第六节 单细胞藻类的培养液
藻类的生长繁殖需要吸收各种营养元素，单细胞藻类的培养液必须具备这些营养元素,而且在营养成分和数量上都应该符合藻类的需要，
各种藻类对营养的需要有很多共同点，所以一些培养液配方，能应用于多种藻类的培养。然而，藻类的不同种类，对营养的要求是有差别的，各有其特殊性，不同种类的培养液配方，当然也应该不同。只有较好地符合培养种类需要的配方，才可能获得较理想的效果。一个培养液配方的提出，首先必须了解这种藻类对营养的要求，要达到这一点，进行一系列的试验是必要的。还必须在使用中验证配方的效果，并在实践过程中不断总结经验，加以改进，使配方达到更理想的水平。
本节内容分培养液成分、培养液配方和培养液的配制三部分。 一、培养液成分
单细胞藻类培养液的成分有下列七类。 (一)大量元素
1．氮(N) 单胞藻培养液常用的氮源有硝酸钾(KNO3)、硝酸钠(NaNO3)、尿素(NH2CONH2)、硝酸铵(NH4NO3)、硝酸钙[Ca(NO)3)2]、氯化铵(NH4C1)、硫酸铵[(NH4)2SO4]、发酵人尿……等。其中以硝酸钠和硝酸钾最常用。但不同的藻类对硝酸态氮和铵态氮的吸收利用情况是不同的，必须根据不同的藻类选择合适的氮源。
2．磷(P) 单胞藻培养液常用的磷源有磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸二氢钠、(NaH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)4种。海水单胞藻培养液应用磷酸二氢钾，如用磷酸氢二钾所配培养液会产生大量沉淀。
3．铁(Fe) 单胞藻培养液常用的铁源有三氯化铁(FeCl3)、硫酸铁(FeSO4)、硫酸高铁[Fe2(SO4)3]、氧化铁(FeO)、柠檬酸铁(FeC6H5O7)、柠檬酸铁铵[Fe(NH4)3(C6H5O7)]等。其中最常用的是三氯化铁和柠檬酸铁。无机铁在水中容易形成一种胶体复合物，无可逆反应，不能为生物利用。铁也容易产生沉淀。所以尽管铁在数量上所需很少，但要满足藻类需要却很困难。要保持溶液中可利用态铁的数量，通常采用3种方法，这些方法都取得一定的成功，但都不够十分完善。
(1)在培养液内加入土壤抽出液：由于自然有机质(一般称为腐殖酸)的作用阻止了铁的沉淀和溶胶化(Pringsheim，1963)。
(2)在培养液内加入某种有机酸或其盐类以形成可溶性铁化合物：已证明较有效的有柠檬酸盐和酒石酸盐：迈尔(Myers，1947)证实应用硫酸铁和柠檬酸钠能使小球藻生长十分良好。
(3)应用络合剂：最常用的为乙二胺四乙酸(EDTA)，络合剂能防止铁和微量营养元素沉淀，并按照质量作用定律释放出足够数量的离子供藻细胞利用。
由于无机铁容易形成胶体复合物和沉淀，而有机铁，如柠檬酸铁、酒石酸铁等则是可溶性的，易为藻类细胞利用，在培养液配方中可使用有机态铁代替无机态铁。 因藻类对铁元素需要量不大，也有部分科学工作者，把铁列为微量元素。
4．钾(K) 单胞藻培养液中钾的来源常用的有氯化钾(KCl)、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢
钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)等。一般培养液中由于氮、磷元素的加入，也附带加入了钾营养元素。除此以外，可再加入氯化钾。
5．镁(Mg) 培养液中镁的来源，常用的是硫酸镁(MgSO4)和氯化镁(MgCl2)两种。可以单独使用其中一种，也可两种同时使用。镁元素在天然海水中的含量很大(1 200mg/L以上)，一般是足够的。
①湛水101号培养液（湛江水产学院）： NaNO3 0.03g Co(NH2)2 0.03g
维生素B1
维生素B12 200µg
200mµg
KH2PO4 0.005g 1.5ml 人尿
1 000ml FeC6H5O7(1%溶液) 0.2ml 海水
培养绿藻类、金藻类、硅藻类……使用。在培养硅藻时应加入0.02g/L硅酸钠。 ②ASP2培养液[Provasoli,L.;McLaughlin,J.J.A.;Droop,M.R.1957]: NaCl 1.8g NnCl2 0.12mg MgSO4·7H2O 0.5g CoCl2 0.3µg H3BO3
维生素B12
维生素溶液S（参考3第70页） Na2SiO3·10H2O 15mg
三[羟甲基]氨基甲烷 Na2EDTA 3.0mg
纯水 FeCl3 0.08mg
ZnCl3 15µg
培养绿藻类、金藻类、蓝藻类、隐藻类、涡鞭藻类使用。 （2）绿藻培养液配方：
①海洋三号扁藻培养液（海洋研究所，1960）：
2Na3C6H5O7·11H2O NaNO3 0.1g
KH2PO4 0.01g Fe(SO4)3(1%溶液) 10滴
②亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）： NaNO3 0.05g KH2PO4 0.005g
海水
KCl CaC12 NaNO3 K2HPO4 0.06g 10.0mg 5.0mg 0.5mg
CuCl2 0.12µg
0.6mg 0.1µg 1.0ml
0.1mg 100ml pH7.6~7.8
0.02g 1 000ml
维生素B12
人尿
200mµg
2ml
FeC6H5O7(1%溶液) 0.2ml
1 000ml 维生素B1 海水 200µg
培养成亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能加入海泥抽出液20ml，效果更好。
③亚心形扁藻培养液（厦门水产学院）：
200mg （NH4）2SO4 海泥抽出液V20ml
（参考第60页） 过磷酸钙30mg
[Ca(H2PO4)2·H2O+2(CaSO4·H2O)]
0.5ml 1 000ml FeC6H5O7(1%溶液) 海水
过磷酸钙溶液的配制：取含有效磷为16%的普通二级过磷酸钙配成3%的母液，过滤，使用时每1000ml海水加入1ml。培养过程中以追肥形式分2次加入0.2%人尿液效果更好。
④布彻（Butcher）培养液[Butcher，（1959）]： NaNO3 0.1g 50ml 土壤抽出液
K2HPO4
培养扁藻使用。 ⑤盐藻培养液：
甲液：
NaCl 5~10g 海水 乙液： NaNO3
500ml 0.5g
0.05g
海水
1000ml
K2HPO4
FeC6H5O7 海水
0.05g 0.001g 500ml
海泥抽出液V（参考第60页） 20~30ml
使用时，将甲、乙两液混合。如果再加入0.2%~0.3%人尿，效果更好。
⑥赫特纳（Hutner）培养液[Hutner,S.H.(1950)]： NaCl 0.25~4g K2HPO4 20mg MgSO4·7H2O 0.25g 0.2g 醋酸钾 Ca(NO3)2·4H2O 15mg 甘氨酸 EDTA 0.05g Zn Fe 0.6mg Cu Mn 1.0mg 纯水 Mo 1.0mg 培养盐藻使用。
⑦赖瑟（Ryther）培养液[Ryther，J.(1954)]: NaCl 2.67g Na3HPO4·12H2O MgCl2·6H2O 0.22g Na2SiO3·9H2O
0.25g
3.0mg 0.5mg 100ml pH7.5
2.0mg 2.0mg
MgSO4·7H2O 0.32g Na2C6H5O7·2H2O 0.02mg KCl 73mg KBr 5.8mg NaHCO3 20mg B 1.0mg NH4Cl 5.3mg 100ml 纯水 CaCl2 150mg 培养微绿球藻和Stichococcus使用。 ⑨屋岛改良培养液（平田八郎，1980）：
50g 过磷酸钙[Ca(H2PO4)2·H2O]+2(CaSO4·H2O) 硫酸铵（NH4）2SO4 300g
1m3 海水 大量培养海产小球藻使用。 （3）硅藻培养液配方：
①艾伦—内尔森（Allen-Nelson）培养液[Allen,E.J.et al(1910)]: A.KNO3 20.2g 100ml 纯水 B.Na2HPO4·12H2O 4.0g CaCl2·6H2O 4.0g
2.0ml 80ml HCl(浓) 纯水 FeCl3 2.0ml
B 液的配制法：先把氯化钙4g溶解于40ml纯水中。另外把磷酸氢二纳4g溶解40ml纯水中，再把三氯化铁溶融液2ml，缓慢滴入，摇动，产生白色沉淀，加热，缓滴入浓盐酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两溶液混合。
使用时，取A液2ml和B液1ml，加入1000ml海水中，充分混合后加热消毒，消后静置24h，然后将上层清液倒出使用。
②卢因（Lewin）培养液[Lewin,J.C.;Lewin,L.A.(1960)]: Ca(NO3)2·4H2O 0.02g Zn K2HPO4 0.05g B Na2SiO3·9H2O 0.5mg Co
胰蛋白
1.0g Cu 维生素B12
1.0µg Mo Fe 0.3mg 海水 ③米奎尔（Miquel）培养液[Miquel,P.(1890~1893)]: A.MgSO4 10g KI NaCl 10g 纯水
Na2SO4 5g B.Na2HPO4·12H2O NH4NO3 1g CaCl2·6H2O KNO3 2g FeCl3(溶融) NaNO3 2g HCL(浓) KBr 0.2g 纯水 每1000ml海水加入A液2ml，B液1ml。 ④须藤培养液[须藤俊造（1959）]： NaCl 24g NaHCO3 MgSO4·7H2O 8g Na2SiO3 KCl 0.7g P1（参考第70页）CaCl2·2H2O 0.37g 维生素B12 NaNO3 0.1g Na2HPO4·12H2O 0.125g 纯水 培养中肋骨条藻使用。
⑤廖氏改良培养液（转引自张立言等，1989）： KNO3 60mg NaSiO3 Na2HPO4·12H2O 10mg 海水 培养中胁骨条藻用。
⑥中胁骨条藻培养液（厦门大学）： KNO3 0.4g NaSiO3 Na2HPO4·12H2O 0.04g FeSO4·7H2O
土壤抽出液
15ml “920”植物生长刺激 海水 素
⑦硅藻培养液（湛江水产学院）： NaNO3 0.08g 维生素B1 K2HPO4 0.008g 维生素B12 FeC6H5O7(1%溶液) 0.2ml 人尿 Na2SiO3 0.02g 海水
培养三角褐指藻、小新月菱形藻、钙质角毛藻、牟氏角毛藻使用。⑧牟氏角毛藻培养液（黄海水产研究所）： NH4NO3 5~20mg FeC6H5O7·3H2O
0.1mg 0.1mg 0.1mg
0.1mg 0.1mg 1000ml 0.2g 100ml 4g 4g 2ml 2ml 80ml
0.168g 0.008g 1ml 0.02µg
1000ml
10mg 1000ml
0.02g 0.014g
4~5国际单位 1000ml
200µg 200mµg 1.5ml 1000ml
0.5~2.0mg
KH2PO4 0.5~1.0mg 海水 ⑨小新月菱形藻培养液（朱树屏等，1964）： NO3—N 4g Fe(FeC6H5O7·3H2O) PO4—P 0.4g 海水 ⑩赫特纳（Hutner）培养液[Hutner,S.H.(1948)]: NaCl 0.2g Mn MgSO4·7H2O 0.25g Mo NH4NO3 50mg CaCO3 14mg K2HPO4 40mg Na2SiO3·9H2O 5mg Na3C6H5O7·2H2O 100mg Fe 0.5mg 培养三角褐指藻使用。 （4）金藻培养液配方：
①E—S培养液（Allen,M.B.）: NaNO3 0.12g K2HPO4 0.001g
培养等鞭藻Isochrysis galbana使用。 ②F/2培养液（Guillard et al.,1962）: NaNO3 74.8mg NaH2PO4
4.4mg
Zn
Cu B 纯水
1000ml 0.04g 1m3 0.05µg 5.0µg 5.0µg 5.0µg 0．05µg 100ml
pH7.2~7.5
土壤抽出液I（参考第60页） 海水
50ml 1000ml
Na2SiO3·9H2O 8.4~16.7mg 小型培养金藻使用。
③F/2改良培养液（厦门水产学院）： NaNO3 74.8mg 人尿 NaH2PO4 4.4mg 海水
海泥抽出液V（参20~60ml
考第60页）
生产性培养金藻使用。
④等鞭藻OA—3011培养液（陈椒芬等，1987）： NaNO3 60mg 维生素B12 KN2PO4 4mg 维生素B1 FeC6H5O7 0.5mg NaHCO3 Na2SiO3 5mg 海水 ⑤湛水107—13培养液（湛江水产学院）： NaNO3 80mg 维生素B12 K2HPO4 8mg NaHCO3
FeC6H5O7（1%溶液） 0.2mg
200µg 维生素B1 海水
培养湛江等鞭藻、亚心形扁藻、钙质角毛藻使用。
F/2微量元素溶液（参考第70页） F/2维生素溶液（参考第71页） 海水
1ml 1ml 1000ml
1.5ml 1000ml
0.5~1.5µg 100~500µg 1g
1000ml 0.5~1.5µg 1g
1000ml
⑥湛水107—18培养液（湛江水产学院）： NaNO3 50mg 0.5~1.5µg 维生素B12 K2HPO4 5mg 1.5ml 人尿
NaHCO3 0.5g FeC6H5O7（1%溶液） 0.2ml
200µg 1000ml 维生素B1 海水
培养湛江等鞭藻、亚心形扁藻、钙质角毛藻使用。 ⑦等鞭藻9201培养液（周汝伦等，未发表）： Co(NH2)2 30mg/L 0.2mg/L 维生素B1 NaNO3 30mg/L 0.0005mg/l 维生素B12 KH2PO4 8mg/L FeC6H5O7 0.5mg/L 海水 培养等鞭藻9201品系使用。
⑧绿色巴夫藻培养液（陈椒芬，未发表）： NaNO3 60g 100mg 维生素B1 KH2PO4 4g 0.5mg 维生素B12 FeC6H5O7 0.5g Na2SiO3·9H2O 5g 1m3 海水 ⑨异胶藻培养液Ⅰ（陈世杰，1979）：
10~20mg FeC6H5O7 0.1~0.2mg （NH4）2SO4
KH2PO4 1~2mg 1000ml 海水 ⑩异胶藻培养液Ⅱ（陈世杰，1979）
人尿 3~5ml 海水 1000ml 大量培养使用。
2．淡水单胞藻培养液配方 （1）一般用培养液配方：
①朱氏10号培养液（朱树屏，1942）： Ca(NO3)2 0.04g Na2SiO3 0.025g K2HPO4 0.01~0.05g FeCl3 0.0008g MgSO4·7H2O 0.025g Na2CO3 0.02g 1000ml 淡水
培养浮游藻类使用，以海水代替淡水可用于培养海产藻类。 ②诺普（Knop）改良培养液[Pringsheim,E.G.(1949)]: KNO3 1.0g MgSO4·7H2O 0.1g Ca(NO3)2 0.1g FeCl3 0.001g K2HPO4 0.2g 1000ml 淡水 （2）绿藻培养液配方：
①水生4号培养液（黎尚豪等，1959）：
0.2g KCl 0.025g （NH4）2SO4
0.03g 0.15ml 过磷酸钙 FeSO4(1%溶液)
[Ca(H2PO4)2·H2O+2(CaSO4·H2O)] MgSO4·7H2O 0.08g 0.5ml 土壤抽出液Ⅳ
（参考第60页）
NaHCO3 0.10g 1000ml 淡水
培养斜生栅藻（Scenodesmus obliquus）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）使用。
②水生6号培养液（黎尚豪等，1959）： NH2CONH2 0.133g H2PO4 0.33ml MgSO4·7H2O 0.100g
0.200ml FeSO4(1%溶液)
CaCl2 0.030g
0.500ml 土壤抽出液Ⅳ
（参考第60页）
NaHCO3 0.100g KCl 0.033g 1000ml 淡水
培养种类同水生成号，使用水生6号培养液培养，藻细胞生长繁殖比使用水生成号迅速。 ③布里斯托尔（Bristol）培养液[Bristol,B.M.(1920)]: NaNO3 0.5g NaCl 0.05g KH2PO4 0.5g FeCl3·6H2O 0.01g MgSO4·7H2O 0.15g CaCl2 0.05g 1000ml 淡水 培养绿藻类使用。
（3）硅藻培养液配方：
①水生硅1号培养液（水生生物研究所藻类研究室藻类应用组[76]，1975）： NH4NO3 120mg Na2SiO3 100mg MgSO4·7H2O 70mg CaCl2 20mg K2HPO4 40mg NaCl 10mg KH2PO4 80mg FeC6H5O7 5mg MnSO4 2mg 1000ml 淡水 培养泉生偏缝藻（Nitzschia fonticola Grun.），椿状偏缝藻（Nitzschia palea Smith）,双尖菱板藻（Hantzschia amphioxys Grun.），梅尼小环藻（Cyclotellameneghiniana Kutz.）使用。 ②水生硅2号培养液（水生生物研究所藻类研究室藻类应用组[76]，1975）： NH2CONH2 150mg NaHCO3 100mg
50mg MnSO4 3mg 过磷酸钙
[Ca(H2PO4)2·H2O+2（CaSO4·H2O
50mg EDTA-Fe 1ml MgSO4·7H2O
KCl 30mg 4ml 土壤抽出液Ⅳ
（参考第60页）
Na2SiO3 100mg 1000ml 淡水 培养种类同水生硅1号，大量培养使用。 ③福格（Fogg）培养液[Fogg,M.B.,(1956)]: Ca(NO3)2 0.8g Na2SiO3 0.025g K2HPO4 0.01g FeC6H5O7 0.0008g
0.025g MgSO4·7H2O 土壤抽出液Ⅰ（参考第60页） 20ml
Na2CO3 0.02g 1000ml 纯水 培养舟形藻(Nauicula pelliculosa使用)。 （4）蓝藻培养液配方：
①B.G.M.培养液（Allen,M.B.）: KNO3 2.02g K2HPO4 0.35g
2.46g 3.0ml MgSO4·7H2O A8（参考第70页）
NaCl 2.30g
CaCl2 0.07g 1000ml 纯水 培养一般蓝藻用。
