番茄根结线虫研究进展

李戌清;郑经武;郑积荣;阮松林

【摘 要】对国内外番茄根结线虫研究相关文献进行梳理和归类,就番茄根结线虫病的病原种类、危害症状、生物学特性、鉴定方法、抗性鉴定、防治策略,抗病育种及Mi基因进行综述,并对今后发展方向作了展望.%This paper briefly reviewed the research progresses in tomato nematode species, pathogen, damagernsuymptom, biological characteristics, classification methods, resistance evaluation, control measurement, resistancernbreeding and Mi gene. Moreover, the future development trend was prospected. 【期刊名称】《浙江农业学报》 【年(卷),期】2012(024)004 【总页数】5页(P748-752) 【关键词】根结线虫;番茄;Mi基因 【作 者】李戌清;郑经武;郑积荣;阮松林

【作者单位】杭州市农业科学研究院蔬菜研究所,浙江杭州310024;浙江大学农业与生物技术学院植物保护系,浙江杭州310058;杭州市农业科学研究院蔬菜研究所,浙江杭州310024;杭州市农业科学研究院蔬菜研究所,浙江杭州310024 【正文语种】中 文 【中图分类】S511

根结线虫(Meloidogyne spp.)广泛分布于世界性各地。是一种重要的植物根系专性内寄生线虫。已引起世界各国的广泛关注。1855年Berkeley首次在英国温室感病黄瓜根际发现根结线虫［1］，此后不断有新种被发现。目前国际上报道的根结线虫有效种80多个［2］，我国记录有效种39个［3］，可侵染包括单子叶植物、双子叶植物和草本植物的114科3 000多种植物［4］，遍及粮食、经济、蔬菜、果树、花卉、杂草等作物，尤其在热带、亚热带、温带地区的茄科、葫芦科、十字花科等植物上危害甚为严重，病害发生后，可造成作物减产10% ～20%，严重时可达75%以上［5］。其中分布最广、危害最重的主要有4个常见种，即南方根结线虫(M.incognita)(包括4个生理小种)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)(包括2个生理小种)和北方根结线虫(M.hapla)(包括A和B 2个明显的细胞遗传学小种)［6］，严重时可造成农作物产量损失超过90%。目前，我国大部分省市，如广东、福建、海南、云南、江西、湖北、河南、黑龙江、辽宁、安徽、贵州、北京、江苏、山东、浙江、陕西等，都有过该类线虫发生和危害的报道［7－9］，其中南方根结线虫在多数省份均有报道，为优势种。

番茄分类上为茄科番茄属，一年或多年生草本植物，起源于南美洲的秘鲁、厄瓜多尔、玻利维亚等地。在墨西哥番茄很早就为当地的印第安人栽培，在16世纪初叶番茄才被引到欧洲，但直到19世纪下半叶，人们才发现番茄是一种高营养价值的食用作物。随后在世界各地被广泛栽培，目前已成为世界各国主要水果型蔬菜之一。但病虫害的发生造成巨大的经济损失，根结线虫病是其主要病害之一。近年来，随着保护地蔬菜生产面积的迅速增加，特别是日光温室大面积推广，四季重茬严重，根结线虫危害日趋严重，为此，本文就番茄根结线虫的研究进展作一综述。 1 番茄根结线虫危害症状

番茄被根结线虫危害后，其地上部分在受害较轻时通常无症状表现，受害较重时表

现为矮化、黄化或萎蔫，类似于缺水缺肥。挖取病株，去除根系附着的土壤，可见根系发育不良，主根和侧根萎缩、畸形，形成大小不等的瘤状物，形如鸡爪状，瘤状物有时串生，使根肿大粗糙。初期的根瘤为白色，光滑质软，后转呈黄褐色至黑褐色，表面粗糙甚至龟裂，严重时腐烂。根瘤外观无病征，剖检其内部可见白色梨形体(雌虫)。根瘤上常产生稀疏细小的新根，之后新根又被感染，呈现根结肿大。根结线虫对根的侵染影响了植株营养的吸收和转运，植株体内的生长素和细胞素水平显著提高，植株叶片的光合速率降低，同时根系的分枝和生长也受到严重的抑制。此外，根结线虫侵染造成的伤口有利于其他病原物的侵入，形成复合病害，造成更大损失［10］。 2 番茄根结线虫生物学特性

