酸返滴定氨基酸时，由于溶液中存在过量碱，氨基酸分子上具有离解能力的氢质子均被离解，接受质子的个数相应的增多，与酸反应的能力增强。因此除了直接滴定形式，返滴定形式测定氨基酸也非常值得研究。本文将通过对不同的滴定形式的滴定结果进行比较分析，最终确定每种单组分和双组分氨基酸的最佳滴定形式。 对于单组分氨基酸溶液，根据１．１所阐述的各类氨基酸的酸
碱性，理论上可用酸或碱作为滴定剂，相应的直接滴定碱性或酸性氨基酸；中性氨基酸由于同时具有弱酸性和弱碱性，所以除了考虑用酸或碱直接滴定外，还应考查酸或碱 ６ 第１章引言返滴定的情况。 对于双组分混合氨基酸，根据其各组分氨基酸的酸碱性，其混合形式有多种，包括：酸性氨基酸＋酸性氨基酸、碱性氨基酸＋碱性氨基酸、酸性氨基酸＋中性氨基酸、碱性氨基酸＋中性氨基酸以及中性氨基酸＋中性氨基酸这五类混合形式。由于待测溶液所含的两种氨基酸的酸碱性有不同程度的差异，甚至可能两组分间也会发生反应，因而可以推测，对双组分氨基酸混合溶液用酸或碱直接滴定的情况较单组分的更为复杂。若采用返滴定的形式，可通过在待测溶液中预先加入酸或碱，调节溶液ｐＨ，使氨基酸的存在形式产生改变，接受或离解质子的能力增强，以期加大混合溶液中的各组分氨基酸与酸碱反应的差异性，达到最佳测定效果。因此对于双组分混合氨基酸的测定，需充分要充分考查每种滴定形式所得到的滴定曲线，才能确定最佳滴定形式。 综上，对于氨基酸的测定有四种滴定形式：盐酸直接滴定、氢氧化钠直接滴定、在待测溶液中预加盐酸再用氢氧化钠返滴定、在待测溶液中预加氢氧化钠再用盐酸返滴定。可通过对这四种滴定形式所得滴定曲线进行分析比较，选择各类氨基酸的最佳滴定形式。１．４．２实验方案 本文以瑞士万通公司生产的７９８ＭＰＴ型全自动电位滴定仪为分析仪器，以氢离子选择性电极为工作电极，用前文中所描述的四种滴定形式分别对单组分氨基酸和双组分混合氨基酸进行滴定。通过考查所得到的滴定曲线，最终确定各单组分氨基酸和双组分混合氨基酸的最佳滴定形式。之后采用各待测氨基酸溶液的最佳滴定形式，利用多元校正滴定法测定溶液中氨基酸的含量。实验数据用Ｍａｔｌａｂ程序进行处理，并对实验结果和误差进行讨论和分析。 由于本实验是利用氨基酸的酸碱性进行滴定测定的，按照酸碱性所分的３大类氨基酸中，同种类的氨基酸往往物理化学性质相似，所以只需在各类氨基酸中选取有代表性的作为研究对象。酸性氨基酸中只有谷氨酸和天冬氨酸，由于这两种氨基酸的各级离解常数相近，故只需选其一，本实验选择常见的谷氨酸；碱性氨基酸包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸，其中精氨酸和赖氨酸的离解常数接近，故这两者只要选择一种，而组氨酸的ｐＫａ值较这两者相差较大，比较特殊，需作为研究对象：中性氨基酸种类较多，但离解常数比较接近（参照表１．１），考虑到需对中性氨基酸的混合溶液进行测定，所以应尽量选择若干个ｐＫａ值相 ７ 第１章引言差较多的氨基酸作为溶液组分，本文中选取结构较简单的苏氨酸（ｐＩ＝５．６），脯氨酸（ｐＩ＝６．３０），丝氨酸（ｐＩ＝５．６８）作为研究对象。综上，本文测定对象见表１．２和表１．３。 表１．２单组分氨基酸的测定对象 表１．３双组分氨基酸混合液的测定对象 氨基酸组合形式 待测混合氩基酸 谷氩酸＋精氨酸 酸性氨基酸＋碱性氨基酸 谷氨酸＋组氢酸 碱性氨基酸＋碱性氨基酸 精氨酸＋组氨酸 酸性氨基酸＋中性氨基酸 谷氨酸＋丝氨酸 精氨酸＋丝氨酸 碱性氨基酸＋中性氨基酸 组氨酸＋丝氨酸 .
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