②扎鲁克（Zarrouk）培养液（Pinnan Soong,1980）: NaHCO3 16.8g 0.04g CaCl2·2H2O K2HPO4 0.5g 0.01g FeSO4·7H2O NaNO3 0.2g EDTA 0.08g K2SO4 1.0g A5 1ml NaCl 1.0g B6 1ml
0.2g 1000ml MgSO4·7H2O 淡水
培养螺旋藻最广泛使用的配方。
③CFTRI培养液（转引自何连金，1988）： NaHCO3 4.5g MgSO4 0.2g NaNO3 1.5g CaCl2 0.04g K2HPO4 0.5g FeSO4 0.01g K2SO4 1.0g NaCl 1.0g 1000ml 淡水 培养螺旋藻使用。
④M—Ssl培养液（转引自何连金，1988）： NaHCO3 4g 0.2ml FeCl3(0.1%溶液) NH2CONH2 0.25g KH2PO4 0.05g 1000ml 海水 室内小水体培养螺旋藻使用。 NaHCO3 2~4g 0.2ml FeCl3(0.1%溶液) NH2CONH2 0.214g KH2PO4 0.042g 1000ml 海水 室外大面积培养螺旋藻使用。 3．微量元素溶液配方
（1）A5-B6微量元素溶液[Holm-Hansen,O.,Gerloff,G.C.,Skoog,F.,(1954)]: A5 B6 H3BO3 2.86g NH4VO3 229.6mg
1.81g 960.2mhg MnCl2·4H2O Cr2k2(SO4)4·24H2O 0.22g 447.8mg ZnSO4·7H2O NiSO4·6H2O 0.08g 493.8mg CuSO4·5H2O Co(NO3)2·6H2O
Na2MoO4 0.021g 179.4mg Na2WO4·2H2O
1000ml 20ml 纯水 Ti溶液
H2SO4 1/20mol/L H2SO4 1000ml 1滴
A6-B6微量元素溶液使用很广泛，A5单独使用的例子很多。钛（Ti）溶液配法：把736.6g草酸钛，溶解于小量纯水中，加入氢氧化铵使成碱性，发生沉淀。用离心法将沉淀集中，用/20mol/L的硫酸20ml溶解。用量：第1000ml培养液加入A5、B6溶液各1ml。 （2）普罗瓦索利的P8微量元素溶液（Provasoli et al.,1957）:
CO(Cl) 1mg 羟乙基替乙二胺三醋酸
3g Cu(Cl) 2mg 脂钠
Fe(Cl) 200mg B(H3BO3) 200mg Zn(Cl) 50mg Mo(MoO3) 50mg
Mn(Cl) 100mg 纯水 每1000ml培养液加入10ml。
（3）M—F微量元素溶液[Miller,J.D.A.,Fogg,G.E.,(1957)]:
B（H3BO3）
0.2g Cu(SO4) Mn(Cl2) 0.2g Zn(SO4) Mo(MoO3) 0.2g Co(Cl2) 纯水 1000ml H2SO4（浓） 每1000ml培养液加入1ml。
（4）P1微量元素溶液[Pinter,I.J.,Provasoli,L.,(1958)]： EDTA 1.0g Co(Cl) Zn(Cl) 0.005g Cu(Cl) Mn(Cl) 0.04g Fe(Cl) 0.01g 纯水 每1000ml培养液加入30ml。
（5）S—M微量元素溶液[Sorokin,C.;Myers,T.,(1957)]： EDTA 50g MoO3 B3BO3 11.4g CuSO4·5H2O
ZnSO4·7H2O 8.8g Co(NO3)2·6H2O MnCl2·4H2O 1.0g 纯水
(6)“f/2”微量元素溶液：
ZnSO4·4H2O 23mg Na2MoO4·2H2O MnCl2·4H2O 178mg CoCl2·6H2O CuSO4·5H2O
10mg Na2EDTA FeC6H5O7·5H2O 3.9g 纯水
每1000ml培养液加入1ml。
（7）艾伦（Allen）的A8微量元素溶液（Allen,M.B.）： Fe 0.4g Mo（MoO3） Mn(Cl2) 0.05g V Zn(SO4) 0.005g Co(NO3) Cu(SO4) 0.002g N/10H2SO4 B(H3BO3) 0.05g 每1000ml培养液加入3ml。 4．维生素溶液配方
（1）维生素溶液S3[Provasoli,L.,McLaughlin,J.J.A.,Droop,M.R.,(1957)]：硫胺素盐酸盐 0.05g 肌醇 尼古丁酸（烟酸） 0.01g 叶酸 泛酸钙 0.01g 胸（腺）间氮苯 对氨安息香酸
1.0g 维生素H 0.1g 纯水
每1000ml培养液加入1ml。
（2）埃弗索尔（Eversole）的维生素溶液[Eversole,R.A.,(1956)]：
硫胺素盐酸盐 100mg 盐酸胆碱 维生素B6醇 75mg 叶酸 泛酸钙 200mg 维生素H
1000ml 0.02g 0.02g 0.02g
1滴
0.001g 0.00004g 1000ml 0.7g 1.6g 0.5g 1000ml 7.3mg 12mg 4.35g 1000ml 0.001g 0.001g 0.001g 300ml 0.5g 0.2µg 0.3g 1000ml 200mg 1mg 0.05mg
双氨安息香酸 烟酸胺
每1000ml培养液加入1ml。 （3）“f/2”维生素溶液： 维生素B12 维生素B1
每1000ml培养液加入1ml。
5mg 75mg 肌醇 纯水 1000mg 1000ml
0.5mg 100mg 维生素H 纯水 0.5mg 1000ml
6．硫(S) 培养液中硫的来源一般是加入其他营养元素的硫酸盐类(如硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁、硫酸高铁、硫酸锰、硫酸铜等)在获得其他营养元素的同时，也获得了硫元素。 7．钙(Ca) 培养液中钙的来源，常加入氯化钙(CaCl2)或硝酸钙[Ca(N03)2]。
8．硅(Si) 在硅藻培养液中一般都加入硅元素，硅元素的来源，常用的是硅酸钠(Na2SO3)和硅酸钾(K2SiO3)。
(二)微量元素微量元素的种类很多，但单胞藻培养液配方中常用的约10余种。现将其名称及一般使用的化合物列举如下：
1．硼(B) 硼酸(H3BO3)，焦性硼酸钠(Na2B4O7)。 2．锰(Mn) 硫酸锰(MnSO4)，氯化锰(MnCl2)。 3．锌(Zn) 硫酸锌(ZnSO4)，氯化锌(ZnCl2)。 4．铜(Cu) 硫酸铜((ZuSO4)，氯化铜(CuCl2)。 5．钼(Mo) 钼华(MoO3)，钼酸铵[(NH4)2O.7MoO3]。 6．钴(Co)氯化钻(CoCl2)。
7．钛(Ti) 氯化钛(TiCl2)。 8．钨(W) 钨酸钠(Na2wO4)。
9．铬(Cr) 硫酸铬钾[CrK(SO4)2]，铬酸钾(K2CrO4)。 10．镍(Ni) 硫酸镍(NiSO4)。
11．钒(V) 钒酸钠(NaVO3)，钒酸铵(NH4VO3)。 12．镉(CA) 氯化镉(CdCl2)。 13．锶(Sr) 硫酸锶(SrSO4)。
这些微量元素可以分开单项列于培养液配方中，也可以把微量元素集中配成微量元素溶液，然后按一定量加入培养液中。这些微量元素溶液有各种配方，一些常用配方将在第69～70页介绍。
藻类对微量元素的需要量和中毒量(致毒量)的差距一般很狭小，略微超过需要量即会引起中毒。微量元素也容易形成胶体复合物和发生沉淀，使藻类细胞不能利用。由于以上两种原因，致使在培养液中保持适量的微量元素是很困难的。络合剂的应用是解决以上困难的办法之一。
良好的田园土壤抽出液一般含有藻类生长繁殖所需要的各种微量元素和溶解有机物质，且具有类似络合剂的作用。所以在培养液中加入土壤抽出液是解决微量元素供应的有效办法。
(三)辅助生长有机物质藻类除了必须吸收无机营养之外，也吸收水中的溶解有机物质，
如维生素Bl、维生素B12、生物素……等，这些物质对藻类的生长有辅助作用，称为辅助生长有机物质。
辅助生长有机物质能促进藻类细胞的生长繁殖，还能增强藻类细胞对环境的适应能力，因此受到重视，加入培养液中的辅助生长有机物质种类也愈来愈多。常用的有维生素B12、维生素B1(硫铵素)、维生素B2、维生素B6、维生素H、生物素、柠檬酸、乳精酸、烟酸，对氨安息香酸、叶酸、泛酸钙、肌醇、腐肉碱、胸(腺)间氮苯、葡萄糖、肝抽出物、酵母抽出物、贝肉汤、鱼粉、咸鱼汁……等。
辅助生长有机物质可以分别加入培养液中，也可以把多种辅助生长有机物质配成混合液，称维生素溶液，在配制培养液时按一定比例加入。
土壤抽出液除含有无机微量元素外，还含有某些辅助生长有机物质。在培养液中加入土壤抽出液实际上加入了某些辅助生长有机物质。
(四)土壤抽出液 土壤抽出液含有单细胞藻类需要的微量元素和辅助生长有机物质，培养液中加入适量的土壤抽出液，一般能获得良好效果。
土壤抽出液的制作虽然简单，但处理方法各有不同。现将常用的方法介绍如下。 1．土壤抽出液I 取土壤1kg，加纯水1 000ml，煮沸60min，在暗处放置2d，过滤，以滤液600ml加纯水400ml使用。
2．土壤抽出液Ⅱ 取土壤1kg，加纯水1 000ml，再加入氢氧化钠2～3g，煮沸120min，冷却后过滤，滤液直接使用。
3．土壤抽出液Ⅲ 取土壤1kg，加自来水2 000ml，煮沸煎浓，把上部泥浆倾入烧杯中澄清，静置一昼夜后，次日吸取上层清液，再煮沸煎浓。第3天再如法煎煮，最后倾入三角烧瓶中，加棉花塞，煎浓，直至得到l 000ml的深褐色的土壤抽出液。每次使用后，煮沸灭菌保存(朱树屏，1964．)。
4．土壤抽出液Ⅳ取田园土壤1kg，加水2 000ml，搅拌均匀，浸泡，用前吸取上清液，煮沸消毒后使用(黎尚豪等，1959)。
5．海泥(或土壤)抽出液V 取海滩上砂质较少，有机质较多而又不是过分淤黑的上层软泥(或田园土壤)，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分搅拌均匀，静置l～2min，待粗砂、小石下沉，把上层泥浆倾人铝锅中，弃去底部粗砂、小石等杂物，按每1 000ml泥浆加入NaOH 1g的量加入NaOH，煮沸20～30min，煮时需不断搅拌。煮后静置24h，吸取上清液使用。海泥抽出液吸出后，除当天使用外，可以装入大烧瓶中再经煮沸1～2次(每天1次)，可作较长时间的保存，使用时再经煮沸。
不同地点取的土壤或海泥制成的土壤抽出液或海泥抽出液的营养成分和数量是不相同的，这是由于不同地点的土壤或海泥所含物质的成分和数量存在着差别的缘故。因此在取用土壤或海泥时，必须固定地方，不要经常变换，对其培养效果及合适的使用量，均应通过培养试验，了解掌握。
(五)络合剂无机态铁和微量金属元素容易形成胶体复合物和发生沉淀，不能为藻类利用。为了防止这些元素溶胶化和沉淀的发生，保持其对藻类的可利用态，以维持在培养液中的适量存在，哈特纳(Hutnei，1950)首先应用了称为络合剂的化合物。迈尔(Myers，1951)在培养小球藻中成功地使用了EDTA。其后，在许多培养液配方中，都有络合物的使用。最常
用的络合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，此外还有亚硝基R盐、三价氮基三醋酸(NTA)、羟基乙基乙烯二胺三醋酸(HOEDTA)等。
络合剂，本质上相当于环状有机化合物这一类，非常稳定，应用一定数量的络合剂，可以防止铁和微量元素的沉淀和溶胶化，并能根据质量作用定律释放出足量的离子供藻类细胞利用，能够大大地减少对藻类供应适量铁和微量元素的困难，并能使元素的量达到比藻类所能忍受的较高的浓度。
但也有关于应用络合剂后，引起某些金属元素缺乏的报道(M．R．Droop，1969)。
(六)植物生长调节剂 植物生长调节剂又称植物生长激素，有促进藻类细胞生长繁殖的作用。在培养液中加入某些植物生长调节剂，增产效果明显。向曙光等(1986；1989)在亚心形扁藻的培养液中加入30～50mg/L增产灵，净增产率为60％～70％。又加入40rng／L乙烯利，净增产率为56％[87]。徐淑凤等(1987)培养底栖硅藻，在培养液中添加0.5mg／L的-夸乙酸钠，对底栖硅藻的生长繁殖具有明显的促进作用[85]。
(七)缓冲剂 在培养液中加入缓冲剂，可加强缓冲作用。常用的缓冲剂有三羟甲基氨基甲烷和二甘氨酸。
以上介绍了培养液的成分，共七类。但不是说单胞藻培养液都必须具备这七类成分。其中最重要而且是必不可少的是大量元素，其次是微量元素和辅助生长有机物质，其他成分只在某些培养液配方中使用其中的一类或两类。 二、培养液配方
(一)用纯水配制的培养液 在实验室进行藻类植物的培养研究或其他生理、生化研究时，必须使用纯水配制培养液，并使用纯度较高的A．R．级或C．P．级化学试剂。这样，培养液中营养元素的种类和数量才能比较准确地在人为控制之下。
较理想的纯水，是使用离子交换树脂处理的无离子水，用这种无离子水做微量元素的研究，证明是有效的。通过蒸馏取得的蒸馏水，无论蒸馏器是金属或玻璃的，在蒸馏水流过蒸馏器时，可能带有少量的微量元素。因此，在许多微量元素研究中不宜采用。
用纯水配制培养液，营养元素的种类必须全面，使用的化合物也较多。一些科学工作者还根据天然海水的化学成分，在纯水中加入无机化合物配成人工海水，应用于海洋生物的研究。
(二)用天然淡、海水配制的培养液 一般单胞藻饵料培养和以生产有机物质为目的的生产性培养都使用天然淡、海水配制培养液。天然淡、海水是水生生物长期适应于其中生活的优良环境，已存在着植物必须吸收的各种营养物质，所以在配制培养液时只需要增加某些在培养中可能引起缺乏的营养元素就成了。尤其是大量生产中，往往只加入最主要的几种营养元素，也不必要求采用纯度较高的化学试剂，可使用工业纯和农肥。
(三)常用单胞藻培养液配方 国外使用的单胞藻培养液配方，数量众多。田宫博和渡边笃(1965)编著的《藻类实验法》和金尼[Kinne O．(1976)]编著的《海洋生态学》(MARINE ECOLOGY)第三卷，第一部分···…等专著已有较系统的介绍。在此，只重点介绍在国内较常用的培养液配方，也介绍一些国外配方供参考。 1．海产单胞藻培养液配方 (1)一般用培养液配方：
培养液的配制
培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻烦，固体的营养元素一般都配成母液，在使用时，只要吸取一定的量加入培养液-中即成。主要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，每组2种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有机物质也多种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般生物因不能忍受而死亡。
如果配制培养液的海水或淡水是采取常压加热消毒的，应在消毒后，待冷，在接种前再加入营养物质。因为有些营养物质(特别是有机物质)和海水一起加热消毒时，常发生沉淀。各种(组)营养物质可以单独消毒，如果营养物质是洁净的，在配制时，只要把容器消毒好，使用蒸馏水或无离子水作溶剂，则可以不用消毒。
营养元素的加入，应该有一定顺序。如先加氮，再加磷，后加铁一…·等。每加入一种 (或一组)营养物，搅拌均匀，再加第二种。
经试验和使用过，比较成熟的培养液配方配成的培养液，其RE一般是适合的。但研究和使用新的配方，配好培养液后，应测定RH。如需要，可用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节。天然海水的RH为8.2～8.4，而培养液的RE一般调节至7.5左右。
第七节 藻种的分离、培养和保藏方法
单细胞藻类的培养，首先需要有藻种。藻种是从哪里来的呢?原始的藻种是从天然水域混杂的生物群中，运用一定的方法，把所需要的藻类个体分离出来，获得单种培养的。获得单种培养的藻种，经培养和保藏而长期保存下来，供培养使用。本节介绍藻种的分离、培养和保藏方法。
一、藻种的分离
(一)采样 分离藻种，首先要采集生长有需要分离的藻类的水样。个体较大的浮游藻类，可用密浮游生物网在水中捞取。通过浮游生物网的过滤，可获得数量很大的藻类样品。但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料藻类，一般是个体很小的几m到十几m的微型藻类，用浮游生物网无法采集到，需要把水样采回室内处理。
水样可取白天然水域，无论是开敞的水面或小港湾都可以采水。但应特别注意海岸上 存留下来的小水洼，这些小水洼可能只在大潮时有海水淹没，有一短段时间和大海隔绝， 盐度略高于当地海区海水，尤其在盐场地区存在甚多。在这些小水洼中，往往生长有适于 静水体培养的藻类，且种类比较单纯，一种或数种藻类占优势，容易分离。还有，培养水 生生物的或储水的各种容器、水池，均可能生长大量浮游或附着藻类，也是采样的理想场 所。如要分离底栖性微型硅藻，可刮取潮间带的“油泥\"，加海水搅拌后，弃去沉淀的泥 砂，用密筛绢滤除大型藻类和杂质，即获得藻细胞浓度很高的水样。也可以把附着在大型 藻类(如马尾藻等)藻体上或其他附着物上的附着藻类洗刷下来作为分离的水样。
水样采回来后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的藻种，而这种藻类在水样中数量较多时，可立即进行分离。若数量很少，分离困难时，必须先进行预备培养，待其数量增多后再分离。
(二)预备培养 用作预备培养的培养液，各大类藻类应该是不同的，一般绿藻、硅藻和
金藻的培养液比较现成。对一些难以培养的藻类，最好加入土壤抽出液。预备培养的培养液的营养浓度应低些，一般只用原配方的1/2、1/3或1/4。如果水样中藻类的种类较多，就应使用几种不同的培养液，使各种不同的藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。因此，为了培养好各种藻类，有必要准备各种适宜的培养液，特别是对于不容易得到的贵重的样品，应该使用多种预备培养液培养。
预备培养的容器，通常用3 300ml容量的三角烧瓶。在瓶中加入100ml培养液，把经 密筛绢过滤除去大型生物的水样50cm3接种进去，放在室内靠北面的窗口下培养。 在分离浮游种类的预备培养过程中，应该每天摇动一次培养容器。但在分离附着种类时，容器可静止不动。因为藻类种类不同，产生特有的藻群，在培养中往往有单一的藻类集群，这些藻群吸移出来，有可能获得单种，或虽然达不到单种，由于混杂的生物数量少，分离容易。