根结线虫生活史要经历卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫及成虫6个阶段，该过程易受温度、土壤湿度、土质类型等环境因素的影响。环境适宜生活史周期缩短，反之则周期延长。其中温度的影响最为明显，如在南非，平均温度14℃时，生活史周期56 d，平均温度26℃时，仅需21 d。一般来说最适宜生长温度在25～30℃［11］。土壤湿度也是影响根结线虫生存的重要条件，线虫靠土壤水分维持其生活和各种活动，一般认为干旱年份病害发生较重，多雨年份发生较轻。不同土质类型，根结线虫的发病情况也不同，因沙性土壤土粒间隙大，通风良好，氧气充足，有利于线虫生长发育与活动，故根结线虫在砂性土壤中比在粘性土壤中危害更大［12］。 3 番茄根结线虫鉴定现状

用于番茄根结线虫种和小种的鉴定方法很多，如形态特征鉴定法、生物化学鉴定法、分子生物学鉴定法、细胞遗传学鉴定法、鉴别寄主反应鉴定法等。其中以形态学为基础的分类法不能完全揭示不同类群线虫在进化中的亲缘关系，而且鉴定所需时间很长，甚至要经过作物的一个生长季节才能得出结果，而分子生物学鉴定法精准性

好，且速度快，此方法常用于种以下线虫的分类鉴定，可以在无法获得雌虫的情况下进行，目前国内外均有利用RFLP，PCR技术对4种常见根结线虫进行分类鉴定的报道。

4 番茄根结线虫病的抗性鉴定 4.1 田间鉴定

将待鉴定的种子或种苗植于被根结线虫染病的田间圃，数周后，将根拔起调查根部发病情况。该方法简单易行，但费时占地，适用于材料的初选。 4.2 室内接种鉴定

供试品种种子经5%次氯酸钠溶液消毒10 min后，用清水冲洗，放入垫有两层滤纸的培养皿中，然后于恒温培养箱中28℃催芽。待胚根长至0.5 cm时，将其播种于装有消毒土［V(蛭石)∶V(草炭)∶V(土)=1∶2∶1］，规格为12 cm × 13 cm的小盆内，每个品种4株。放于温室中培育。待各品种植株长出2片真叶时，便可接种。采用根部接种法，在根部2 cm处打8～10 cm深的孔，每株灌入5 mL配置好的接种悬浮液(共含1 000条二龄幼虫)。接种后的温室内温度控制在20～25℃，正常光照，并要加强管理，防止幼苗徒长。接种60 d后，倒出整个植株，调查每株根部发病情况，根据病害症状描述，记载病情级别，计算出根结指数。其中根结指数=Σ(根结级别代表值×本级病株数)/调查总株数，式中Σ是各级乘积数值的总和。根结线虫病分级标准为：0级(没有根结);1级(仅有少量根结);2级(根结明显，根结百分率小于25%);3级(根结百分率为25%～50%);4级(根结百分率为50% ～75%);5级(根结百分率达75%以上)。抗性评价标准为：免疫I(根结指数=0);高抗HR(0＜根结指数≤1.0);抗病R(1.0＜根结指数≤2.0);中抗MR(2.0＜根结指数≤3.0);感病S(3.0＜根结指数≤4.0);高感HS(4.0＜根结指数≤5.0)。 5 番茄根结线虫病的防治

生产上对番茄根结线虫的防治，目前仍缺乏直接有效的方法，主要采用一些间接的

手段，包括：(1)农业措施：轮作、休闲、调节播种期、改良土壤、清洁田园等措施，但由于我国土地复种指数高，作物种植区分布比较集中，根结线虫的寄主范围较宽和农民掌握新的种植技术较困难等原因，大面积实施较难，局限性较大;(2)物理防治：采用热处理、射线或超声波处理及灌溉措施等，但费工费时，且对深层活动线虫无效，难以彻底防治;(3)化学防治：目前我国广泛应用的化学杀线虫剂主要种类有棉隆、丁硫克百威、克线丹、磷、硫线膦、噻唑膦等，可起到立竿见影的预期防治效果，但由于大部分药剂毒性较大，使用成本较高，易污染环境，降低产品品质，危害人体健康，影响农业的可持续发展;(4)生物防治：取得一定进展，但由于土壤环境十分复杂，土壤抑菌作用普遍存在，很大程度上了微生物制剂药效的发挥。

实际上，根结线虫在生产上呈迅速扩大和蔓延的趋势，可见这些传统的方法在遏制根结线虫发生上效果非常有限。选育和利用抗病品种防治根结线虫是最直接、有效、经济和安全的途径。