有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。在此情况下，改变培养液的浓度；加入葡萄糖、蛋白胨等有机物；补充微量元素和辅助生长有机物质；加入土壤抽出液，有可能获得较好的效果。
在预备培养过程中，要经常观察。如发现培养液呈现出淡淡的颜色，即进行显微镜检查。如果是需要分离的藻类，数量占优势，应立即进行分离。如果没有需要分离的藻类，或者有需要分离的藻类，但数量不占优势，分离有困难时，可再培养一段时间，等待优势种发生交替。或者再接种到不同的培养液中培养，有可能在新的培养液中容易形成优势。总的来说，在预备培养中，要勤观察，勤检查，掌握时机，及时分离。
经过预备培养占优势的种类，分离容易。也适合于在小型静水体中生长繁殖。 (三)分离方法 单细胞藻类单种的分离方法，常用的有下列3种。
1．微吸管分离法 选直径约5ram的细玻璃管，在酒精喷灯上加热，待熔，快速拉成口径极细的微吸管。微吸管的另一端套接1条长约30cm(长)或8cm(短)的医用乳胶管，在分离操作时长乳胶管的另一一一端用牙齿咬紧，如果用短乳胶管则用手指压紧，用以控制吸取动作。将稀释的水样，置浅凹载玻片上，在显微镜下观察、挑选要分离的藻细胞，吸取时把微吸管口对准藻细胞，牙齿或手指放松，由于气流的关系，藻细胞被微吸管吸入。接着把吸出的水滴放在另一凹玻片上．，显微镜检查这一滴水中是否只有吸出的藻细胞，无其他生物混杂。如不成，再反复做，直至达到单种分离的目的。然后把分离出的藻细胞移入预先装有培养液的试管中，管口塞上棉塞，在适宜的光照条件下培养。每天轻轻摇动1次，待培养液呈现出藻色，再经显微镜检查，如无其他生物混杂，才达到分离的目的。
微吸管分离法操作技术难度大，往往吸取1个细胞要反复几次至十几次才能成功。而且适宜手分离个体较大的藻类和其他浮游生物，较小的藻类用此法分离较为困难。
2．水滴分离法 选直径约5mm的细玻璃管，拉制成全长约8cm的短微吸管5支。另 取载玻片30～50块、试管10-20支、小烧杯2-3只和吸管2支，洗刷清洁后用布抹干，置恒温烘箱消毒备用。选择微吸管(无吸管橡皮帽)1支，插入水样中约2cm，提起微吸管，待无水滴自然滴下，此时微吸管内尚有少量水样，把微吸管口与载玻片接触，即有一小滴水样留在载玻片上。水滴大小以在显微镜低倍镜视野中能看到水滴的全部或大部为准。如果所选微吸管不理想，另选1支，直到合乎要求为止。把水样倒入小烧杯中，用培养液稀释至每一
小水滴约有生物1个左右．(也可能有2个，也可能1个没有)。用微吸管吸取水样按上述方法滴到载玻片上，一载玻片滴上水滴3～4滴，水滴作直线排列，互相间隔一定距离。然后在显微镜下观察每个水滴，如果某一水滴内只有1个需要分离的藻类细胞，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液把水滴连同在水滴中的藻细胞冲人试管中去，并加入培养液达到试管容量的1/4，试管口塞上棉花塞，放在适宜的光照条件下培养，每天轻轻摇动试管1次6至试管中的培养液呈现出藻色，经显微镜检查是否达到单种分离的目的。一般分离1种藻类，须同时分离10支试管，通常在10支试管中总有1-2支试管分离成功，获得单种培养。水滴分离法在技术上要求水滴大小符合标准，水样稀释适宜、动作迅速和观察准确。 水滴分离法，方法简便，易行。尤其适宜于分离已在培养液中占优势的种类。 3．平板分离法 (1)平板培养基的制备：
①调配：按分离种类的需要，选用合适的无机肥配方配成培养液，加入1％～1.5％琼胶(先把琼胶剪成短段，在淡水中浸泡12h)。
②融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶全部融化。在加热过程中，水分蒸发，在加热完毕时加入淡水补足因蒸发损失的水分。
③分装：稍冷后即分装于培养皿中，培养基厚度约0.5cm左右。 ④灭菌：采用高压蒸汽灭菌法或间歇蒸汽灭菌法灭菌。 平板培养基灭菌后，平放，待冷，培养基凝固成固体状态。 (2)平板分离方法：平板分离方法有喷雾法和划线法两种。
①喷雾法：首先用经煮沸消毒的海水把水样稀释到合适的程度，装入消毒过的医用喉头喷雾器中，打开培养皿盖，把水样喷射在培养基平面上，使水样在培养基平面上形成分布均匀的一薄层水珠。水样稀释到合适的程度是指水样喷射在培养基平面上必须相隔lcm以上才有1个生物(或1个藻类细胞)，将来生长繁殖成一藻群后容易分离取出。稀释不够，将来生成的藻细胞群距离太近，不容易分离。
②划线法：水样不用稀释，取一金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取水样轻轻在培养基平面上做第一次平行划线3～4条，转动培养皿约70。角，把接种环在火焰上灭菌，通过第一次划线区做第二次平行划线。同样方法通过第二次划线区做第三次划线。再做第四次划线。由于蘸到接种环上细胞较多，在第一划线区，藻细胞群密集分离不开，但在第三、第四划线区，可能分离出孤立的藻类群落。
喷射或划线接种后，盖上培养皿盖子，放在适宜的光照条件下培养。一般经过20d左右的培养，就可以在培养基平面上生长出互相隔离的藻类群落。通过显微镜检查，寻找需要分离的藻类群落，然后用消毒过的纤细解剖针或玻璃微针把藻细胞群连同一小块培养基取出，移入装有培养液的试管或小三角烧瓶中，加棉花塞，在适宜光照的条件下培养。培养中每天轻轻摇动1～2次，摇动时避免培养液沾湿棉花塞。经过一段时间培养，藻类生长繁殖数量增多，再经一次显微镜检查，如无其他生物混杂，才达到单种培养的目的。如还有其他生物混杂，则再分离，直到获得单种培养为止。 二、藻种的培养
获得单种培养后，一方面扩大培养，供应试验和生产使用。另一方面可把藻种作较长时
间的保藏，需要时可随时取出使用。
藻种的培养要求比较严格。常用各种不同大小的三角烧瓶为培养容器，容量有100cm3、300cm3、500cm3、1 000cm3等。培养容器、工具经恒温烘箱高温消毒。培养液用加热法消毒。接种后瓶口用消毒过的纸包扎。放在适宜的光照条件下培养，每天轻轻摇动两次。大约2周进行1次移养。
藻种在培养过程中必须定期进行显微镜检查，保持单种培养。 三、藻种的保藏
单种分离是不容易的，要花费不少精力_和时间。一旦得到了单种，就要设法把它长期保存下来。藻种的保藏方法，通常是把藻种接种在固体和液体双相培养基上，在低温、弱光条件下培养，接种一次可保藏半年到一年。
(一)固体培养基的制备 固体培养基(即平板培养基)，作为保藏藻种用的固体培养基的营养浓度应按配方增加1倍。保种用的容器有试管、三角烧瓶、克氏扁瓶……等，以500cm3容量的三角烧瓶和试管最常用。试管的培养基的分装量约为试管长的1/4，三角烧瓶的培养基的分装厚度约为0.8～1cm。分装时应防止培养基沾在管口或瓶口上。分装后试管口和瓶口须塞上棉花塞，再用纸包扎。培养基经高压蒸汽灭菌后，取出，试管应倾置成斜面，三角烧瓶则平放，待冷，即成固体培养基。
(二)接种 保藏的藻种，可接种在固体培养基上。把试管的包扎纸和棉塞取下，用灭菌的接种环蘸取藻液在培养基斜面上作“之\"字形划线接种，再把棉塞塞好，绑紧包扎纸。三角烧瓶和克氏扁瓶可用喷雾法接种，利用医用喉头喷雾器把藻液均匀喷射在培养基平面上。
保藏的藻种，也可以在固体培养基上再加上培养液然后接种，称双相培养基。此法使用三角烧瓶为容器最理想，在固体培养基上加入比固体培养基体积多2倍的培养液，然后接种少量藻液。
利用双相培养基保藏藻种，可避免固体培养基因水分蒸发而干涸的问题，保藏效果比 单用固体培养基好，为通常采用的方法。
(三)培养和保藏 单用固体培养基保藏的藻种，接种后首先放在适宜的光照条件下培养，待藻细胞生长繁殖达到较高的密度，在平板上可看到藻色明显的条状或块状的藻细胞群，再移置低温、弱光的条件下保藏。双相培养基保藏的藻种，接种后可直接移置低温、弱光的条件下保藏，也可在适宜的光照条件下培养3～4d后再移置低温、弱光的条件下保藏。低温、弱光的条件，通常是指放在冰箱内，温度控制在5～8℃之间，冰箱内装1支8W的日光管，开关设在冰箱外，每天照明l～2h，也可长期连续照明。
藻种保藏的目的是使藻种能在较长的时间保存下来。因此，藻种必须在低温、弱光的条件下培养，使藻细胞在培养基上慢慢生长繁殖，让培养基的营养慢慢地消耗。在此，应特别强调，藻种保藏不能没有光。在弱光的条件下保藏培养，可保存半年到1年，甚至2年以上。但如果不给予光照，保存在完全黑暗的条件下，则保藏时间大大缩短，且藻细胞“老化” 。
第八节 敌害生物的防治
在单细胞藻类培养过程中，常会发生敌害生物污染。污染的敌害生物对培养藻类的危害是十分严重的，常常使培养归于失败。敌害生物的污染和危害是造成当前单胞藻培养不稳定的主要原因。敌害生物的防治问题，目前还没有彻底解决。
本节内容分敌害生物对单细胞藻类的危害作用、敌害生物污染的途径和防治措施三部分。
一、敌害生物对单细胞藻类的危害作用
(一)掠食 一些较大型的敌害生物，如轮虫(Rotifer)、游仆虫(Euplotes sp.)、尖鼻虫(Oxyrrhis sp.)、变形虫(Amoeba spp．)等，直接吞食藻细胞。由于藻细胞生长繁殖速度快，如果敌害生物的数量不多，吞食量不大，影响并不显著。但当敌害生物繁殖数量多后，吞食量也增大，则对藻类产生严重的影响。尤其是轮虫的吞食量达到惊人的程度，在二三天内可以把藻细胞吃光，使藻液变清。
(二)通过分泌有害物质对单胞藻起抑制和毒害作用 敌害生物通过必泌某些有害的胞外产物对藻细胞产生抑制和毒害作用，是敌害生物对培养藻类危害的又一方面，它往往比直接吞食的危害程度要严重得多。当敌害生物分泌的有害物质还较少时，培养藻类表现为生长繁殖缓慢。当敌害生物繁殖数量较大，分泌的有害物质多时，即造成藻细胞大量下沉死亡。敌害生物分泌的有害物质对培养藻类的毒性大小，依不同种类而异。
一种敌害生物对藻类的危害作用，可能是一方面的，也可能同时具有两个方面的危害作用。
二、敌害生物污染的途径
在单细胞藻类培养生产中，敌害生物可以通过下列途径污染。
(一)水 天然水中生活着种类繁多的生物。在单胞藻培养过程中，配制培养液的淡水和海水以及清洗消毒后的容器和工具的用水，如果不经过有效的处理或处理不彻底，不能把水中的生物除去或杀死，就会造成敌害生物的污染。从水这一途径污染敌害生物，往往污染生物的数量大，在较短的时间内即能对培养藻类产生严重的危害。
目前我国在单胞藻培养生产中，藻种培养与小型培养用加热法消毒水是有效的。但也不能忽视，如果加热温度不够或持续时间不够，都可能达不到消毒目的。在大量培养中，水经砂过滤后用次氯酸钠处理或用陶瓷过滤罐作第二次过滤处理都是有效的。但应用次氯酸钠处理水，不测定次氯酸钠的有效氯含量以及处理时间不够；应用陶瓷过滤罐，也可能因滤棒破裂，安装不严，拆洗时棒及罐内部冲洗消毒不够。以上种种原因都可能造成消毒不彻底，而导致敌害生物污染。
目前还有一些单位习惯使用砂滤池过滤水培养单胞藻，砂滤池对大小在15m以下的微生物无法隔除，生物污染无法避免。
(二)空气 微生物通过空气污染是经常发生的，而且难以避免。开放式培养，藻液和空气的接触面大。通气培养，大量的空气进入藻液中。一些2～3m大小的微生物(其中多数是单细胞绿藻类)，可以借风力随尘土在空气中飞扬而污染藻液。目前还没有防止微生物从空气污染的有效方法。
(三)容器、工具 容器和工具消毒不彻底，引起敌害生物污染。
(四)肥料 肥料不清洁，消毒不干净，引起敌害生物污染。
(五)昆虫 蚊子在培养池中产卵以及水生昆虫侵入培养池，都会把敌害生物带进来而引起污染。
(六)操作不严 工作人员进行操作前，手未经消毒，操作时不遵守操作规程，引起敌害生物污染。
三、防治敌害生物的措施
对待敌害生物的污染和危害应实行以防为主、防治结合的措施，尽可能减少其危害程度。 (一)预防措施
1．严格防止污染 在单细胞藻类的培养过程中，敌害生物污染的可能性是经常存在着的。而敌害生物对培养藻类的危害，又是目前单胞藻饵料培养中存在的最突出的问题，关系到培养的成败。因此，培养工作人员应充分认识培养工作中这一主要矛盾，加强责任感，在工作中时时、事事、处处严防敌害生物的污染。
在培养生产流程中，防止污染的重点应该放在生产性藻种培养这一级上。因为藻种培养在室内进行，培养容器为玻璃瓶，防污染的条件较好。只要藻种级没有敌害生物污染，扩大培养到水池，生产周期不是很长，就是发生污染，敌害生物还需要一段生长、繁殖的时间，才能达到一定的数量。也就是说，藻种级“纯\"，扩大培养才有较大的保证。因此，在藻种级的培养中应特别注意严格防止污染。
2．保持培养藻类的生长优势和数量优势 培养藻类生长情况的好坏和在藻液中数量是否占绝对优势，在防止和减轻敌害生物的危害方面，有着重要的作用。长期的培养经验说明，当培养藻类生长良好、繁殖迅速时，敌害生物的严重危害情况较少出现，有时在受 到污染的情况下，经过一段时间的培养，污染生物的数量并没有增加，甚至减少消失。保 持培养藻类良好的生长及其数量上的绝对优势，通过分泌较多的胞外产物对敌害生物起抑 制作用是培养成功的关键所在。
保持藻类的良好生长，首先接种的藻种必须取自指数生长期，其次在环境条件方面尽 可能地满足藻类生长的要求，使藻类生势旺盛。接种的藻种量大，从培养开始培养藻类在 培养液中即占有数量上的绝对优势。保持培养藻类的生长优势和数量优势，是减少敌害生 物危害的重要措施。
3．做好藻种的分离、培养和供应工作 在培养工作中严格防止污染是重要的，但从目前单细胞藻类培养的水平来看，在长期的培养过程中，绝对防止敌害生物的污染是不可能的。因此，污染必然或迟或早地发生，并在适宜条件下，敌害生物大量繁殖，最后导致培养的失败。要根本解决这个问题，就必须不断的补充新的“纯\"藻种来取代在长期培养过程中已经受污染的藻种，这才有可能使培养较顺利进行。所以，进行藻种的分离、培养和供应工作十分重要。
(二)清除、抑制或杀灭敌害生物的方法．通常采取清除、抑制或杀灭敌害生物的方法有下列三个方面。
1．使用过滤方法清除大型敌害生物 饵料藻类都很小，对污染的大型敌害生物(如轮虫……等)，可以用过滤方法清除。通常清除轮虫可用网孔小于60m的密筛绢过滤，经一次过滤可以清除轮虫的成体，而轮虫卵和正在发育的幼小个体不能完全清除，所以必须连续
过滤3天，每天1次。待第一次过滤后存留下来的卵和幼小个体发育成长为成体后，在第二次或第三次过滤时清除掉。
2．使用药物抑制或杀灭敌害生物 用于抑制或杀灭敌害生物的药物，有化学药品和中草药两大类。
国内许多单位都进行过使用药物杀灭藻液中敌害生物的试验，但往往由于敌害生物对药物的抵抗力比培养藻类强，效果多不理想。因此，到目前为止，有效的药物方法还不多，有些虽然取得一些初步效果，但还需要进一步试验观察。
培养亚心形扁藻和湛江等鞭藻出现尖鼻虫危害时，在藻液中加入0.003％的医用浓氨水，可有效杀灭尖鼻虫，不影响藻细胞的生长繁殖(马旭升等，未发表材料)。
如果在藻液中细菌大量繁殖，致使藻细胞生长缓慢、大量下沉，在1L藻液中加入1万国际单位青霉素，可有效抑制细菌的生长。
3．改变环境条件杀灭敌害生物 使用改变环境条件杀灭敌害生物的方法，必须了解培养藻类和敌害生物对生态因子的适应范围，然后根据具体情况，“以培养藻类之长攻敌害生物之短”，改变某一环境因子达到杀灭敌害生物而又保存培养藻类的目的。
根据亚心形扁藻能耐高盐度的特性，使用提高比重的方法杀灭敌害生物。其方法是在被污染的藻液中、加入食盐，把藻液比重提高到1.056～1.060，游仆虫等敌害生物可被杀死，对亚心形扁藻虽有一定的影响，但经1～2次稀释培养，即可恢复正常生长(广东水产研究所海水室，1974)。又，当盐藻培养受到变形虫危害时，可以利用盐藻嗜盐的特点，在1 000cm3藻液中加入食盐70～110g，不仅能杀死变形虫，而且能杀死尖鼻虫、游仆虫及个体较小的原生动物。一般在加盐处理后的第15～18d，被污染的盐藻培养液由黄绿色转为鲜绿色，藻细胞游动活泼，生长旺盛(徐淑凤等，1990)。
当亚心形扁藻、湛江等鞭藻藻液中繁生有尖鼻虫、游仆虫、漫游虫(Lionotus sp．)等敌害生物时，可以采用盐酸酸化藻液的办法进行杀灭。方法是在1 000era3藻液中，加入1mol/L盐酸溶液3～4cm3，边加边充分搅拌，同时测定pH，待藻液pH降到3时，停止加盐酸溶液，酸化0.5～1h，即可将上列的原生动物杀死，然后用1mol／L氢氧化钠溶液将藻液中和恢复至原pH范围。酸化中和后的亚心形扁藻和湛江等鞭藻细胞经23～25h后，就可全部恢复游动，经过一段时间的培养，藻细胞能恢复正常生长繁殖(刘志芳等，1983)。
第九节 几种比较特殊的培养方法
本节介绍利用天然海区混杂的各种藻类为藻种的培养、螺旋藻的培养和底栖硅藻的培 养等三种比较特殊的培养方法。
一、利用天然海区混杂的各种藻类为藻种的培养
(一)同槽培养 在对虾育苗池施肥培养生物饵料，培养的生物饵料供同池内培育的 对虾幼体食用，生物饵料培养与对虾育苗在同一水池内同时进行，即同槽培养。
同槽培养要求培养池的水容量大，一般选用室外、露天、水容量为200m3的对虾育苗池。清池消毒后，把从海区抽上来，在沉淀池经短暂沉淀的海水，通过150目的筛绢网过滤后，灌人池中。用筛绢网过滤的目的是隔除大型的动物和杂物，只容许单细胞藻类和小型浮游动
物(如原生动物、桡足类幼体、浮游幼虫……等)进人池中，以进入池水中的种类混杂的单胞藻作为培养的藻种。灌水达到预定水位后，施肥培养。灌水后第一天施氮肥2～3mg/L，磷肥0.2~0.3mg/L，以后每天施氮肥0.5～1.5mg/L，磷肥0.05～0.15mg/L。铁肥和硅肥不必每天施，隔2天或3天施一次或完全不施。铁肥(FeCl3)的施用量为0.3～0.5mg/L，硅肥(Na2SiO3)为0.05～0.1mg/L。
池水施肥后在短时间内便能使水中单细胞藻类的数量迅速增加，一般施肥后第三天单 胞藻数量开始急剧上升，第四、五天即可达到每毫升水体有2～7×104个细胞的水平。为了互相密切配合，对虾无节幼体必须在灌水施肥的第二或第三天下池，第四天即有部分无节幼体发育到潘状幼体，这样就能与池中单胞藻饵料的数量发展到能满足潘状幼体摄食需要水平相吻合。
陈明耀等(1988)对同槽培养方法进行了3年的试验观测[73]，在广东雷州半岛，4～6月间，在同槽培养池中出现的单胞藻优势种主要有下列几类：
1．硅藻类 菱形藻(Nitzschia spp．)、角毛藻(Chaetoceros spp．)、直链藻(Melosira sp．)、小环藻(Cyclotella sp．)。
2．绿藻类 某些团藻目的单细胞鞭毛藻。 3．隐藻类蓝隐藻(Chroomonas sp．)。
4．甲藻类 多甲藻(Peridinium spp．)、裸甲藻(Cymnodinium spp．)、薄甲藻(Glenodinium spp．)。
以上优势种一般在育苗早期，施肥后1周左右的时间，硅藻类占绝对优势，尔后甲藻类逐渐占优势。提供给溞状幼体做饵料的主要是硅藻。从其种类组成来看，除长链状群体的角毛藻和少量较大型的种类(如圆筛藻、盒形藻等)之外，大多数为5~20um的微型硅藻，适合对虾溞状幼体摄食。
在同槽培养池中的饵料生物，除单胞藻外，还有一些动物性饵料生物，主要是原生动物纤毛虫类、甲壳动物桡足类和一些浮游幼虫。这些动物性饵料生物在培养后期较多。 (二)专池培养 专池培养与同槽培养不同的是使用专用饵料池培养，施肥量加大，培养时间短，浓度大。
培养池露天，池深80~l00cm，实际培养水深60cm，池面积30~40m2。水处理方法与同槽培养相同，天然海水经短暂沉淀后用150目的筛绢网过滤。灌水达60cm水深后，一次施硝酸钠30mg/L、磷酸氢二钾3mg/L、三氯化铁O．3mg/L。施肥后，充气，在露天直射太阳光下培养。夏天光照太强，培养困难，可设简易的空架式池顶，用布蓬部分地遮光。 一般培养至第三、四天，水色呈褐色，即可收获。把藻液用潜水泵抽人对虾育苗池使用，一次全部用完。如果不及时使用，一般一二天内藻细胞大量下沉死亡，水色变清。 经专池培养，生长起来的单细胞藻类，主要为长链的角毛藻，对虾溞状幼体摄食有困难，但其中也有少量适于溞状幼体摄食的小型硅藻。投喂后，一般蚤状幼体拖便明显。 专池培养最大的优点是方法简孰培养速度快，能大量、及时供饵。缺点是生长起来的种类绝大部分不适合蚤状幼体摄食，生长起来后又极容易大量死亡。 螺旋藻的培养
(一)开发的意义 螺旋藻的光能转化率高达18％，光合效率达43％，而一般农作物仅
分别为5％～6％和30％[121]。有利于人们充分利用太阳能来生产食品。
蛋白质含量在50％以上，最高可达75％。氨基酸种类齐全，特别是必需氨基酸含量 较多，其中赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸含量尤其突出，氨基酸平衡达到联合国粮 农组织(FAO)蛋白质咨询小组确定的理想的蛋白质标准[132]。真蛋白消化率高达 75％[121]。
螺旋藻的脂肪含量较低。纤维素也较少，容易消化。胡萝卜素、维生素E和维生素C的含量较高。含有较丰富的一般微量元素，还含有微量的硒，这在营养上可能有较大的意义
[132]
。
、125]
螺旋藻多糖有提高机体的免疫功能和抑制癌细胞的作用[124
。
由于螺旋藻营养上具有上述特异优点，容易消化和采收方便而深受重视，为世界各国广泛研究和开发的一种新的植物蛋白源。目前，国外用螺旋藻干粉制成的食品用于治疗溃疡、贫血病、糖尿病、肝炎、肝胖病及视觉不良等疾病，成为运动员、老年人及伤病员的高级营养保健食品。
螺旋藻作为饵料生物或囱料添加剂，在水产养殖的应用效果，也已被众多的试验所证实。 在长毛对虾育苗中用螺旋藻单一投喂，或作为基础饵料，单位水体出苗量提高5.5％～33.7％[121]。以螺旋藻代替其他单胞藻饵料，兼投轮虫、卤虫无节幼体进行中国对虾育苗，成活率大大提高(张志恒，1988)。又，根据顾天青试验，培育中国对虾幼体，在ZI～MⅡ阶段，以螺旋藻代替豆浆加轮虫，或以螺旋藻加豆浆加轮虫与豆浆加轮虫比较，试验组比对照组生长快、成活率高[127]。
应用螺旋藻培育泥蚶亲贝，经2周试验，成活率为100％，性腺发育良好。用这批亲蚶进行人工催产，催产率达98％，受精率95.2％，孵化率92.7％，幼虫发育正常。其效果比用地瓜粉或其他单胞藻饵粉好[121]。
由于螺旋藻类胡萝卜素含量高，鱼、虾摄食后，体色格外鲜艳，日本已利用螺旋藻作为锦鲤、c金鱼、对虾的增色剂。
螺旋藻在满足人类未来需要的许多方面，都具有很大的开发潜力。
(二)培养方法 螺旋藻的培养方法与一般单胞藻基本相同，只有下列几方面有其特殊性。
1．培养液的酸碱度 目前作为培养对象的几种螺旋藻，原生长在非洲及中南美洲等热带地区强碱性盐湖中，其繁殖环境的pH为9.5～11。它们需要较高的碱性培养环境，它们适应的酸碱度范围为pH8.5～11，最适范围为pH8.5～9.5 。
在螺旋藻培养液中必须加入碳酸氢钠，主要是作为碳源供螺旋藻利用，另一方面它对培养液的pH起缓冲作用，并能抑制杂藻的污染。在Zarrouk培养液中碳酸氢钠的加入量为16．8g/L，占总肥料成本的50％以上。林惠民(1991)把Zarrouk培养液碳酸氢钠的量从16.8g/L减到8.4g/L，把M-Ss培养液碳酸氢钠的量从8g/L减到4g/L，进行比较培养，结果表明在指数生长期差别并不明显。但他也认为碳酸氢钠加人量低，容易引起敌害生物污染，得不偿失[122]。
虽然培养液中加入了碳酸氢钠，对pH有缓冲作用，但在培养过程中，由于二氧化碳的不断被利用，pH也不断上升，有可能超出适应范围，轻则影响藻体生长，藻色变黄。重则
丝状体解体，最终培养失败。所以在培养过程中必须注意观测藻液pH的变化，必要时进行调节，这是十分重要的。用海水培养，由于海水自身就是一种良好的缓冲液，pH的升高及对藻体的影响没有用淡水培养那样突出。吴伯堂(1992)使用南海Ⅱ号培养液(配方未发表)进行钝顶螺旋藻SCS品系海水半连续培养，pH始终保持在10.0左右，最多不会超过10.5[13l]。也可以在藻液中通人CO2含量为2.5％的混合空气，在培养102h内pH由8.6上升到9.2，而后在96h内pH无变化，相当稳定[122]。
2．海水驯化 螺旋藻原生活在碱性水体中，可以在淡水中培养，也可以通过逐步驯化适应在海水中生长。吴伯堂等(1988)对钝顶螺旋藻进行海水驯化的步骤是：
①将原藻种接种在最低一级浓度的氯化钠(分析纯)配制的培养液中培养，经一段时间后通过显微操作挑选正常螺旋藻丝状体再接种到氯化钠较高的培养液中培养。以此类推，直到氯化钠的浓度达3.5％。
②经过氯化钠培养液逐步驯化获得的正常丝状体，用海盐(食用粗盐)配制的培养液再作进一步驯化，顺序过程同上。
③将上述经海盐驯化过的螺旋藻，以上述同样的顺序过程和方法以自然海水培养，直到海水盐度达3.5％，螺旋藻仍能正常生长，不再产生任何程度的凝聚现象，驯化即获成功。 经驯化的螺旋藻在海水中生长要比在淡水中生长快，而且蛋白质含量也较高[123]。此外，由于海水中含有较大量的镁、钙元素和各种微量元素，海水培养螺旋藻的培养液配方可大大简化，所需碳源(NaHCO3)和氮源的量也比淡水配方少，因而生产成本比用淡水培养低[131]。 3．培养 目前人工培养的几种螺旋藻原生活在热带地区，对高温、强光的适应性强，而且在适宜的高温、强光下，生长快，产量高，我国的南方，特别是海南岛是培养螺旋藻理想的地方。虽然螺旋藻适应强光，但它们对光也是十分敏感的，一般来说，试管斜面藻种在2 000～3 0001x、室内玻璃容器培养在3 000~5 0001x、大面积培养在10 000～30 0001x的光照强度以内，生长良好。但当接种后藻体浓度较稀时，强光极易使丝状体受伤，叶绿素分解，藻色变黄，甚至死亡。因此，在培养初期，、以较弱的光照为宜，必须有遮光设施。接种时间宜在傍晚进行，接种后应遮光2～3天，以后随着生长，藻丝密度增加而逐步提高光照强度。在培养过程中，当光照太强时，要遮光、增加搅拌次数或间歇性充气。如短期内受到强光的伤害，可将受害的藻体移至弱光处，1～2d内可恢复正常[121]。
配制螺旋藻培养液的氮源，以尿素的效果最好，硝酸盐次之。铵态氮对螺旋藻的毒害作用很大，超过30mg／L就会伤害藻体，因此，不宜使用硝酸铵或硫酸铵为氮源[121]。 螺旋藻的保种培养有固体和液体两种方法。试管斜面琼脂培养，接种后置于室内散射光环境中培养，每隔30～60d重新接种1次。液体保种用三角烧瓶，接种后在散射光下培养，每天摇动2~4次，每隔30～40d换1次新培养液继续培养。螺旋藻的生产流程，一般分藻种琼脂培养、三角烧瓶培养(以上属藻种培养)、玻璃缸培养、室内瓷砖池培养(以上属中继培养)、室外水泥池培养(生产性大量培养)5级。每支试管斜面琼脂藻种可接种2 000ml左右的培养液，经10～15d培养可达到再扩大培养的密度。采用液体藻种接种时，藻种藻液量与新培养液量之比，玻璃容器培养以1:5、池养以1:10～20为宜。大面积池养，由于藻体通常升浮在水面，培养池的深度通常为40～50cm，实际培养水深一般为25～30cm[121]。但吴伯堂等(1992)报道，从1989年6月6日到12月30日培养螺旋藻，平均培养水深为18．0cm，平
均单产为6.6g/m2·d-1。又从1990年3月12日到6月15日培养螺旋藻，平均培养水深为13.2cm，平均单产为12.01g/m2·d-1，最高单产为14.9g/m2·d-1 。此结果表明，在10～15cm的水深条件下培养，产量比在15～22cm的水深条件下培养高出将近一倍。究竟最佳的培养水深范围是多少?还有待进一步探讨。在研究这一问题时，应联系水温、光照度、充气等方面的条件去考虑。 (三)采收和加工
1．采收 螺旋藻的产量以每天每平方米产干粉多少克来表示。国外产量为8～15g/m2·d-1，国内产量目前还较低，一般为7～12g/m2·d-1。当藻液呈墨绿色时即可收获。 螺旋藻的生理活动有日周期性变化，使藻细胞的化学成分亦发生相应的变化。藻细胞内的蛋白质含量在早晨最高，在傍晚则很低[121]。如果培养目的是生产蛋白质，那么，采收工作应在清晨完成。
把螺旋藻培养池的藻液浓集起来的采收方法有多种，一般作为生物饵料培养，规模不是很大的，可用重力过滤法采收，简单、方便。
最常用的是用200～300目(目为非法定计量单位，下同)筛绢布或白色的确凉布做成宽约40em、长约80em(或其他规格)的袋子，取1条口径为3．3cm(1寸)的水管把池中藻液虹吸出来，水管的排水口一端伸入袋内用绳子从袋口处绑紧。也可用小型潜水泵把池中藻液抽入袋中。利用重力和一定的压力作用，滤去水分，可获很浓厚的藻泥。也可用花篮式的塑料盆或桶(或用一般的塑料盆、桶钻孔加工而成)，在盆(桶)上铺一块筛绢或的确凉布，用水瓢取培养池上浮的藻体放盆中过滤。如果采收的数量较多，可用钢筋焊成漏斗状架子，架子上辅一层筛绢或的确凉布，把藻液置于其上过滤。
如果是育苗场培养螺旋藻用作饵料使用的，则根据需要在投饵前过滤，直接用过滤后的藻泥投喂，浓度也不必太大。如果需干燥加工，因过滤后的螺旋藻藻泥中含有较多的培养液中的其他成分，特别是海水培养液培养的螺旋藻含盐最高。所以必须用自来水淋洗二三次，每次淋洗加入的自来水量应为藻泥量的10倍以上，淋洗后依然用重力过滤法把藻体浓集起来。
在藻液过滤时，必须把滤液回收，再补充一部分营养元素，重新使用，可节约肥料，降低成本。池养螺旋藻一般采用半连续培养方式培养，不是一次全部采收，回收的滤液也因过滤不彻底留有藻丝作为藻种，继续培养。
藻液采收的方法，还有平板滤框挤压法、离心沉淀法、微孔滤筛法……等等。 2．干燥加工 采收的藻泥有各种干燥方法，如表2-2所示。其中以圆筒式蒸气烘干快，产品成粉状，质量高。太阳晒干，虽然经济，但晒的时间长，产品成片状，质量较差。
表2-2螺旋藻藻泥采用各种烘干方法比较
(引自何连金，1988)
烘干方法 蒸汽热力圆筒烘干 真空架烘干 太阳晒干 流通空气风干
何连金(1988)推荐采用日光干燥器晒制加工螺旋藻，在时间和效率上比用太阳光直接晒干的办法好o 1架简单的日光干燥器是由1只木箱和1块2mm厚的玻璃板组成。木箱内涂上黑色涂料，这样可以使箱内温度上升至60～65℃o藻泥的铺放厚度是2～3mm，并使箱内温度保持流通。这样，螺旋藻泥在箱内晒5～6h，干藻的含水量可降低到4％～8％的程度。吴伯堂等(1992)把洗过的藻泥辅平在塑料布或木板上，厚约2～3mm，置于阳光下晒5～6h，再放在70～75℃的烘箱烘干。 三、底栖硅藻的培养
鲍、蛏、蚶、蛤及海参……等海产经济动物的幼虫自卵孵出后，只有一短暂的浮游阶段即下沉过底栖生活。在底栖生活阶段需要提供底栖性饵料。底栖性单胞藻以硅藻类最为理想，其培养方法与浮游藻类的培养方法有较大不同。70年代，陈世杰等(1977)在鲍鱼育苗中采用的底栖硅藻培养方法[134]，在国内已广泛应用。 Nobuhiko’Fanaka(1988)推荐一种用玻璃圆筒为培养容器，用人造纤维刷为附着基的培养方法，产量较高。现将这两种方法介绍如下。 方法I
(一)藻种及其来源 目前各地培养用的底栖硅藻种，多直接取自本地海区，由于土生土长，对本地区的环境条件的适应能力强，容易培养。藻种可以用各种方法采集。
1．海区挂板附片 在海区浮筏下，悬挂各种类型的附着基(如文蛤壳、塑料板、玻璃片……等)，悬挂深度为0.5m左右，二三天后取回，冲洗去附着基面上的杂物，再把附着的底栖硅藻洗擦下来，收集为藻种。
2．刮砂淘洗 在海滩的中潮线附近，自然繁殖的底栖硅藻在沙滩的表面形成黄绿色至黄褐色的密集藻群。可以在最低潮时刮取有密集藻群的表层细砂，放塑料桶内，加入清洁海水，搅拌和清除杂物；静置片刻，待砂泥下沉，上层液体呈茶褐色，再经粗筛绢过滤，即可得到浓度很大的底栖硅藻藻液。
3．洗擦海藻表面或储水容器的底壁 在海区生长的大型藻类的藻体表面；在储水池、储水的水族箱的底部和四壁；在紫菜育苗池及其采苗器(如文蛤壳)上面，都有底栖硅藻附着。把这些底栖硅藻擦洗下来，收集为藻种。
1.5 3.0
90.0 86.0
33~35 60
14 20
7~8 5~7
3.0
90.0
50~60
5
3.9
藻泥厚度(mm) 0.5
烘干前含水量(％) 90.0
烘干表面温度(℃) 120~128
烘干时间(h) 16S
产品残余水份(％) 3.3
产品质 量 很好(可做食品) 很好，但吸湿性强 适宜做饲料 可做食品
用以上几种方法采集的藻种是多种混杂的，而且不同海区常见的底栖硅藻优势种类有所不同。福建省东山海区常见的优势种主要有：。阔舟形藻(．Navicula latissima)、舟形藻(Navicula sp．)、东方弯杆藻(Achnanthes orientalis．)、双眉藻(Amphora sp．)、卵形藻(Cocconeis sp．)等[134]。
采自海区的混杂的藻种，由于没经过筛选，不一定都合乎要求。较理想的是分离、筛 选优良藻种进行单种培养。王渊源、林均民等(1986、1989)分离集美辐节藻(Stau-roneis jimeiensis Lin et Wang sp．nov．)拟作为底栖硅藻单种培养的藻种[22 (二)培养容器和附片装置 1．培养容器
(1)玻璃缸：用于藻种培养。 (2)水族箱：用于中继培养。
(3)水泥池：建于室内或室外，池底面积约lm2，高30～40cm。池内壁最好能辅上白瓷片。大量培养用。 2．附片装置
(1)附片材料：玻璃或有机玻璃片、聚乙烯薄膜、玻璃钢波纹板……等均可作为附片材料。
(2)附片架(图2—18)：
①木架：在长方形木框(50cm~25cm或15cm)的2条长边上，等距离每隔2～3cm有一45角的斜缝，每架可斜插入硬质附片12～18片。
②竹架：用经过海水充分浸泡过的细竹扎成，规格为70cm~50cm~40cm。在每两条长边上每隔2～3cm穿扎成双的胶丝线绳，便可按一定角度夹插入聚乙烯薄膜片，每架可斜夹插入附片20～25片。亦可用长条的聚乙烯薄膜片直接沿线绳张成锯齿状。
③“目\"字形塑料框：在“目\"字形塑料框(或用外套塑料管的粗铁线制成)的横杠上，粘上一端游离的塑料薄膜，因塑料薄膜比重轻，在水中能朝上张开。
(三)培养方法 1．接种附片
①把培养容器或培养池和附片装置清洗消毒干净，将附片装置放人培养容器或培养池中，加满过滤海水。
②把采集到的底栖硅藻藻液用密筛绢过滤1～2次后，倒入培养池中，搅拌均匀，静置1天，利用底栖硅藻在静水中沉降并附着的特性来附片。24h后，硅藻藻种已比较均匀地附着在附片的向上面(单面附着)，用水轻轻冲洗附片，附片上的硅藻不脱落时，即可全部换水，加入新鲜海水并施肥，开始培养。培养2～3d后，可把附片装置翻转，再一次接种附片，即得双面附片。双面附片后继续培养。
2．换水 静水培养底栖硅藻，每2～3d更换一次新鲜海水并施肥。换水时必须冲去池底污物，并把蚊子幼虫和腹毛类原生动物……等敌害生物冲走，附片上的敌害生物也必须轻轻地冲洗除去。在高水温季节里，换水次数应增加，必要时每天换水1～2次。换水结束后应立刻施肥。在条件许可下，利用循环水或流动水来培养底栖硅藻，能获得比较理想的效果。
、31]
，正在试验中。
3．施肥 在培养过程中，如果经常更换新鲜海水或用流动海水培养，虽不再追加营养盐，底栖硅藻的生长繁殖仍然正常进行，但速度较缓慢。为了加速底栖硅藻的生长繁殖，施肥是必要的。现介绍福建鲍鱼试验站在培养底栖硅藻中使用的培养液配方如下，供参考。
NH4NO3—N 10~25mg Na2SiO3·9H2O—Si 1mg KH2PO4—P 1~2.5mg 维生素B12 0.25g FeC6H5O7·3H2O—Fe 0.1mg 海水 1000cm3
施肥一般是在早上换水之后，按培养液配方的营养盐成分和数量，加入培养池海水中，并轻轻搅拌使之均匀。
4．调节光照强度 室内培养底栖硅藻，需要比较充足的光照条件。培养室应面向南、北，有较大的采光面积，屋顶有玻璃天窗，装配有窗帘，以便调节。在培养过程中，注意 在防止过长时间的直射光照射的情况下，尽可能地让培养藻类获得较强的漫射光。在阴雨 天可利用人工光源补充。
室外池需要有空架式屋顶和活动彩条布蓬，以便调节，室外池培养底栖硅藻主要防止过长时间的直射光照射。
5．生长繁殖情况的观察和检查 从藻种附片后开始的培养过程中，每天进行肉眼观察，并在必要时进行显微镜检查，了解培养藻类的生长繁殖情况。底栖硅藻生长、繁殖情况的好坏，归纳起来有如下6个方面，列表2-3如下：
表2-3底栖硅藻生长、繁殖情况的观察与检查内容
(引自陈世杰等，1977) 观察与检查内容 好 附片颜色 冲洗结果 产生气泡 镜检情况 附片上细胞密度 敌害生物 整片均匀由浅黄逐渐加深变为黄褐色 用海水缓慢冲洗也不脱落 晴天时经常产生许多微小气泡，气泡能陆续上升 硅藻色素体完好，色褐 单位面积的细胞数量不断增加 未见到或很少有敌害生物
6．收获 底栖硅藻经5～7d培养即可收获。收获的方法有下列两种形式：
(1)附片：将附片装置用过滤海水轻轻冲洗或在池中荡洗几次，然后整个移入育苗池中，培育的幼虫下沉在附片上，并以附片上的底栖硅藻为饵料。在光照比较强的育苗池中，适当
底栖硅藻的生长繁殖情况 坏 出现斑痕，变成灰白色或转为紫蓝色 冲洗立即脱落或因培养过久老化而成片脱落 附片转为紫蓝色后，产生黄豆大的气泡，悬附于附片上 色素体变形或移位，有时由褐色转为淡绿色 单位面积的细胞数量不增加或出现许多空白 发现许多敌害生物