6 番茄抗根结线虫Mi基因相关研究概况

由于栽培番茄品种中缺少抗根结线虫的基因，19世纪30年代起，不少学者试图从野生番茄中转入抗根结线虫基因。1940年Bailey筛选出11份抗根结线虫材料。1956年Gibert［13］指出根结线虫抗病基因是由一个显性基因Mi控制的，之后人们相继发现秘鲁番茄、多毛番茄和多腺番茄等野生栽培种均含有该基因，且该基因可抗除北方根结线虫以外其余3种根结线虫。1985年Ammati［14］报道，野生番茄中可能存在不同于 Mi的新基因，这些基因可以抗南方根结线虫、北方根结线虫和根结线虫属其他线虫病害，因此有必要从野生种中寻找新的抗根结线虫基因［15］。目前，人们从番茄发现了9个抗根结线虫基因，原来的抗性位点Mi表示为Mi-1，新发现的8个抗性基因分别表示为 Mi-2，Mi-3，Mi-4，Mi-5，Mi-6，Mi-7，Mi-8，Mi-9(表 1)。其中 Mi-1 和 Mi-9基因被定位在番茄的第

6染色体上;单显性位点Mi-3对南方根结线虫的毒性群体表现抗性，被定位在第12染色体的长臂末端，与热稳定性抗南方根结线虫基因Mi-5紧密连锁;Mi-2和Mi-8连锁;Mi-6和Mi-7连锁;Mi-2，Mi-4，Mi-5和 Mi-6热稳定强，在土壤温度32℃时还维持对南方根结线虫的抗性;Mi-7和Mi-8对温度敏感，在25℃时对Mi基因有毒性的南方根结线虫群体表现抗性［16］。它们在抗谱范围、对温度的稳定性、连锁状况等方面的差异为番茄抗根结线虫育种提供了丰富的遗传资源。 自发现Mi基因的存在后，人们就开始了相关的分子标记遗传研究。1991年Klein-Lankhorst等［17］利用两个近等基因系83M7133和83M7138(仅在Mi和Asp-1位点有差异)，找到与番茄根结线虫基因紧密连锁的2个RFLP标记(GP79和H6A202)和3个RAPD标记，其中利用GP79标记能鉴定具有抗根结线虫性状的番茄植株的杂合性和纯合性，同年Messeguer等建立了Mi基因侧翼的9个高分辨率的 RFLP图谱［18］;1992年Ho等［19］找到了与Mi基因连锁的1个RFLP标记、1个SCAR标记PEX-1，其中PEX-1由于与Mi基因的紧密连锁已成为育种过程中鉴定Mi基因的重要标记之一;1993年，Daelen等［20］利用 Ho的2个标记和已有的对Aps-1和GP79之间的范围进行了图谱分析，为基因的最后克隆奠定了基础;1994年 Willamson等［21］获得了与番茄抗根结线虫Mi基因紧密连锁的1个共显性SCAR标记PEX-1;1995年 Yaghoobi等［22］利用 BSA 群体建立抗感基因池，用520种寡聚核苷酸引物进行筛选，得到2个与Mi-3紧密连锁的标记，并利用标记NR-14和RFLP标记TG180将Mi-3定位于番茄第12条染色体短臂的近端区域;Masuelli等［23］利用多重PCR技术得到1个与Mi连锁的SCAR标记Rex-1;2001年Xu等［24］找到了与Mi连锁的1个RAPD标记，并把它转化为SCAR标记;2006年李红双等［25］运用RAPD技术获得了1个与番茄抗根结线虫病基因连锁的RAPD标记OPD20/14，并将其转化成SCAR标记SCD20/1000;2008年于力等［26］利用多重PCR技术对番茄

Ty-1和Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行同时扩增筛选，为分子标记辅助抗性基因聚合提供了依据;2009年 Kuroyanagi等［27］利用特异性引物扩增和性内切酶MseⅠ酶切的方法，建立了Mi基因的共显性分子标记;2010年李亚玲等［28］利用Mi基因中开发的1个A/T型SNP位点，应用等位基因聚合酶链式反应技术，成功对438个F2群体进行了SNP分型。

表1 番茄抗根结线虫基因Table 1 Resistant genes of root-knot nematode in tomato注：Mi，Mj，Ma及Mh分别代表南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫及北方根结线虫基因 抗性专化性 温度极限 遗传 连锁情况 遗传位点Mi-1 Mi-2 Mi-3 Mi-4 Mi-5 Mi-6 Mi-7 Mi-8 Mi-9 Mi，Mj，Ma Mi，Mh Mi，Mj，Ma Mi Mi，Mj，Ma Mi Mi Mi Mi，Mj，Ma 32℃热稳定32℃热稳定热稳定热稳定25℃25℃热稳定单显性—单显性— —单显性—与Mi-8连锁与Mi-5连锁—与Mi-3连锁与Mi-7连锁与Mi-6连锁与Mi-2连锁—第6染色体—第12染色体—第12染色体— —第6染色体

表2 番茄抗根结线虫分子标记Table 2 Molecular markers linked to root-knot nematode resistance gene in tomato标记类型 标记数量 参考文献RFLP RAPD SCAR SNP 12个5个5个1个［17］; ［18］; ［19］［17］; ［24］; ［25］［19］; ［21］; ［23］; ［24］; ［25］［28］

综上所述，目前共获得与番茄抗根结线虫Mi基因紧密连锁的 RFLP 标记(12 个)［17－19］、RAPD标记(5 个)［17，24，25］、SCAR 标记(5 个)［19－21，23－25］及SNP标记(1个)［28］等各类分子标记20余种(表2)，这为抗根结线虫基因的分离、克隆及导入提供了坚实的基础。美国采用定位克隆的方法选育出多个由显性基因Mi控制的抗性番茄栽培品种，法国、荷兰、日本、中国等园艺业发达国家也相继从秘鲁番茄中引入Mi基因选育出抗根结线虫的栽培番茄［29－33］。但至目前，Mi基因是所有番茄栽培种中唯一被鉴定和利用的抗根结线虫基

因，且Mi-1是Mi基因中唯一被克隆并成功用于遗传转化的基因，因其抗性随着世代增加而逐渐降低，故克隆Mi基因中热稳定性较好的Mi-2，Mi-3，Mi-4，Mi-5，Mi-6，Mi-9 基因显得尤为急迫。此外，由于Mi基因对北方根结线虫没有抗性，且自然界存在可部分或全部打破Mi基因抗性的线虫群体，故新的抗源基因及其抗性机制尚待进一步研究。 7 展望

研究根结线虫的最终目的是发展成本低廉、高效、环境友好及可持续的防治策略。从现有的相关文献看，目前在番茄生产中多以化学防治为主，但化学防治易造成农药残留，污染环境;生物防治比较环保，对人、畜安全，具有良好的应用前景，但目前大多数生防制剂研究停留在实验室阶段，而已推广应用的药剂又常常因田间药效不稳定而了其进一步推广使用;在抗线虫育种方面的研究基础相对薄弱，但随着根结线虫基因组学和分子生物学技术的迅速发展，根结线虫抗性功能基因陆续被精确定位，利用先进的检测手段加强番茄种质资源的鉴定和筛选工作，进而研发抗根结线虫的转基因番茄，必将有效减少根结线虫对农业生产的危害。

【相关文献】

［1］ Berkeley MJ.Vibrio froming cysts on the roots of cucumbers［J］.Cardeners'Chronicle，1855，7：220.

［2］ Karssen G.The plant-parasitic nematode genus Meloidogyne Goldi，1982(Tylenchida)in Europe［M］.Leiden：Brill，2002. ［3］ 刘维志.植物线虫志［M］.北京：中国农业出版社，2004. ［4］ 刘维志.植物病原线虫学［M］.北京：中国农业出版社，2000.

［5］ Sasser JN.The international Meloidogyne project-its goals and accomplishments［J］.Annual Review of Phytopathology，1983，(21)：271－288.

［6］ Eisenback JD，Hirschmann H，Sasser JN，et al.四种最常见根结线虫分类指南.杨宝君译［M］.昆明：云南人民出版社，1986.

［7］ 汪来发，杨宝君，李传道，等.华东地区根结线虫调查［J］.林业科学研究，2001，14(5)：484－4.

［8］ 陈书龙，李秀花，马娟.河北省根结线虫发生种类与分布［J］.华北农学报，2006，21(4)：91－94

［9］ 文廷刚，刘凤淮，杜小风，等.根结线虫病发生与防治进展［J］.安徽农学通报，2008，14(9)：183－184.

［10］ Powell NT.Interactions between nematodes and fungi in disease complexes ［J］.Annual Review of Phytopathology，1971，9：253－275.

［11］ Vangundy SD.Ecology of Meloidogyne spp.emphasis on invironmental factors affecting survival and pathogenicity［A］Sasser JN.Carter CC.An advanced treatise on Meloidogyne，Vol.I：Biology and control［C］.Raleigh：North Carolina State Univ.Graphics，1985：177 －182.

［12］ Sasser JN.Identification and host-parasite relationships of certain root-knot nematodes(Meloidogyne spp.) ［M］.Bulletin A University of Maryland，Agriculture Experiment Station，19：31.