追施少量肥料，附片上的硅藻还可以继续繁殖，可大大延长给饵时间。
(2)洗刷：用大兔毛排笔或泡沫塑料刷子，将硅藻从附片上洗刷下来，经过滤后投入育苗池。 方法Ⅱ
(一)培养装置 培养装置由圆柱形的玻璃筒、具不锈钢轴的尼龙刷和不锈钢环组成(图2—19)。玻璃圆筒内径10cm、长100cm，上、下有密封盖子，下盖中央有一进水管，上盖中央有一排水管，排水管两旁各有一小孔，供两条不锈钢环的轴伸出玻璃圆筒外。尼龙刷的直径也是10cm，长100cm，由约70 000条纤维丝组成，纤维丝直径为0.22mm，每个刷的表面积大约是3m2。不锈钢环4个，环直径约7cm，每隔20cm1个环，均匀排列，两旁用2条不锈钢轴焊接固定，不锈钢轴的顶端从玻璃圆筒上盖两旁的小孔伸出。
(二)培养方法 藻种来源可从本地海区采集，也可以用经筛选的种类进行单种培养。培养前，先把培养装置清洗消毒，然后把包含有数克硅藻(湿重)的8L硅藻悬浮液接种到容器中，30min之后，接种的硅藻附着在刷子的纤维丝上。此时可控制经砂过滤的天然海水至少以40L／h的速度不断地由下盖中央管流入培养圆筒，再由上盖中央管流出。 在自然光条件下培养。
硅藻在培养中迅速生长，当培养达到7～10d时，由于高密度的硅藻附着，尼龙刷成为黑褐色，这时可进行第一次收获。收获时，上、下拉动不锈．钢环，将刷子纤维上的藻细胞刷下，藻细胞随水流出集中。收获之后，在尼龙丝上通常保留有小部分硅藻，因此，不需要再接种即可继续培养。此后，每隔3天，又可收获1次。每月最大产量大约是350g湿重硅藻。该培养装置是以长流砂滤海水培养附着硅藻的，不用施肥。Tanaka(1984)曾用此法培养新月菱形藻与加入Erd-Schreiber培养液进行比较，其生长率基本一致(图2--20)。
如果藻种采自海区，收获的硅藻的组成有季节性变化，然而，主要的种类总是几种菱形藻(Nitzschia spp．)、几种舟形藻(Navicula spp．)、一种斜纹藻(Pleurosigma sp.)和一种双眉藻(Amphora sp．)。Tanaka(1987a)描述海洋附着生物群落在新基质上附着的顺序，依次为细菌、有活动能力的单个硅藻、无运动能力的群体硅藻、大的固着的植物和动物。在装置中培养的主要是能动的单个硅藻群，由于接种和间歇地收获，打破了在天然海区中附着的生物群落的顺序性发展，而保持了能动的单个硅藻群占优势。
在该装置连续地运行之下，尼龙刷纤维丝上的绿藻和蓝藻逐渐地增加，它们似乎抑制硅藻生长。它们牢固地粘在纤维丝上，无法被不锈刚环的上下移动所除去。因此，每隔3-4个月，需要更换1个新尼龙刷。
第三章 褶皱臂尾轮虫的培养
轮虫(Rotifer)是一群微小的多细胞动物，种类繁多，广泛分布于淡水、半咸水和海水水域中，是淡水浮游动物的主要组成部分，是鱼类、甲壳类的重要的天然饵料生物，历来受到人们的重视。人们对轮虫的生物学、人工培养和应用进行过许许多多的研究，其中以半咸水种类——褶皱臂尾轮虫的研究最为深入，现在，已在世界范围广泛培养和应用。本章内容以褶皱臂尾轮虫为代表，对其生物学和培养方法作较详细介绍，其他淡水轮虫的培养方法基本类似，希望通过学习褶皱臂尾轮虫的培养，能达到举一反三的目的。
褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis O．F．Muller)(以下简称轮虫)，具有生活力强、繁殖迅速、营养丰富、大小适宜和容易培养等特点，是理想的动物性生物饵料。
1960年日本伊藤发现褶皱臂尾轮虫作为仔鱼饵料的价值，并进行大量培养技术的探索。日本的Yashima Station of the Seto Inland Sea Farming Fisheries Association自1964年开始大量培养褶皱臂尾轮虫。1965年，Hirata and Moil发现面包酵母是轮虫的适合饵料，至70年代，在轮虫的大量培养中广泛使用面包酵母为饵料。然而，随着酵母饵料的应用，发现轮虫缺乏鱼类必需的高级不饱和脂肪酸(3 HUFA)而造成培育仔鱼的死亡，因而又研究采用了强化营养的方法。
与此同时，各国学者对褶皱臂尾轮虫的生物学和培养方法也进行了大量的研究。 我国在60年代初，傅素宝等(1962)对壶状臂尾轮虫(Brachionus bennini)进行了研究。 1972年，青岛海洋水产研究所在《人工养殖对虾》(全国农林科学实验经验交流资料)中，介绍了轮虫的培养方法。至70年代后期，解承林(1978)、郑严等(1979)、王堉(1980)、何进金等(1980、1981)、何连金(1982)、张道南等(1983)、陈世杰等(1984)、张学成等(1993)……等发表有关褶皱臂尾轮虫的生物学和培养方面的研究论文，共10余篇。1991年，中科院海洋研究所和青岛海洋大学的科研人员利用化学诱变剂和激光技术成功地筛选出1种体长为185um的小轮虫品系。该品系生长速度快，易培养，抗逆性强。为小型优质鱼类理想的开口饵料。接着又选育出耐低温品系．AC-36-37，在15℃条件下的增殖率比对照品系在25*(3条件下的增殖率高(张学成等，1993)。
至今，褶皱臂尾轮虫已成为一种极为重要的生物饵料，在世界范围内广泛培养，至少在60种海洋有鳍鱼类和18种甲壳动物幼体的培育中应用(Hirata，1989)。
虽然，褶皱臂尾轮虫已在世界范围广泛培养和应用，但从目前的情况看，还存在一些问题，应作为今后的研究方向，进行研究解决。
1．进一步探明轮虫两性繁殖的机制，为轮虫的稳定性培养和育种提供理论依据。 2．选育和引进优良轮虫品系，如能培育出100m型的小型轮虫和500～1 000m型的大型轮虫，就可以用轮虫把仔鱼一直培育到能够摄食鱼、贝碎肉及配合饲料阶段。 3．进一步探讨轮虫增殖过程中增殖率突然下降的原因、机制，使培养生产建立在稳定可靠的基础上。
4．探讨应用室外土池稳定生产轮虫的技术措施。
5．开发具有水质和增殖情况监测和过滤采收装置，生产稳定、效力高的连续培养系统。 6．建立轮虫培养技术的规范，使培养方法标准化，培养工序系统化。
第一节 褶皱臂尾轮虫的生物学
一、轮虫的分类地位和特征
轮虫在分类学的位置，意见并不统一。目前，欧美许多国家将轮虫归属于袋形动物门(Aschelmintes)的轮虫纲(Rotatoria)。我国近年，把轮虫独立为一门——轮虫门(Rota-toria)，下分单卵巢纲(Monogononta)和双卵巢纲(Digononta)，单卵巢纲分为游泳目(Ploima)和簇轮虫目(Flosculariacea)(郑重，1984)[2]。
作为生物饵料培养的轮虫，属游泳目动物。褶皱臂尾轮虫属游泳目的臂尾轮虫科(Brachionidae)，臂尾轮虫属(Brachionus)。
轮虫的身体虽小，但已是多细胞动物。它的主要特征是在身体前端头盘的周围，着生一列、二列或更多列的纤毛，叫做纤毛环。其次，轮虫消化管道的咽喉内，有一很发达的，咀嚼器。根据轮盘和咀嚼器的存在与否，就可以把轮虫和其他动物区别开来。
二、褶皱臂尾轮虫的形态特征
轮虫是雌雄异体的，一般常见的是雌体，现把雌性褶皱臂尾轮虫的形态介绍如下： 褶皱臂尾轮虫身体前端为一发达的头盘，头盘的纤毛环上有3个棒状突起，突起末端 着生许多粗大的纤毛，称为触毛(图3—1)。
连接于头盘(亦即头部)的躯干部，为一透明、光滑的被甲包裹。被甲长196～250m，宽150～202m。被甲背面观略呈长椭圆形，后半部比前半部通常不特别膨大成壶状。被甲背面前缘有棘刺6个，中央1对棘刺的长度与其他2对棘刺的长度差别不大或稍大些。被甲腹面前缘有3个凹痕，分为4个片，每片比较平或稍拱起。被甲的侧面观，腹面较平直，背面靠后1／3处明显隆起。被甲后端正中有一开孔，开孔在背面为方形，在腹面则为三角形。尾部即从此孔伸出(图3-2)。
褶皱臂尾轮虫与淡水产的壶状臂尾轮虫(Brachionus bennini)极相似，其区别在被甲的形状：
1．褶皱臂尾轮虫被甲背面前缘中央1对棘刺的长度不像壶状臂尾轮虫那样明显比其他2对棘刺长大。
2．褶皱臂尾轮虫被甲腹面前缘的特点是有3个凹痕，分为4个片，每片比较平或稍拱起，不像壶状臂尾轮虫那样，为1对长而大的棘状突起(从背面看到的两侧的棘，从腹面也可看到)。
3．褶皱臂尾轮虫的被甲背面观后半部不像壶状臂尾轮虫那样膨大成壶状。
尾部很长，上有环状纹，后端有1对铗状的趾。生在尾基部的1对吸着腺，一直通到铗状的趾，趾就利用吸着腺分泌的黏液，能够随时附着于其他物体上。 头盘和尾部都能够缩人体躯内部，体形在收缩和伸展的时候，很不相同。
轮虫的内部器官比较复杂，已经具备了消化、排泄、生殖、神经、肌肉等器官系统。 轮虫的口，位于头盘纤毛环的腹面，呈漏斗状，在3个棒状突起的下端。由于纤毛的运动，食物随着水流进入口腔。口腔下为咀嚼囊，咀嚼囊是高度变形的咽喉，具有很厚的肌肉壁，内有发达的咀嚼器，有咀嚼食物的功用。咀嚼器不论有没有食物吞下去，总是不断地在
运动。咀嚼器下为一极短的食道，通人一广大的胃。胃壁是好几个大型细胞形成的，内有纤毛。胃的外面两旁，有消化腺1对，通人胃内。胃下面为肠，肠的内壁也有纤毛。最后为肛门，肛门开口于足的基部背面。
排泄器官是1对具有焰茎球的纵长的原肾管以及1个膀胱。原肾管沿着消化道两侧纵走于假体腔中，管上有焰茎球，焰茎球内具有许多纤毛组成的颤膜，颤膜呈火焰状运动，借此激动原肾管内的水流。原肾管从假体腔内吸收废物，经焰茎球的作用运向后方的膀胱，再由膀胱排出泄殖腔外。
轮虫的排泄器官不仅具排泄作用，同时具有调节渗透压和排水的作用。外界水分不断地渗透到体内，因而需要经常排出多余的水分，以保持体内渗透压的均衡。
轮虫没有呼吸器官，但由于头盘上纤毛的运动，身体周围经常被水流冲洗，轮虫只有 一层细胞厚的薄体壁，很易交换气体，以完成呼吸作用。
脑位于咽喉的背面，较大而发达，或称为上咽头神经节。在咽喉的腹面，另有一小的 神经节，称下咽头神经节。从这2个神经节分出神经到身体各部。在足的基部还有2个比 较小的神经节。脑的背面有一明显的红色眼点。1根棒状的背触手，自纤毛环下本体背 面，伸出在被甲前端中央2个棘刺之间，背触手末端具有好几根刺毛。侧触手1对呈椭圆 形或纺锤形，位于身体后半部两旁，末端也具有刺毛。
雌性轮虫的生殖系统由单一的卵巢、卵黄腺和输卵管构成，位于假体腔的腹部。卵巢 内已经成熟的卵，经过卵黄腺和输卵管进入泄殖腔，再由泄殖腔送出体外，粘着在足的基 部，即在被甲后端孔的周围。胚胎发育，即在母体外面环境中进行。
雄性轮虫不常见到，如果出现，只在1个很短促的时间内生存。雄的个体很小，只有 雌体的1／8～1／3。身体构造简单，内部主要是1个特别发达的单独精囊，交接器大而弯 曲，游泳性强，遇到雌体就进行交配，将精子注入雌体泄殖腔内或穿过雌体不同部位的体 壁使精子进入卵巢而受精。雄体无消化系统，是不吃东西的。 三、褶皱臂尾轮虫的变异
(一)变种、亚种和系统 褶皱臂尾轮虫种内存在着形态和生理上变异的不同种群。Fadejew(1925)、KyTmcoBa(1970)、Koste Walter(1978)、Yufera(1982)……等分别鉴定了一些变种、亚种和品系[2]。
日本天然产的褶皱臂尾轮虫，已确认有L(1arge)型轮虫(大型轮虫)和S(small)型轮虫(小型轮虫)2个种群，铃木(1983)把它们分别定为2个亚种，L型为B．plicatilis tipicus，S型为B．plicatilis rotundiformis。两亚种在大小、重量、被甲前缘棘的形状和对温度的适应范围均有明显区别。L型的背甲长为140～290m，S型的背甲长为100～190m(植木，1975)[2]。 我国沿海产的褶皱臂尾轮虫的种内分类问题，至今未见有研究报告发表。
(二)环境变异 众所周知，轮虫类是形态变异极大的动物，就是同一品系也有大小和形的变化，即多型性(Polymorphism)。王家辑(1961)认为轮虫有区域性和周期性的变异，表现在其被甲大小和甲棘长短的改变。王堉等(1980)在培养褶皱臂尾轮虫过程中也发现一些形态上的变异，从实验还看出，温度对其变异有显著作用。可以确认，水温变化、饵料的质和量、增殖密度……等环境条件，是引起轮虫大小变化的主要原因。 四、生殖习性
褶皱臂尾轮虫的生殖方式有单性生殖和两性生殖两种，两种生殖方式交替进行。 (一)单性生殖～单性生殖又称孤雌生殖(Parthenogenesis)、非混交生殖(Amicticreproduction)。休眠卵发育成双倍体的雌性轮虫，称不混交雌体(Amictic female)。不混交雌体经有丝分裂产生双倍体的非混交卵(Amictic egg)。非混交卵又称非需精卵、夏卵，卵形，卵壳薄而光滑，长径56～130m，短径48～96um，成熟后无需受精，就能够迅速发育成双倍体雌性轮虫，又经有丝分裂产生双倍体的非混交卵，一代接一代，这就是单性生殖世代。
所有的非混交卵都是在卵巢中成熟后，通过卵黄腺注入卵黄，垂下输卵管，从泄殖腔总排卵口产出，最初是不定形的卵，靠总排卵口两侧的卵壳腺形成第二次卵膜，卵才能完成固定的形状(图3-3)。产出的卵到孵化成仔虫之前，靠一条短的带状物连接在母虫体上，看起来好像附着背甲后缘一样。这一带状连接物是在产卵时从一对杆腺(Stylegland)分泌出的黏液硬化形成的[2]。
产卵的频度因培养条件而有不同。初孵的不混交雌体在最适条件下，大体间隔4h可 以产卵1次。其后随着日数的增加，产卵的间隔也延长，最终变为完全不产卵。每尾雌体 平均产21个卵，繁殖持续时间为6.7d(Korstad et a1.,1989)。又据日野观察，个体最高产卵数为24个。
轮虫以单性生殖方式进行繁殖，群体数量增殖速度很快，有人称谓“爆发式的增殖”。 (二)两性生殖 两性生殖(Bisexual reproduction)又称混交生殖(Mictic reproduction)。首先，不混交雌体产生混交雌体(Mictic female)。、混交雌体经减数分裂产生单倍体混交卵(Mictic egg)，混交卵又称需精卵。如果混交雌体在年轻时不与雄体交配，不论以后有无交配混交卵均不受精；发育为单倍体的雄体。如果混交雌虫在年轻时交配，混交卵受精，精和卵结合为双倍体的受精卵，受精卵再形成厚壳的休眠卵(Resting egg)(Terry W．Snell，1987；吕明毅，1991)。休眠卵大型，长130m，宽88m，约为雌体成体体积的60％，弓型，具有较厚的卵壳，卵的一端卵黄和卵壳之间有较大的空隙，卵黄呈橘红色，但有时因饵料的质量原因，变得近白色[2]。休眠卵因亲体的营养条件和亲体的状态，其形状和大小有很大的变异(日野，1981)。
休眠卵需经过休眠阶段才能发育。单巢类轮虫休眠卵的最短休眠期，不同种类存在着差异，从2d到90d不等(Pourriot&Snell，1983)。据伊藤(1960)报告，褶皱臂尾轮虫休眠卵必需的休眠时间为7～12d，但在此情况下，孵化率低[2]。因此，估计其实际需要的休眠时间还应该长些。
休眠卵在休眠期间，可以忍耐恶劣的环境条件。轮虫行有性生殖，产生休眠卵以渡过不良环境，对维持其种族的生存、繁衍，有极重要的生物学意义。
休眠卵经休眠后，当环境适宜时，发育成第一代不混交雌体，又以无性生殖方式繁 殖。这就是有性生殖及其与无性生殖交替的过程。
然而，Meraelmen et a1．(1985)与James and Aburezeq(1990)发现，某些单性繁殖系(克隆)，仅仅有单性生殖，没有两性生殖。
(三)生活史 单巢类轮虫的生活史，分单性生殖世代和两性生殖世代，两世代交替循环，见图3-4 。
(四)诱发两性生殖的因子 轮虫以单性生殖方式繁殖，群体数量迅速增长。人工培养轮虫的目的是生产大量的生物饵料，因此，维持单性生殖方式是最理想的。而两性生殖的出现，则意味着轮虫群体数量增长减慢，甚至在产生大量休眠卵后，虫体大量死亡，造成培养的“崩溃\"。但是，从另一角度来看，休眠卵适于贮存和运输，也有利用价值。
查清和控制诱发两性生殖的因子，在培养生产中，维持单性生殖方式繁殖，当需要的时候，则可以主动地创造条件，透发两性生殖，采收和贮存休眠卵，这是极为重要的问题。 关于诱发轮虫两性生殖的因子，已有不少研究报告，但还远远不够。诱发轮虫两性生殖的因子是复杂的，有种的特异性、遗传和世代交替的内在因素的影响，更主要的是外界环境条件的刺激。
日野(1976)报告，当使用。极少量培育水进行高密度培育或一尾一尾分开培育时，混交雌体的出现率很高。在进行高密度培育时，频繁换水的组，混交雌体的出现受到抑制。由此推断，诱因可能是在培育轮虫的过程中积蓄在培育水中的什么物质[2]。
E．Lubzens，C．Minkoff and S．marom(1985)研究盐度对褶皱臂尾轮虫有性和无性生殖的影响，把轮虫(克隆)培养在盐度为0.2％～4.0％的环境中，关于无性的指数生殖率(G)(试验生长系数)的反应，可分为3种情况：
1．在盐度为3.5％或更高的环境，没有混交生殖发生，G值低于0.30/d。
2．在盐度为0.2％～3.0％的环境，有低水平的混交生殖，G值在0.40～0.50/d范围。 3．在盐度为0.4％～2.0％的环境，有高的混交生殖，G值在0.50～0.85/d之间。 此结果表明，在盐度最适合单性生殖的时候，也适合两性生殖[31]。
Akinori Hino and Reijiro Hirano(1984)研究水温与褶皱臂尾轮虫两性生殖率的关系，把轮虫培养在4种温度(1、5、20、25和30℃)条件下，结果在低于25℃的较低温度下，两性生殖率增加，而在25～30℃之间，则无明显区别[29]。
今村等(1979)通过温度突变的刺激，把低温条件下培养的轮虫放到加温至29～30℃的培养液中，每2天反复操作1次，可以人为地促使轮虫形成大量受精卵[2]。 从目前的资料综合来看，诱发轮虫两性生殖的环境因子，主要有： 1．高的种群密度。
2．低温与温度的剧烈变化。 3．盐度的突然改变。
4．饵料的型式和数量的改变等。
当然，这是初步的，要真正了解轮虫两性生殖的机制和控制条件，还必须做大量的工作。 五、褶皱臂尾轮虫的生态条件
褶皱臂尾轮虫广泛分布于温、热带地区的海水和半咸水水域中，我国沿海港湾和半咸水池塘均有分布。
褶皱臂尾轮虫对环境的适应性比较强，现将其生态条件介绍如下。
(一)温度：不同的品系，对温度的适应范围差别较大。何进金等(1980)报道，水温在5℃时，轮虫停止活动和繁殖，因此5℃是轮虫生活的最低温度；10℃是轮虫繁殖的临界低温，轮虫在10℃时还有极低的繁殖能力和缓慢的活动能力；温度为15C和20℃时，轮虫虽能繁殖，但速度较为缓慢；水温为25℃、30℃、35℃时，轮虫的繁殖速度随着温度的升高而加
快，25～35℃是轮虫繁殖的适温范围；40℃是轮虫生活和繁殖的临界高温，虽然轮虫在40℃能繁殖，但培养到第六天时，就出现大量死亡。王堉等(1980)报告，在5～40℃的实验温度范围内，轮虫都能生长繁殖，较适宜的繁殖温度为25～40℃，而以30~35℃条件下繁殖最快，此结果与何进金的报告基本一致，但略偏高。日本大上(1977)报告，L型轮虫和S型轮虫两个亚种对温度的适应范围差别较大，S型轮虫在34℃的条件下，一天的繁殖率最高达250％，而L型轮虫在25℃的条件下，一天繁殖为170％，高于25℃繁殖率下降；在15℃以下的较低温度条件下，S型轮虫几乎不繁殖，而L型轮虫在10℃的条件下，还大量繁殖。在大量培养池中，能取得最高繁殖速度的水温，两个品系也不相同，s型轮虫近30℃，L型轮虫则为12～15℃[2]。在热带地区池水水温为23～37℃(年平均水温为27-30℃)褶皱臂尾轮虫能良好生长(Shirota，1967)。在昼夜温差较大的环境下培养轮虫，繁殖很慢(陈世杰，1984)。 (二)盐度 褶皱臂尾轮虫为广盐性生物，其最适盐度范围，不同品系不同，也依原生活环境盐度的不同而略有差别，但对盐度的突然变化耐力较低。
王堉等(1980)报告：褶皱臂尾轮虫能在0.2％～5.0％的盐度范围内生长繁殖，但其适宜的繁殖盐度为1.0％～3.0％，而尤以1.5％～2.5％为宜。何进金等(1980)的试验表明，在1.000～1.040的比重范围内，轮虫都能繁殖，培养轮虫的适宜比重在1.000～1.015之间；比重在1.020以上，比重越高，轮虫的增殖量越少。褶皱臂尾轮虫在盐度为0.38％的养鳗池中能生长繁殖，在盐度为0.9％的咸水池中能大量繁殖(伊藤，1955)。在热带地区，轮虫在盐度高达4.31％的水中也能正常生活(Shirota，1967)。Hoff and Snell(1989)认为褶皱臂尾轮虫忍受盐度范围为0.1％～6.0％，而1.0％～2.0％时生长最好。他们讨论了S型轮虫和L型轮虫两个亚种的耐盐性，其最适宜于培养生产的盐度分别为2.0％和3.0％。在3.0％盐度海水中的L型轮虫，含有最高的3HUFA;而在1.5％～2.0％盐度海水中S型轮虫含有较高的3HUFA。褶皱臂尾轮虫对盐度较大幅度的突变的忍耐力较低，把盐度为0.38％的养鳗池中的轮虫直接移到盐度为1.8％以上的水中；一天后全部死亡。但如果采取逐渐加大盐度的办法，通过1个月4次提高盐度的过程，到盐度为3.25％的海水中培养，获得的最高密度值(225个/m1)，仅比相同条件的热带天然水池的最高密度值略低(伊藤，1960)。
(三)光照 在暗条件下和光条件下，褶皱臂尾轮虫均能正常生长繁殖。岩崎良教等(1975)报导，在暗的条件下繁殖较好。而日高(1972)的结论则刚相反，认为在光条件繁殖好。国外室内培养轮虫多利用人工光源照明，可连续照明，也可间隔照明，20001x是常用的光强度。Hoff and Snell(1989)建议，光：暗周期为18:6h[27]。何进金等(1980)分成全暗、3 2001x、4 4001x 6 4001x、和0 0001x五组进行试验，结果如表3-1所示。从全暗到10001x范围内，轮虫都能正常地繁殖，但轮虫在光照条件下比全暗条件下繁殖迅速，光照强度不同，轮虫的繁殖速度也不同，轮虫繁殖的适宜光照范围为4 400-10 000lx之间[13]。Fukusho(1989)认为，光照的直接效应并非直接因素，很可能是刺激水槽中光合细菌和微藻的生长，从而促进了轮虫的增长。
综合上列材料，可以肯定，在光照条件下培养轮虫比全暗的条件下培养好，在一定的光照度范围内，繁殖速度随光照强度的增加而增快。但光对轮虫的有益效应是直接的或间接的，其促进轮虫繁殖的机理，尚未清楚。
(四)酸碱度 褶皱臂尾轮虫对环境酸碱度的适应范围较广，在pH5～10的范围内，均能
正常生长繁殖[27]。而伊藤(1980)和Fukusho(1989a)报告的适应范围则为pH5～9。Hoff and Snell(1978)发现在pH6.5~8.5之间，轮虫群体生长没有差别。何仲森(1987)报告，在pH6～9的范围内，轮虫的生长速度无明显差别。
关于轮虫生长繁殖的最适酸碱度范围，有下列报告：pH7.5～8.5(Hoff and Snell，1989)；pH7.5~8.0(何仲森，1987)；pH7.0~7.5(古川等，1973)；pH8.0左右(平山等，1972)。 以上报告关于轮虫对酸碱度的适应范围和最适范围不完全一致，其原因可能是由于不同品系的适应性存在着差别的缘故。
Furukawa and Hidaka(1973)认为轮虫的最适酸碱度范围可能随饵料类型的不同而变化。在投喂单胞藻饵料的轮虫池水，开始3d pH随光照强度增加而升高(见表3-1)，培养3d后，pH又随轮虫的数量增加而降低(何进金等，1980)。Yu and Hivayama(1986)报告，轮虫密度高时的pH为7.3-7.8。北岛等(1981)实验的结果，如果添加小球藻培 养轮虫，开始培养时pH略有升高，但在以后的培养过程中pH通常低于一般海水，在pH7.5～8.1范围内，轮虫密度最高。
(五)溶解氧 褶皱臂尾轮虫对水环境中溶解氧含量的适应范围很广。以小球藻为饵 料，在溶氧量为5～7mg／L(接近饱和状态)时，轮虫生长繁殖正常；以油脂酵母为饵料，在溶氧量为2mgA，时，轮虫繁殖良好；轮虫对低氧含量甚至短时间缺氧的耐受力很强，把轮虫放到以氮置换氧(即缺氧)的海水中，经过6h，半数轮虫死亡，经过12h，全部死亡；把达半数致死的轮虫恢复充气48h，轮虫又能正常生长繁殖(安部、长野等，1982)。
在培养轮虫过程中，溶氧量应保持在1.5mg/L以上。因氧的消耗受温度、饵料类型和轮虫的密度影响甚大，所以在培养中应根据具体情况，调整充气量，以维持水中溶氧量在应有的水平以上。仅用微藻作为饵料，充气量比用酵母为饵料时要小，甚至不需充气。
因为对于藻类，只要提供足够的光照，即．可产生大量氧气，而酵母和细菌则是耗氧的。Fukusko(1989)报道：20℃时，L型轮虫和S型轮虫每个个体每天消耗氧为7.07 x 10-5ml；25℃时，增至10.04 x 10-5ml；30℃时，增至16.48~10-5 ml。 Hirata等(1987)注意到耗氧与饵料可得性之间的相互关系，随着摄食量的增加，耗氧量也增加，氧消耗范围为2.4～16.8~10-5ml／每个轮虫·d-1 Hoff and Snell(1989)建议，培养中采用“适中的低充气\"。通常，在1个5m3水槽中装1个散气石，充气量为12～13L/in，另装1个气举泵，充气量为15L/min。又如，在1个10m3水槽中装8～10个散气石，每个散气石以8L/min的气量充气。Fushimi(1989)。报告，用油脂酵母培养轮虫的后期阶段，轮虫密度近乎1 000个/ml，每百万轮虫每天投喂酵母1.2g，必须提供60～100L/min.m-3的充气量。
(六)非离子氨 非离子氨(即游离氨、分子态氨)对水生生物的毒性很高。在轮虫培养过程中，轮虫的排泄物及残饵的分解，造成培养池水中非离子氨的积累。Yu and Hivayama(1986)的研究，确认非离子氨水平是影响褶皱臂尾轮虫增长的限制因素。
Coves et a1．(1990)报告，褶皱臂尾轮虫对[NH3+NH4]含量的可容忍范围为6～10mg/L。Hoff and Snell(1989)建议，非离子氨的浓度不宜超过1mg/L。
饵料和轮虫的营养价值
褶皱臂尾轮虫食性广泛，可食多种饵料，包括细菌、酵母、单胞藻、小型原生动物、有机碎屑、微生物团絮(人造有机碎屑)乃至微颗粒饲料等。关于饵料的颗粒大小问题，Hino等
(1980)测定轮虫摄食的饵料的最大直径为22～30m。伊藤(1964)则认为以10～12m为好。而一般来说，轮虫的饵料大小宜在25m以下，尤以15m以下为理想。饵料的营养成分，尤其是3HUFA的含量，直接影响轮虫的营养价值。据分析，海水小球藻和油脂酵母含有较式的3HUFA。各种饵料的营养成分差异很大，其他营养成分对轮虫营养价值的影响，尚缺少深入研究。
1．单细胞藻类 各种大小适宜的单细胞藻类，大多数都是轮虫的良好饵料。以单胞藻培养的轮虫，营养价值高。在各类单胞藻饵料中，普遍认为绿藻优于金藻，金藻又优于硅藻。在日本应用得最多的是海水小球藻,因为它含有丰富的3HUFA。而冈山、福所(1984)报告，用Tetraselmis tetrathele(一种扁藻)饲喂轮虫，其繁殖率超过小球藻。我国多应用亚心形扁藻、微绿球藻、盐藻、异胶藻、三角褐指藻、小新月菱形藻……等单胞藻类饲养轮虫，以亚心形扁藻的效果最佳。
轮虫是利用头部纤毛的运动造成水流，把水流带来的食物粒子经过滤聚集送人口中。轮虫的摄食量很大，据北岛等(1976)实验，当轮虫密度超过100个/ml时，12h可把1 600万个细胞/ml的小球藻吃掉一半，24h差不多可以全部吃光，投饵密度同摄饵率之间呈正相关关系。但也不是单胞藻饵料愈多愈好，饵料密度过高，对轮虫生长繁殖有一定的抑制作用(平山，1973；何进金，1980；陈世杰，1984)。在培养过程中，必须按轮虫的密度，掌握好投饵量。以下列举几个投饵量的例子作为参考。山崎、平田(1985)报道，以小球藻饲喂轮虫，在20℃、25℃、30℃、35℃的条件下，最有效的投饵密度，分别依次为160万、180万、200万及220万个细胞/ml。以亚心形扁藻为饵料，轮虫的接种密度为1个/ml时，投饵量为1万～15万个细胞／ml(在此范围内随着轮虫密度的增加而增加)(王堉，1980)。轮虫接种密度为2．5个/ml，亚心形扁藻的日投饵量为20万～100万个细胞/ml，开始培养3天内投20万细胞/ml，此后逐渐增加。异胶藻的投饵量为1 500万～2 000万个细胞／ml(何进金，1980)。 用单胞藻培养轮虫，存在的最大问题是需要许多水池来培养单胞藻，花费大量设备和人力。例如日本一个海产鱼类种苗场各种水池的容量比，大体上育苗池：轮虫培养池：小、球藻培养池为1:0.5～1.8:1.5～2.1。因此，在实际生产中，多采用酵母类和单细胞藻类配合使用的方法代替单一使用单胞藻饵料培养轮虫。其次，单纯使用单胞藻培养轮虫，轮虫密度不大，在生产性培养中一般密度高的也只有40~60个/ml的水平，难以适应生产性苗种培育的需要。
2．酵母类 作为轮虫饵料的酵母，有面包酵母、啤酒酵母、油脂酵母、活性干酵母等。1947年，日本平田、森以面包酵母作为代替海水小球藻为饵料饲喂轮虫取得成功。现在用酵母和海水小球藻配合饲喂轮虫，已成为一项规范化的技术。
面包酵母主要用于制面包，一般以糖蜜或麦芽汁为原料，在好气性条件下培育而成。商业生产用的菌株是属于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酵母是在培养后，经离心分离集菌，再经真空过滤器脱水，用压榨成型机成型的。一般以鲜菌状态，在4℃条件下保存、运输到消费者手中。面包酵母不耐盐，在海水中存活时间不长。因此，应采用分次投饵和控制投饵量。酵母类作为饵料，成功地使轮虫培养达到400～600个/ml，甚至1 000个/ml以上的高密度。而且，酵母具有供应稳定、易于贮藏、投喂简便……等优点，从而大大简化了培养单胞藻的设备和人力，降低了成本。
但是，人们发现在对真鲷、石鲷仔鱼连续投喂用酵母培养的轮虫7～10d后，鱼苗会出现食欲减退、游泳缓慢、腹部膨胀等症状，并在2～3d内全部死亡。而投喂用酵母和藻类混合饵料培养的轮虫则没有此类情况。通过对海水小球藻和面包酵母两种饵料以及用这两种饵料培养的轮虫的主要营养成分进行测定分析，发现两种饵料的差异主要是酵母缺少海产鱼类生长发育所必需的3HUFA。用海水小球藻培养的轮虫，体内EPA即20:53(二十碳五烯酸3)的含量为总脂肪酸含量的27％～28％，而用海水小球藻和面包酵母混合培养的轮虫，体内EPA含量为11％～12％，单用面包酵母培养的轮虫，体内EPA含量仅为1％～2％o进一步的研究又发现，如将酵母培养的轮虫在投喂前用小球藻进行二次强化培养，则EPA的比例随培养时间延长而增加，如强化培养两天就可达到单纯用小球藻培养的水平(即 27％)，而在生产上强化6~12h，便足以能防止由于缺少必需脂肪酸而导致仔鱼死亡。目前生产上采用的强化营养的方法，主要有下列几种： (1)用面包酵母和海水小球藻混合培养轮虫。
(2)在制造面包酵母工序中，供给含有丰富的~3HUFA的油脂(如鱼肝油)，使酵母菌体中含有这种油脂，称油脂酵母。利用油脂酵母饲喂轮虫，不会有营养上的缺陷。但是，用油脂酵母饲育轮虫，存在部分脱出的油脂污染轮虫培养池的池壁，可通过安装过滤排除悬浮物的装置和搅拌清扫机，得到改善。
(3)用海水小球藻或油脂酵母对用面包酵母培养的轮虫作二次强化培养。 (4)用以生鸡蛋黄和水乳化的鱼肝油与面包酵母一起对轮虫进行强化培养。 (5)通过在小球藻培养中添加某些维生素的方法，提高小球藻的营养价值，以提高轮虫的增殖率和维持轮虫培养的稳定性。用富含维生素B12的小球藻和酵母一起混合培养轮虫比用常法培养的小球藻和酵母培养轮虫，轮虫的增殖较稳定，增殖率亦较高。平山(1983)报告，面包酵母由于添加了维生素B12，其饵料价值得到显著改善。不加维生素B12的，轮虫产出的卵有很多不孵化，而加进维生素B12后，即全部孵化，参加繁殖，说明维生素B12对轮虫繁殖有良好效果[2]。
3．微生物团絮、所谓微生物团絮就是人工制成的有机碎屑。是用葡萄糖为碳源，用尿素、磷酸钾为辅助原料，以海水中生成的微生物群为主体的有机悬浮物。团絮中主要的生物种是酵母和细菌。多贺、安田等(1979、1980)用微生物团絮作为轮虫饵料。今田等(1982)用酒精发酵母液作为微生物团絮的有机物源，应用于轮虫培养，获得了较好的效果[2]。 七、生长和繁殖
我国通常培养的褶皱臂尾轮虫的雌体，生长至被甲长达140um时，即开始产卵繁殖，此即生物学的最小型。开始产卵雌体的大小也因品系的不同和环境因子的影响而有变异。非混交卵初产出时较小，随着卵的发生，短径膨大。一般卵产出到孵化的时间，受温度的影响甚大，15℃为1～2d；20℃为1～1.5d；25℃为0.5～1d；30℃为6～18h(塚岛等，1983)。刚孵出的仔虫形态即和成虫相似，平均被甲长96m，被甲宽72m。仔虫在水中活泼游泳，摄取饵料，并迅速生长。孵化后的仔虫生长发育至成虫所需的时间，受温度、饵料、水质……等条件的影响，在饵料、水质……等条件基本满足的情况下，15℃为2～3d；20℃为l~2d；25℃为0.5~1.5d，随着水温升高而缩短。
在环境条件适宜时，褶皱臂尾轮虫的繁殖很迅速，水温25℃，饵料充足，经10d培养，
由原来1个/ml增殖到1 500～2 000个/ml(青岛海洋水产研究所，1972)。平均温度22～24.5℃，盐度2.2％～2.5％，饵料充足，经10d培养，由原来3个/ml(多数带卵)分别增殖到610～980个/ml，增长了203-297倍(解承林，1978)。用鲜酸母为饵料，接种密度43个/ml，经7d培养，达到4 256个/ml，这是目前达到的最高密度记录(张道南、乔振国等，1983)。以上是几个室内小型培养的例子，说明轮虫繁殖很迅速，并能达到很高的密度，有人称谓“爆发式增殖”。但在大量培养生产中，由于环境条件的关系，轮虫的增殖速度和达到的密度，比上列例子低很多。 八、寿命与死亡
褶皱臂尾轮虫的寿命长短，受温度、饵料以及其他环境条件的影响，不同的品系也有 不同。一般来说：温度高，寿命短，温度低，寿命长；环境条件(特别是饵料质量)好，寿命长，环境条件不好，寿命短。我国培养的褶皱臂尾轮虫的寿命，大约为7～10d，如环境条件不好，只活3～4d。Korstad等(1989)报告，单纯用等鞭藻饲喂轮虫，在20～22℃的条件下，雌虫的平均寿命为10.5d；繁殖持续时间为6.7d．，每个雌体平均产生后代21只。
第二节 轮虫的分离和培养
一、轮虫种的分离
培养轮虫首先需要有种轮虫，种轮虫可以由有关单位供应，也可以自己分离。 褶皱臂尾轮虫生活在半咸水和海水中。春天，当水温升高达15℃以上，在海边高潮区的小水洼、小水塘等小型静水体中，尤其水质较肥，浮游藻类繁生的水中，常生活着褶皱臂尾轮虫。可用网目为120m左右的浮游生物网(即一般捕捞浮游动物用的粗网)在这些小水体中捞取，最好是在清晨日出之前，轮虫向水表层游动时捕捞，效果更佳。把捞取的样本，先用网目300m的尼龙网滤掉小鱼、杂物、再集中于容器中放置数小时。利用轮虫对于缺氧或恶劣环境抵抗力强的特性，待桡足类及其他浮游动物等死亡沉于水底时，再用纱布或滤纸平放水面使浮在水上层的轮虫黏附其上，取出纱布把轮虫冲洗人另备容器中，即可得到较纯的轮虫。按此方法再经2~3次分离之后，可得到纯种轮虫。也可把采集的水样在解剖镜下检查，如发现褶皱臂尾轮虫，即用微吸管吸出。为了避免混杂其他动物，可先把吸出的水置一清洁的凹玻片中过滤，经观察准确后再吸人试管或小三角烧瓶中培养。轮虫个体较大，很容易用吸管分离。在分离过程中应测定轮虫原生活环境的盐度，培养轮虫用水的盐度应该与原生活环境的盐度相近，因为褶皱臂尾轮虫对盐度的突然的变化耐力较低。待分离培养成功后如需要改变培养盐分，必须经过逐渐驯化过程。 二、休眠卵的孵化
轮虫种可以长期培养保存，也可以休眠卵的形式长期保藏。如果是后者，则在培养前首先必须把休眠卵孵化。
(1)休眠卵孵化的环境条件：光照对在黑暗条件下保存的休眠卵，是结束休眠的必需条件。
休眠卵能在0.15％~3.5％的盐度范围内孵化，但以1.5％～2.0％的盐度最适宜(王堉，1980)。
在5-35℃的温度范围内，休眠卵都能孵化，但孵化时间则随温度的不同而有明显差异。最适宜的孵化温度为20~25℃。
在孵化容器中，加入少量扁藻或小球藻藻液，使水略呈很淡的藻色，有利于孵化。 (2)休眠卵的孵化方法：为了避免敌害生物的危害，清除小型甲壳动物，休眠卵孵化及培养仔虫的海水，需要用300目的密筛绢网过滤，并加入淡水调节盐度至最适范围。 可用各种玻璃培养缸、小水族箱为孵化容器，容器在使用前应清洗、消毒，再用过滤海水冲洗干净。然后加入孵化用海水，再加入少量藻液。
把少量轮虫休眠卵放人海水中孵化。休眠卵混杂有大量的藻渣，用量太多易引起水质变坏。孵化容器放置在靠近窗口或有人工照明的位置。孵化期间每天需搅拌1～2次。 如果条件适宜，一般在3～7d的时间内，即可孵化。因为在孵化缸存在着大量死藻渣，水质不好，孵化后的仔虫应吸移到备用的培养容器中培养。
三、培养方式
(一)依培养条件的人为控制程度分粗养和精养。
1．粗养(Extensive culture) 培养池为室外大型水泥池(一般50m3以上)或土池(一般600～1 500m2)，对其环境条件难以人为控制。培养达到的轮虫密度较低。以半连续培养方式培养，每天、隔天或根据需要采收部分轮虫。