［13］ Gilbert GC.The inheritance of resistance to severe root-knot from M.incognita in tomato［J］.Proceedings Hawaii Academy of Science，1956，31：17.

［14］ Ammati M，Thomason IJ，Roberts PA.Screening Lycopericon spp for new genes imparting resistance to root-knot nematode(M.spp.) ［J］.Plant Disease，1985，69(2)：12－15.

［15］ 彭德良，唐文华.番茄抗根结线虫Mi基因研究进展［J］.沈阳农业大学学报，2001，32(3)：220－223.

［16］ Liharska TB，Williamson VM.Resistance to root-knot nematodes in tomato［M］.Nethweland：Kluwer Academei Publisher，1997：191 －199.

［17］ Klein-Lankhorst RM，Vermunt A，Weide R，et al.Isolation of molecular markers for tomato(L.esculentum)using random amplified polymorphic DNA(RAPD) ［J］.Theoretical and Applied Genetics，1991，83(1)：108 －114.

［18］ Messeguer R，Ganal M，de Vicente MC，et al.High resolution RFLP map around the root knot nematode resistance gene(Mi)in tomato［J］.Theoretical and Applied Genetics，1991，82：529－536.

［19］ Ho JY，Weide R，Ma HM，et al.The root-knot nematode resistance gene(Mi)in tomato：construction of a molecular linkage map and identification of dominant cDNA markers in resistant genotypes［J］.Plant Journal，1992，2(6)：971 －982.

［20］ Daelen RAJJ，Gerbens F，van Ruissen F，et al.Long-rang physical maps of two loci(Aps-1 and GP79)flanking the root-knot nematode resistance gene(Mi)near the centromere of tomato chromosome 6 ［J］.Plant Molecular Biology，1993，23(1)：185－192.

［21］ Williamson VM，Ho JY，Wu FF，et al.A PCR based marker tightly linked to the nematode resistance gene Mi in tomato［J］.Theoretical and Applied Genetics，1994，87：757 －763.

［22］ Yaghoobi J，Kaloshian I，Wen Y，et al.Mapping a new nematode resistance locus in Lycopersicon peruvianum［J］.Theoretical and Applied Genetics，1995，91：457 －4.

［23］ Masuelli RW，Cuesta G，Piccolo R.A multiplex PCR reaction for the screening of the nematode resistance gene Mi，and the tomato spotted wilt virus resistant gene Sw-5 in tomato［J］.Journal of Genetics＆ Breeding，2000，(3)：233－235.

［24］ Xu J，Narabu T，Mizukubo T，et al.A molecular marker correlated with selected virulence against the tomato resistance gene Mi in Meloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria［J］.Phytopathology，2001，91(4)：377 －382.

［25］ 李红双，李景富，许向阳.番茄抗根结线虫病基因的RAPD和SCAR标记［J］.植物病理学报，2006，36(2)：185－188.

［26］ 于力，朱英龙，万延慧，等.多重PCR技术鉴定番茄Ty-1和Mi基因［J］.分子植物育种.2008，6(1)：165－169.

［27］ Kuroyanagi S，Ishida A，Fukuta T，et al.Development of a DNA marker tightly linked to the root knot nematode resistance gene，Mi，in tomato［J］.Research Bulletin of the Alichi Agricultural Research Center，2009，40：35 －40.

［28］ 李亚玲，李景富，康立功，等.番茄Mi-1基因的SNP分型［J］.东北农业大学学报，2010，41(10)：36－42.

［29］ 黄婷婷，刘炳禄，王长义，等.保护地专用番茄“美丽莎”的选育［J］.中国农学通报，2005，21(7)：295－297.

［30］ Aramov MKH，Dzhuraeva LM.Breeding Meloidogyne resistant tomato varieties with a jointless pedicel［J］.Aparamonova Moscow Pussia，1991，13－14.

［31］ Berham WS，Winstead NN.Inheritance of resistance to rootknot nematodes in tomatoes［J］.Proceedings of the American Society for Horticultural Science，1957，69：370 －377.

［32］ Frazier W.Isolation of Lycopersicon esculentum type tomato lines essentially homozygous resistant to root-knot，(Hawaii Agricultural Experiment Sattion.Technical paper) ［J］.Proceedings of the American Society for Horticultural Science，1949，：225－226

［33］ Gilbert GC，Mcguire DC.Inheritance of resistance to severe root-knot from Meloidogyne incognita in commercial-type tomatoes［J］.Proceedings of the American Society for Horticultural Science，1956，68：437 －442.