粗养轮虫的成本低，虽然培养的密度不高，但由于培养水体大，总收获量也很大。缺点是培养不够稳定。我国以粗养方式培养轮虫比较普遍。
2．精养(Intensive cul-ture) 培养池为室内小型池，一般0.5～1m3，大的5～10m。严格控制培养条件，培养达到的密度高，一般达500～1000个/ml。以一次性培养、半连续培养或连续培养方式培养。精养轮虫的效率高，稳定。但要求的设备条件高，成本也高。我国目前还较少采用。
(二)依培养和收获的特点分 一次性培养、半连续培养和连续培养。
1．一次性培养(Batch culture) 在轮虫培养池中，先培养单胞藻饵料，待浓度较大后，接种轮虫进去，补投酵母饵料，培养，经4～7d，繁殖达到一定的密度，一次全部采收。采收后再清池重新培养。若干个轮虫池按计划培养，轮流采收(图30)。一次性培养的轮虫培养池较小，一般103以下，但近年用较大型池进行一次性培养也逐渐增多。
一次性培养是最常用的培养方式。但因培养中，经常清池、接种，比较麻烦。 2．半连续培养(Semi-continUOUS culture) 半连续培养又称间收法培养。典型的半连续培养，除轮虫培养池外，还需要容量较大的专用单胞藻饵料培养池，培养大量藻类备用。在轮虫培养池中，首先培养藻类饵料，后接种轮虫，培养中补投酵母饵料。待轮虫繁殖达一定密度后，每天将一部分轮虫用虹吸法连海水一起采收。采收后，把藻类培养池的藻液抽入轮虫培养池，补回采收的部分，恢复原来水位。继续培养，继续每天采收。约经15～2 5 d的培养，粪便和残饵积累，水质逐渐恶化，此时需全部收获，清池，重新培养。 半连续培养一般使用室外大型池(50m3以上)，大多以粗养方式培养。是目前培养轮虫最常用的方式。
3．连续培养(Continuous culture) 连续培养装置为室内封闭式系统，培养条件严格控制，提供高质量饵料，采用Droop(1975)描述的“恒化器”(Chemostat)的原理自动控制采收。James
and Abu-Rezeq(1989a，1989b，1990)采用1L和l00L容量的“恒化器式\"轮虫连续培养装置，以Nannochloropsis oculata和面包酵母为饵料，培养S型轮虫，获得3．08亿个轮虫／m3·d-1的最高产量和最好的饵料转换效率。他们认为该系统适宜于大规模轮虫生产。 连续培养目前基本上还处于实验室试验阶段。 四、一次性培养
(一)培养容器、培养池 各种玻璃培养缸、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池，都可以用来培养轮虫。室内培养种轮虫以及进行各种培养试验，一般使用小型玻璃容器，玻璃缸，水族箱等。生产性培养一般使用玻璃钢水槽和水泥池。一次性培养用的水泥池，大都较小，水深80cm左右。
(二)培养用水 培养轮虫用水，需经砂滤器过滤或密筛绢网(300目或标准25号筛绢)过滤以除去小型甲壳动物等敌害生物，并加入淡水调节盐度至最适范围(1.5％～2.0％)。 如果需要在轮虫池先培养单胞藻饵料，则必须再用次氯酸钠(有效氯20mg/L)处理后使用(方法见第182页)。
(三)培养单胞藻饵料 室内小型培养，多用单胞藻为饵料，可先使用专门培养单胞藻的设备培养好单胞藻备用。生产性培养，一般先在轮虫培养池培养单胞藻，待其生长繁殖达到一定的浓度(小球藻或微绿球藻为1 000～3 000万个细胞／ml，亚心形扁藻为20万-30万个细胞／m1)，即可接种。
(四)接种 接种轮虫的接种量应根据轮虫种的多少而定，一般来说，接种量大些好，接种密度越大，繁殖速度越快，可缩短培养时间(图3-5)。
如单纯以藻类为饵料培养，接种轮虫密度为0.1～0.5个/ml时，经7～10d培养，可达到收获的密度，接种的数量少些，除了需要较长的培养时间外，其他并无不良影响。 用面包酵母为饵料培养轮虫，接种量必须大。在25℃的条件下，轮虫的接种量以14～70个／ml适宜(张道南等，1983)。
(五)投饵 室内小型培养轮虫，多用单胞藻为饵料。一般每天投饵2次，除参考各种单胞藻的合适投饵量(见第102页)外，主要靠观察水色调整，投饵后水应呈现出淡的藻色，一次投喂量不宜过多。饵料被吃光时，水变清，呈淡褐色(轮虫的本色)，应及时补投饵料。 生产性培养轮虫，多以单胞藻和面包酵母混合投喂，或以酵母为主，甚至全部投喂酵母。典型的一次性培养，是先在轮虫池培养藻类饵料，达到一定浓度后接种轮虫进池，池中轮虫除消耗池中藻类饵料外，每天投喂面包酵母2次，日投饵量为每100万个轮虫，1～1.2g。根据轮虫的摄食情况，作适当调整。
以酵母饵料为主，甚至全部投喂酵母饵料培养的轮虫，由于营养上存在缺陷，应进行强化营养培养。
(六)搅拌或充气 小型培养，在每次投饵后需轻轻搅拌，一方面使饵料分布均匀，另一方面也可增加水中的含氧量(图3-6)。生产性培养，水容量较大，必须充气。单纯投喂单胞藻饵料，由于藻细胞在光合作用过程中放出大量氧气，充气量可小些，或间歇充气，甚至可完全不充气。而酵母(尤其是油脂酵母)饵料则是耗氧的，用酵母饵料培养轮虫必须连续充气。一般来说，充气量应适中；l不宜过大。但是用油脂酵母为饵料，轮虫密度近乎1 000个/ml时，必须提供60～100L／min·m-3的充气量(Fushimi，1989)。
(七)生长情况的观察和检查 轮虫生长情况的好坏和繁殖速度的快慢是培养效果的反映，所以在培养中需经常观察和检查轮虫的生长情况，以便针对存在问题及时采取措施，不断改进培养方法。
每天上午，用1个小烧杯取池水对光观察，注意轮虫的活动状况以及密度的变化。如果轮虫游泳活泼，分布均匀，密度加大，则为情况良好。如果活动力弱，多沉于底层，或集成团块状浮于水面上，密度不增加甚至减少，则表明情况异常。对轮虫的密度变化，最好能进行定量，定量方法参考第180页。
除肉眼观察外，应吸取少量水样于小培养皿中，在解剖镜或显微镜下检查。生长良好的轮虫，身体肥大、胃肠饱满、活泼游动、多数成体带非混交卵，少的1～2个，多的3～4个(但用酵母培养的轮虫一般只带卵1～2个，很少有3个)、不形成休眠卵。如果轮虫多数不带非混交卵或带休眠卵；雄体出现；轮虫死壳多，沉底，活动力弱等，都是不良现象。通过镜检还可以了解轮虫胃含物多寡，及时调整投饵量。
(八)收获 一般经过3～7d的培养，轮虫密度达到100～200个/ml养)或400～600个/ml(精养)，即可收获。一次性培养是一次全部收获的。收获时，可用网目小于100m的筛绢制成约40L容量的网箱，网箱高40cm，外有一方木框支撑，网箱捆紧在木框架内，张开。把网箱连同木框架放在一高为20cm的大塑料盆内，用虹吸法把池水用管吸出，流入网箱内过滤。待网箱内轮虫密度大时，用塑料勺舀取作为饵料投喂或作为种轮虫继续培养。
五、半连续培养
半连续培养是目前培养轮虫常用的方式，以下介绍一种典型的用水泥池为容器的半连续培养方式。
(一)培养池 分轮虫培养池租单胞藻饵料培养池2种，均为室外水泥池，2种池的容量大约以1：2的比例配套使用(轮虫池为1，单胞藻池为2)。轮虫培养池的容量为30或40m3，池深1.4m(有效水深1.2m)。单胞藻培养池的容量为100～200m3。
(二)培养单胞藻饵料 把轮虫培养池和单胞藻饵料培养池清洗，消毒，灌水，施肥，培养单胞藻饵料。
(三)接种 当藻类饵料繁殖达到较大浓度时，以每ml水体接人轮虫种30～50个的数量，把轮虫种接入轮虫培养池。
(四)培养 接种轮虫后，充气培养。轮虫除摄食池内单胞藻饵料外，还投喂面包酵母，每天投量为每100万个轮虫投喂酵母1～1.2g，分上、下午2次或多次投喂，先把酵母在桶中加水搅拌均匀后再拨人池中，如果是用活性干酵母投喂，需用电动搅磨机把团粒状的酵母于加水搅打成分离的单个酵母细胞(在水中成悬浮状态)再投喂。
(五)采收 培养4～5d后，轮虫的密度超过100个／ml时，根据轮虫的繁殖率，每天采收水容量的1/5～1/3。采收方法同一次性培养。采收后立即从单胞藻饵料池抽取藻液入轮虫培养池补回采收的水量，并继续投喂酵母，充气培养，又每天继续采收一部分。
由于轮虫培养池中的残饵、轮虫粪便等物质会随着培养天数的增加而增多，会使水质逐渐恶化，、每次培养时间一般能维持15～25d，最多达30d，最后全部采收，清池，开始新一轮的培养。
六、大面积土池培养
我国的鱼、虾育苗场大都拥有一定量的土池，利用土池培养轮虫技术较易掌握，成本低，收获量大，轮虫质量好。
土池培养实际上也属于半连续培养方式。
(一)培养池 培养池的选址，要求排灌水方便，在盐度较高的海区最好有淡水源，在必要时可调节海水盐度。
培养池的面积大小和数量，主要依育苗生产的需要决定。一般年产2亿尾中国对虾虾苗的育苗场，配4～5口面积为1 000m2左右的轮虫培养池。如育苗数量大，也可以用面积为0.7～1hm2的养虾池培养轮虫。
一池的底质以不渗漏的泥质或泥沙质为好，要求池底平整，围堤坚固。池的有效水深为1～1.2m。可采用水泵动力提水，也可在闸门安装250目或300目密筛绢的过滤网，涨潮时海水经过滤后进入池内，纳水时注意控制水量，让海水小量缓慢流人，避免过滤网损坏。
(二)清池 清池方法有两种。一为干水清池，把池水排干，在烈日下曝晒3～5d，即可达到清池目的。如果认为有必要，可再用清池药液，部分或全部泼洒池底和池壁。另一为带水清池，即培养池连池水一道消毒，按水体量加入药物杀死敌害生物，在没有池水浸泡到的池壁，则用清池药液泼洒消毒。
清池的药物常用的有：
1．漂白粉 漂白粉的有效氯含量为25％～30％，贮存时间太长会失效，因此在使用前必须测定其有效氯含量。清池的漂白粉用量为60g/m3，使用时先加少量水调成糊状，再加水稀释泼洒。漂白粉清池可杀死鱼类、甲壳动物、藻类和细菌。清池后药效维持3～5d，即可消失。
2．氨水 农用氨水含氨量为15％～17％，清池的氨水用量为250mg/L，使用时稀释 后泼洒。氨水清池可杀死鱼类、甲壳动物及其他动物，并有肥水作用。清池后2～3d药效 消失。
3．五氯酚钠 清池的五氯酚钠用量为2-4mg／L，用水溶解后均匀泼洒。可杀死鱼类、甲壳动物、螺类和水草。药效消失时间为数小时。 4．其他药物及用法参考鱼、虾养殖学。
(三)灌水 清池药效消失之后，即可灌水人池。灌入池中的海水，必须通过250目或300目的密筛绢网过滤，以清除敌害生物。一次进水不宜过多，第一次进水约20～30cm，随后再逐步增加。
(四)施肥培养单胞藻饵料 灌水后即施肥培养单胞藻饵料。采用有机肥和无机肥混合使用的方法，可使轮虫培养池在相当长的时间内维持肥效，以供应藻类大量繁殖的营养需要。有机肥的种类很多，但以发酵鸡粪的效果较为理想，鸡粪必须经过发酵，尽量避免使用新鲜鸡粪。近年，随着工厂化养鸡业的发展，一些单位将鸡粪筛选、高温干燥后制成以鸡粪为主的鱼用饲料，如能使用这种鸡粪，效果更佳。一般每公顷池施发酵鸡粪1 500~2 250kg为基肥。如果是鸡粪发酵饲料,施肥量可减少1/3。施肥时，先将1/2的鸡粪肥均匀撒于池内，其余1/2堆在池塘四周，依靠雨水使肥分缓慢地流入池中或作日后追肥用。施好基肥后每公顷再施30kg尿素和7.5kg过磷酸钙。
在清池过程中，除杀死轮虫的敌害生物之外，轮虫的饵料——单细胞藻类也被杀死。施
肥培养单胞藻饵料需要有藻种，有条件的可以接种人工培养的优良藻种(如海水小球藻、扁藻等)人池培养。但由于土地的面积大，，需要藻种的数量很大，一般难以解决。因此，在土地培养轮虫多利用在纳入天然海水时同时带进来的各种混杂的藻类作为培养种。所以就是带水清池的培养池也需要纳入(或水泵提水)部分海区的新鲜海水，以解决培养的藻种问题。 施肥培养单胞藻饵料，一般经4～7d藻类即可繁殖起来。当藻类数量太大，池水透明度低于20cm时，可隔天加水5～l0cm。当池水水位升到50cm时，即可接入轮虫种。在培养过程中，根据藻类生长情况，每隔5~7d，以同样的量追施化肥1次。
(五)接种 轮虫的接种量，一般以0.5~1个/m3较为适宜。可以把经不断扩大培养的种轮虫或把轮虫繁殖已达高峰的培养池的轮虫，连池水带轮虫抽入池中接种。
(六)维持藻类饵料的数量在适宜的范围 土池培养轮虫，一般是不投饵的，轮虫主要摄食施肥培养的藻类饵料。由于培养的藻类饵料的增殖有一定限度，轮虫的密度不能过高，否则培养的藻类饵料一下子被吃光，因缺乏饵料而导致轮虫的大量死亡。为了平衡两者的关系，一般控制轮虫密度在5～20个/ml之间，每天将超出部分轮虫收获，另一方面通过施追肥，维持藻类的增殖，以补充轮虫的消耗，使藻类饵料的增殖量和轮虫的消耗量基本保持平衡，培养才能正常进行。
(七)采收 轮虫的采收方法，可用200目筛绢做成拖网，沿池边拖曳采收。也可在池面上设一浮筏，其上安装1个用200目筛绢制成的网箱，用一小型水泵，把池水抽入网箱过滤。
也可利用褶皱臂尾轮虫趋光的特点，利用光诱，使轮虫大量聚集在光强处，轮虫集中的地方呈褐红色，可用水桶直接舀取。
第三节 休眠卵的采收和保藏
褶皱臂尾轮虫两性生殖产生的休眠卵，便于运输和贮存。人们习惯以休眼卵的形式贮藏、保存种轮虫，当需要时，取出孵化，即可获得轮虫种。
对诱发轮虫两性生殖的因子，已在本章第一节介绍。目前，在生产中诱发两性生殖形成休眠卵的方法，是以高的种群密度和饥饿刺激相结合进行。即先以常规方法培养轮虫，不采收，待轮虫数量达高峰时，突然停止投喂饵料并停止充气，池中饵料很快耗尽，即会出现两性生殖，生产大量休眠卵。其次，还可以改变盐度或温度，促进轮虫产生休眠卵。今村等(1979)把低温条件下培养的轮虫放到加温至29～30℃的培养液中，每2天反复操作1次，通过温度刺激，可以人为地促使轮虫产生大量休眠卵[2]。
轮虫产生休眠卵后，可每隔两天取池底沉积物进行镜检，待休眠卵数量较大，而且不继续增多时，即可采收。首先，把上层池水用虹吸法吸出排去，至剩下10cm左右的水探，然后把池底沉积搅起，连同池水排出，经300目以上的密筛绢过滤，再用清洁海水反复冲洗，尽可能把藻渣除去。把休眠卵和部分藻渣的混和物，稍加阴干，装瓶蜡封。也可不阴干，连水稍加浓缩装瓶，加盖。
装瓶封装的轮虫休眠卵，放在低于5℃的冰箱内保藏，可保存1～2年之久。日本日野研究室有历时8年以上仍保持孵化能力的休眠卵[2]，可见休眠卵能耐受恶劣环境的时间是相当长的。
休眠卵也可以不吸出，保留在原培养容器或原池中保存。原池水不能排去，也不能更换新水。若需要再培养时，把原池水排掉大部分(注意保留底部休眠卵)，换人新鲜海水，并加入少量藻液，池中的休眠卵即孵化，而获得大量种轮虫。但原池保存休眠卵，由于病、敌害生物的危害，存活率不高。
第四章 卤虫的培养
卤虫是生活于高盐度水体中的小型甲壳动物，地理分布很广。卤虫卵孵出的初期无节幼体，在一二天内，具有多量的卵黄，含有丰富的蛋白质、脂肪和矿物质(干重量含蛋白质约60％，脂肪约20％)，是鱼、虾、蟹幼体的良好饵料。特别是卤虫的休眠卵能作长时间保存，需要时可随时孵化，在24h内获得幼体，既简单又方便，也容易保证供应。目前，世界各国的水产种苗场在进行鱼、虾、蟹的育苗生产中已普遍使用卤虫无节幼体为活饵料。卤虫的成体营养也很丰富，是鱼、虾成体的好饵料。
卤虫的研究，自1775年开始，至今已有。200多年的历史。但作为水产动物饵料应用，是从20世纪30年代才开始的，1933年美国的Seale把卤虫初孵的无节幼体作为鲽类(Pleusonectes platessa L)仔鱼的活饵料，随后挪威的Rollefsen等(1939)也用卤虫无节幼体为活饵料培育鱼苗，均获成功，证实卤虫无节幼体是仔、稚鱼的优质饵料，因此受到国内外水产养殖工作者的高度重视。各国学者对卤虫进行了分类、遗传、生理、生化、营养、培养和应用等不同学科的研究和探讨。在比利时根特大学建立了国际卤虫研究中心，先后在美国(1979)、比利时(1985)召开国际专题学术讨论会，发表的论文很多，特别是1979年在美国召开的卤虫研究国际性学术讨论会，会上发表论文114篇，内容涉及的领域很广，其中约有30篇谈到了水产养殖和培养应用。在短短50年的时间内，卤虫的研究在世界上获得了迅速的发展，在基础理论和培养应用两方面都打下了一个牢固的基础。
我国在50年代后期，中国科学院海洋研究所张孝威教授首次发现我国的卤虫卵，经10余种海产鱼苗培育试验，证明卤虫无节幼体是仔、稚鱼的良好活饵料。同时相应的开展了卤虫卵的调查、采集、孵化和培养的研究，积累了一些资料。在70年代，陈清潮等(1975)开展了我国卤虫的资源调查及提高孵化率方法的研究，不仅对我国卤虫卵资源作了调查，并提出低温冰冻处理卤虫休眠卵，可提高孵化率约20％。又，徐恭昭等(1979)发表《卤虫的生态习性及其在养殖业上的应用前景》。从80年代开始，研究成果显著增加。黄鸣夏等(1980)发表《卤虫形态习性的初步观察》。李茂堂(1980)发表《卤虫在养殖中的应用》。赵乃刚(1980)发表《影响卤虫卵孵化率的一些因子及其流水孵化工艺》。李茂堂、郑严等(1982)发表《去壳卤虫卵在水产养殖中的应用》，引进国外卤虫休眠卵的去壳方法，并根据我国卤虫卵的特点，提出一套卤虫卵去壳的简单工艺，并在中国对虾育苗中使用。李诺(1983)发表《卤虫作为饵料生物的评价》。纪成林等(1987)发表《去壳卤虫卵的孵化率及其饲育对虾幼体的试验》。杨娜等(1989)发表《中国卤虫卵孵化特性的研究》。张闰生等(1989)发表《不同产地的卤虫及卵的氨其酸含量的比较》。还有蒋德春(1987)、蔡力生等(1987)、张闰生(1990)、耿烨(1990)、廖承义(1990)、徐利生等(1991)、王壬学等(1991)、马志珍(1992)、蔡亚能等(1992)……等共约2 0余篇。此外，在《海洋饵料生物培养》(湛江水产专科学校，1980)、《海水养殖手册》(山东海洋学院，1985)、 虾类养殖手册》(张立言等，1989)和《饵料浮游动物培养》(刘卓等，1990)……等教材或专著对卤虫的基础知识和培养应用均有比较系统的介绍。以上工作为进一步开展我国卤虫饵料的研究，打下了一个良好的基础。
我国是一个卤虫资源丰富的国家，沿海盐田面积达34.5万hm2，内陆盐湖面积大于lkm2的大、中型盐湖就有500多个。在这些广阔的水域中，蕴藏着十分丰富的卤虫资源。在我国
15个省、市、自治区内就发现卤虫分布地54处。最北分布地为新疆的艾比湖(N44.8，E82.5)，最南是海南的茑歌海(N18.5，E108.6)。海拔最高的是西藏的尼错湖(4902m)。目前，已进行卤虫卵开发生产的有辽宁的营口；河北的黄骅；天津的塘沽、汉沽；山东的寿光、无棣；山西的运城……等，尚有许多地方的卤虫资源尚未开发利用(马志珍等，未发表材料)。
60年代开始，世界上许多国家相继对卤虫进行了增、养殖试验和生产，并获得迅速发展。首先在巴西、泰国、菲律宾、印度……等国开展了卤虫大面积增、养殖试验。在比利时、美国进行了室内高密度精养试验。此外，越南、马来西亚、哥斯达黎加、秘鲁、西班牙、葡萄牙、墨西哥、加拿大……等国也进行了生产试验。尤其是近十几年发展很快，卤虫的增、养殖生产已取得了相当引人注目的经济效益和社会效益。我国从80年代中期开始进行卤虫的增、养殖试验，也取得了一定的进展，但到目前发表有关增、养殖方面的报告还很少。 我国卤虫的开发和利用具有良好的发展前景，在此，提出几个今后应进一步深入研究的问题，供参考。
1．对我国的卤虫资源进行全面调查，拟订出开发计划，实行繁殖保护资源政策。
2．对我国的卤虫进行形态分类、生态习性、繁殖、营养、生理、生化……等基础研究。 3．完善卤虫休眠卵的筛选、加工技术，保证产品质量，拓展国际市场。 4．加强卤虫增、养殖技术的研究，开展卤虫增、养殖生产。
5．筛选或引进生态性状优良，营养丰富，易于培养的卤虫品系进行人工增、养殖。并用来改良、代替原有的劣质品系。
第一节 卤虫的生物学
一、形态分类
(一)分类 卤虫，过去称盐水丰年虫，俗称盐虫子。分类上属于节肢动物门(Arthropoda)，有鳃亚门(Branchiata)，甲壳纲(Crustacea)，鳃足亚纲(Branchiapoda)，无甲目(Anostraca)，盐水丰年虫科(Branchinectidae)，卤虫属(Artemia)。
卤虫有许多地方种，其形态因环境不同而有相当大的变化。染色体在2n～8n(n=21)范围，而且不一定均为n的整倍数多少有些变异。在分类上至今仍较混乱，过去统称为Artemia salina，由于Kuenen(1939)，Gilchrist(1960)，Halfor Ceruini(1968)等发现，不同地方卤虫及生活在同一盐场的卤虫均存在生殖隔离现象。进入80年代以来，人们开始根据生殖隔离现象来进行卤虫分类0两性生殖的卤虫，根据生殖隔离现象已被分辨为6个种，即：Artemia franciscana (Kellegg，1906)；A．tunisiana(Bowen and Ster-ling，1979)；A．persimilis(Prosdocimi and Piccinelli，1968)；A．monica(Verrill，1869)；A．urmiana(Gunther，1900)；A．odessensis(Barigozzi，1980)。其中前3种已得到普遍公认，其余3种尚有疑问。孤雌生殖的卤虫，不能用生殖隔离法鉴定种类，因其遗传差异大，分类困难。故孤雌生殖的卤虫一般统一定名为Artemia parthen、ogenetica(nowen and Stedihg，1978)，习惯上在学名后加上地名，以示不同产地的不同品系。如中国天津产的卤虫，国际上习惯称之为Artemia parthenogenetica of Tianjin。根据Sorgeloos等的搜集调查，全世界目前发现的卤虫品系已超过50个。
(二)形态特征 卤虫体色与栖息水环境的含盐量有密切关系，在高盐水体中呈红色，随着盐度的下降，体色逐渐变淡，成灰白色。
卤虫成体，身体细长，分节明显，无头胸甲，分头、胸、腹(包括尾叉)三部分。我国北方沿海产的卤虫，雌虫体长1.0～1.3cm，最大的可达1.5cm。雄虫较小，一般体长0.7cm左右(图4-1)。
头部短小，不分节。在背面中央前缘有一单眼，两侧有1对具柄的复眼。口在头部的腹面，口前方有1片上唇，自额部向后方延伸，覆盖口外。额部背面，单眼后方具一不显著的小突起——额器(frontal organ)，有感觉功能。头部有5对附肢：第一触角、第二触角、大颚、第一小颚、第二小颚(图4-2)。第一触角1对，位于头的前端，细棒状，不分节，末端有感觉毛3根。第二触角1对，雄雌个体形状不同，雌性比较简单，粗短而稍带弯曲，雄性的第二触角极为发达，末节大而扁平，已特化成抱器(clasper)，交配时用以拥抱雌虫。大颚、第一小颚和第二小颚3对附肢组成口器．(mouth part)，用以咀嚼食物或辅助咀嚼。
胸部由11个体节构成，每节具有1对扁平叶状的胸肢，其内缘为内叶，由一些小叶组成，各叶边缘有羽状刚毛和小刺。外缘末端的1片为扇叶，边缘呈羽毛状。基部的1片为外叶，边缘无毛。在扇叶与外叶之间的1片为鳃，是呼吸器管。胸肢具有呼吸和运动双重机能，故名鳃足，亦称游泳足。
腹部由8个体节构成，无附肢。第一、第二两节愈合为生殖节，雌虫生殖节腹面具一卵囊，略呈袋形，贮存已经成熟的卵子，末端有开口。雄虫生殖节腹面有一交接器(petasma)，形似绵羊乳房。腹部的最后一节为尾节(或称肛门节)，它的末端有1对扁平不分节的尾叉，肛门位于尾叉之间。尾叉的大小租刚毛的数目随栖息环境的盐度而变化，盐度增大尾叉缩小。 沿卤虫身体中轴从头至尾纵贯着1条管状的消化道。头部可以看到脑以及通往复眼的 视神经。心脏位于第三、第四胸节间，通过半透明的体壁可以清晰地看到心脏的博动和血液的流动。
发育有变态，从休眼卵中初孵出的无节幼体，体长0.3～0.4mm，体宽(包括附肢基部)0.25～0.3mm，体长椭圆形，不分节，具3对附肢，呈很淡的肉红色。 二、繁殖习性
卤虫以单性生殖(又称孤雌生殖)和两性生殖两种生殖方式繁殖。无论哪一种生殖方式都有从雌虫育卵囊的生殖孔产出无节幼体的卵胎生和排卵的卵生两种方式。
行两性生殖的品系，雌、雄虫同时存在。而行单性生殖的品系，只有雌体存在。也有一些品系，平时只有雌体，行单性生殖，但有时也出现雄体，出现雄体时则行两性生殖，兼有两种生殖方式。
卤虫发育成熟后，雄虫用第二触角抓住雌虫育卵囊的前部，腹侧向上一道拥游。在拥游中腹部骤然弯曲，进行交尾，交尾时间很短，一般不超过lmin。在水温28℃左右时，交尾后50～80h即产卵(卵生)或产仔(卵胎生)。 1次产卵数为2～300个。一般为80～150个。在室内饲养的条件下怀卵量较少，一般为30～40个。每个雌体一般生殖5～10次左右，最多可生殖17次。
卤虫产的卵有2种。一为夏卵，卵膜薄，卵径为0.15～0.28mm。夏卵产出后在育卵囊迅速发育为无节幼体孵出。一为休眠卵(亦称冬卵)，具有厚的外壳；正圆形，灰褐色，卵径为0.20～0.32mm。休眠卵需经滞育期才能孵化，在干燥无氧的条件下，可存活数年之久，直到浸泡于海水中，壳内胚胎代谢被激发，才会发育孵化。
三、生长发育
卤虫孵出的无节幼体，需经12～15次蜕皮长成成体，成体雌虫在每次怀卵期蜕皮1次。对幼体发育的分期，意见不一致。但一般常分为无节幼体、后无节幼体、拟成虫期幼体和成虫四期(图4—3)。刚孵出的无节幼体，具第一、第二触角及大颚3对附肢，主要用第二触角游泳。初时消化道不完全，腹部有卵黄粒，直到第一龄末期消化道才发育完全，转为外源营养，开始摄饵，以触角上的刚毛摄取水中颗粒食物。无节幼体蜕皮后即为后期无节幼体，体稍延长，后部出现不明显分节，其后每蜕皮1次，体节和游泳肢数增加，发达。第4次蜕皮后即为拟成虫期幼体，已形成不具附肢的后体节，复眼具柄。从第10次蜕皮后，形态发生较大变化，触角失去运动能力，第二触角前端朝向后方。体长达2mm左右时，雌雄分化，雌雄性均．在生殖体节上看到外部生殖器的原基。再经发育，雄虫第二触角变成钩状抱握器，雌虫第二触角退化为具感觉机能的附肢。胸肢分化成机能不同的端肢节、内肢节和外肢节三部分。第12次蜕皮后，发育为成虫。廖承义等(1990)将卤虫的发育分为15龄(图4-4、4-5)，每蜕皮1次为1龄刚孵化的无节幼体为1龄，第1次蜕皮后则为2龄。
幼虫的发育和形态变化与蜕皮的次数是密切相关的，而与发育的时间长短无关。但是。Weisz(1946、1947)运用生物统计学及组织学的方法，研究了卤虫体节和附肢的发育过程，认为从孵化到性成熟的蜕皮次数不是一定的。大岛(1966)认为龄是根据蜕皮次数．而期则为根据形态变化而定。
蜕皮与生长受水温、饵料、盐度等环境因子的影响，不同品系对环境的适应情况不同。一般在28℃左右，孵化后1天之内开始摄饵，到第8天开始雌雄虫拥抱游泳(可能在当天交尾)，也有在第11天开始产卵或产仔的(二村，1967；寺本等，1961)。但一般最快要在孵化后2~3周才产卵。
卤虫的寿命一般为2~3个月左右，也有活9个月的记载（Bowen, 1962）。 四、生态条件
(一)地理分布 卤虫分布于南极、北极以外的世界各地，生活在盐度高的咸水湖和盐田中。我国沿海各省的盐田及内陆高盐水域均有分布。马志珍等(1992)报道我国15个省、市、自治区发现的卤虫分布地54处，除沿海省市外，内蒙古、新疆、青海、甘肃、西藏、山西、云南……均有分布。最北分布地为新疆的艾比湖，最南是海南的莺歌海，海拔最高的是西藏的尼错湖(4902m)。其中以河北、辽宁、山东、内蒙古的卤虫资源最丰富，目前已进行卤虫卵的开发生产。
我国沿海的卤虫绝大多数为单性生殖品系，也存在少量的两性生殖卤虫(蔡亚能，1986)。内陆盐湖除了单性生殖品系外，在山西、内蒙古、河北内地的盐湖中，近年来也发现有两性生殖品系分布。
(二)盐度 卤虫是典型的超盐水生物，也是广盐性生物据报道，卤虫可栖息于盐度范围在1.0％～24.2％的水域中，可容忍的盐度范围为0.1％～34.0％，最适盐度范围为3.0％～5.0％o但不同品系对盐度的适应情况亦有差异。我国产的天津卤虫(Artemia txzrthenogenetica of Tiaraiin)生长发育的适盐范围为1.022~1．068(波美度，大约相当于盐度0.5％～23.5％)。最适．盐度范围为1.032～1.172。卤虫无节幼虫在开食之前，能够在1．210的饱和卤水中生存，并且能承受1.015到1.210的盐度变化，随着个体生长发育，在消化道开口后，则仅
能适应从1.015到1.165的盐度变化，如果将其直接过渡到1.175的卤水中，则很快死亡。卤虫的无节幼体可在1．004的半咸水中生活，但其成活率很低，仅0.4％。在自然界，在1.004以下的水域中，卤虫的生物量极少，主要是由于敌害生物的捕食和竞争。在1.038～1.075的卤水中，绝大部分敌害生物不能生存，只有卤虫及作为其饵料的单细胞藻类……等，有利于卤虫大量繁殖'l能够达到很高的密度。在1.075以上的环境中，卤虫生长缓慢，怀卵量降低，生物量逐渐减少，当盐度接近饱和时，卤虫不能生存而灭绝(蒋德春，1987[22])。 盐度对卤虫的个体大小和体色有明显影响，在盐度为3.0％～5.0％的条件下，卤虫个体大、体色淡，随着盐度升高，个体逐渐变小、体色逐渐变浓。
(三)温度 卤虫对温度的适应范围很广，在-3～42℃的温度范围内均可存活，甚至冻在冰块中的卤虫，解冻之后仍能生存[2]。卤虫对剧烈的温度变化适应性也很强，将正常生活在25\"C条件下的抱卵雌体，当即转放到-2℃的冷藏间，停放2d后取出，培养皿表面已结一层薄冰覆盖着虫体，而卤虫仍在蠕动，其卵囊内的卵已孵化出幼体，在冰下正常游动。又，将正常生活在20℃条件下的初孵幼体，当即转入低温4℃的冰箱内，幼体仍能存活数日不死[33]。 (四)溶解氧含量．卤虫为低耗氧量动物，含氧量在lmg/L以上的水环境，卤虫可正常生活。据前苏联资料，当含氧量为0.17～0.29mg/L时，卤虫虽能生活，但处于致死的危险境界内；当含氧量为0.3～0.5mg/L时，卤虫显得萎缩不振[33]。B．M．Gilchrist(1954)认为休眠卵用育卵囊壁上的．卵壳腺包被卵壳，此卵壳含有大量正铁血红素(hematin)。这可能是雌体的血红蛋白 通过卵壳腺排泄出来的，当环境水体中溶氧量浓度低时，血红蛋白即在卤虫体内形成，当溶氧量浓度高时，则不能形成，且将体内存在的也迅速排泄掉，而且雌虫比雄虫排泄得快。Dutrieu(1960)用衣藻或用不含叶绿素、类胡萝卜素的啤酒酵母为饵料，为使血红蛋白含量变化，用了不同浓度溶氧量，饲育卤虫的结果是只有摄食含叶绿素饵料、血红蛋白多的群，能够形成休眠卵[2]。以上材料说明，只有摄食含叶绿素饵料和在低含氧量的条件下才能形成血红蛋白，才能产生休眠卵。但要下此结论，还需要做更多的实验证明。 (五)酸碱度 卤虫适应的酸碱度范围为pH7.5～8.5。 五、饵料和摄食方式
(一)饵料 卤虫是杂食性的，以细菌、酵母、单细胞藻类、小型原生动物和腐败的有机碎屑为食，是典型的对饵料颗粒不加选择的滤食性动物。饵料大小以50m以下较为合适。此外，卤虫有时也可以刮食方式摄食，或者通过撕裂方式摄食较大的饵料。
(二)摄食方式 卤虫成体滤食时，利用它的胸足定向鼓动水流，胸足内叶起过滤食物作用，将食物集中到腹部正中的食物沟(food groove)，再用胸足内叶基部的刚毛送往 前方，靠口唇、口部附属肢送人消化道。以刮食方式取食时，卤虫腹面朝下，用胸足内叶 的刚毛将小颗粒泥土和食物一道搅起送入口中。
卤虫无节幼体摄食是依靠第二触角搜集身体周围的微型藻类和有机颗粒，再借大颚的 作用，把食物收集到口唇部，继而进入到消化道内。
第二节 卤虫休眠卵的孵化
一、休眠卵的采收、处理和贮存
(一)采收 秋冬来临，水温下降；暴雨后水淡，盐度降低；以及其他水环境条件的剧烈
变化，均能促使卤虫产生休眠卵。．当水中有大量休眠卵出现时，应及时进行采收。虫卵沿着池边水的表层飘浮呈带状，可在下风头用带柄的小抄网捞取，风浪把虫卵打上池岸，堆积岸边，则可用小铲收集，采收的虫卵装入袋中。采收回来后，应在当天内进行处理，如果不是当天处理，则应把虫卵敷开成薄层，切忌将潮湿的虫卵堆积在一起，防止因温度升高伤害卵内胚胎。
(二)处理 采收回来的卤虫休眠卵，其中有部分是卵壳破裂，胚胎已死亡的坏卵，还混有羽毛、草杆、卤虫成体、泥、沙、有机碎屑等杂质。因此必须进行优选处理，清除坏卵和杂质。常用的优选方法是比重分离法。
首先用粗网目胶丝网布滤去草杆、羽毛、沙砾、昆虫等较大型的杂质，后把卵放入配有饱和盐水的桶形容器中，充气，洗去卵表污垢，停气，‘使比重大的杂质沉落在容器底部，卵则飘浮在表层，再用网目为150~200um的筛绢把卵捞出，放在海水中冲洗后转放入盛有淡水的桶形容器中，比重小的坏卵和一些微小杂质则浮于水面，质量好的卵则沉于水底，把沉底的好卵放出，滤去水分，风干。风干后的休眠卵可进一步加工贮存。 (三)贮存 经处理后的休眠卵须加工贮存，方法有如下几种：
1．风干后放低温或冷库贮存，经冰冻或低温贮存的休眠卵，可提高孵化率。 2．制成真空或充氮的密封罐，罐装贮存。
3．把休眠卵在饱和盐水中脱水，再用饱和盐水保存。 二、卤虫休眠卵的选择
(一)粗加工卤虫卵的选购 购买国内群众粗加工的卤虫卵时，首先必须了解采集地点、采集时间、处理方法和贮存条件，因为这些问题和休眠卵的质量有密切的关系，影响卵的孵化率。
对群众粗加工卤虫卵的选购，可按照下列步骤检查其质量。
1．首先通过肉眼观察、手摸和鼻嗅作初步选择。好的卵颜色应为棕褐而有光泽；手触无潮湿感，无霉腥臭味。
2．用2块玻璃片挤压卵，计数碎卵的油滴数，从中确定其好卵与坏卵的比例[33]。 3．用手持放大镜检查，粗略估计卵的圆、瘪、破损的比例(凹陷的卵，只要不破壳，一般都是好卵)。
4．取样进行孵化，计数其孵化率。
(二)产地和品质 目前，卤虫卵产品有许多牌号，来自中国、美国、加拿大、巴西、阿根廷、墨西哥、秘鲁、印度、伊朗、以色列、澳大利亚、法国、意大利、独联体……等20多个国家的不同的地理品系。不同产地、不同品系的卤虫卵品质不同。很多事实表明，不同产地的卤虫无节幼体，对于各种饲养动物并不都是合适的。Shelbourne(1968)用大盐湖卤虫无节幼体饲喂鳎类，在孵化后45d变态期，出现大量死亡，而用旧金山湾卤虫的成活率较高。Johns等(1978)用不同产地的5个品系的卤虫比较了对青蟹(Rhithropanopeus harrisii)幼体成长、成活的影响。发现用意大利、巴西及澳大利亚产的品系，生长和成活率均较好，而犹他州品系对于初期发育期成活率虽好，但在大眼幼体蜕皮期死亡率高达80％以上[2]。总的来看，法国的拉瓦尔、巴西的马考、意大利的马格里培、美国加利福尼亚州旧金山湾、澳大利亚的沙克湾和中国天津等地出产的卤虫卵品质较优。目前还缺乏对于各种经济鱼、虾类摄食不同
地理品系卤虫无节幼体的营养价值资料，如杂质含量、不饱和脂肪酸的种类和数量等。因此， 在实际应用时，应经过试用和比较[2]。
(三)质量鉴别标准 卤虫休眠卵的质量，除不同的地理品系存在着差别外，休眠卵的采收、处理、贮存方法和贮存时间的长短都对卵的质量产生影响。评价卤虫卵的质量，一般 采用在盐度3.5％、温度25℃的标准条件下，以海水进行孵化，比较以下几个方面的标准指 数。
1．孵化效率(HE) 每克卤虫卵孵出的无节幼体个数。
2．孵化率(H％) 从卤虫卵总数中孵出的无节幼体个数，以百分比表示。 3．孵化时间T0 孵出第一个无节幼体所需的孵化时间。 4．孵化时间T90 孵化出90％无节幼体所需的孵化时间。 5．个体重量 1个1龄无节幼体的干重和能量。
6．孵化产量 从1g卤虫卵产生的无节幼体总生物量和能量。
从水产养殖者的观点出发，应该选用孵化效率和孵化率都高的卤虫卵。考虑到营养价值，则应选择可产生较重的元节幼体和孵化产量较高的卤虫卵[32]。
三、休眠卵的孵化
(一)孵化容器 一般的容器都可以用来孵化卤虫休眠卵，但由于容器底部平坦，有死角，卵很容易堆集在一起，影响孵化效果。
近年来，多使用一种专为卤虫卵孵化的特制的卤虫孵化桶(图4-6)，该孵化桶为玻璃钢结构，略呈圆锥形，底部成漏斗状。底部中央开口，向桶外伸出一管，上有排水开关。桶身黑色不透明，漏斗状的底部则为白色，半透明，便于把无节幼体与坏卵、卵壳分离。孵化桶的容量一般为300L或500L。孵化时桶底中央装一气石，充气，使卵在桶内上下翻滚，始终保持悬浮状态，效果甚佳。
(二)孵化的环境条件
1．温度 卤虫休眠卵在7～30℃的温度范围内均能孵化，随着温度的升高，孵化速度加快。孵化的最适温度范围为25～30℃，温度低时，要用加热管加温，能控温在30℃，最为理想。P．Sorgeloos(1977)指出，不同地理品系的休眠卵，孵化时对温度的要求不同，在同一温度下，孵化所需的时间也不一样。
水温低于7℃或高于45℃，休眠卵的代谢完全停止。
2．盐度 不同地理品系的卤虫休眠卵，孵化时对盐度的要求不同。一般来说，可孵化的盐度范围为0.5％～14.0％(我国塘沽产的卤虫卵孵化适应盐度的上限为10.00[2])，最适盐度范围为2.8％～3.0％。盐度大于3.0％时，随着盐度的升高，孵化速度减慢，孵化率降低，而且幼体活力较差。最近有人证实，对某些地理品系的卵，盐度为0.5％时，不仅可以提高孵化率，而且无节幼体具有较好的活力，还可增加孵出无节幼体的能[32]。
在生产上，一般利用天然海水孵化卤虫休眠卵，如果能把盐度调节至2.8％~3.0％更好。在没有天然海水的地方可用粗制盐配成2％～3％的食盐水代替。也可用专供卤虫卵孵化的人工海水进行孵化，其配方如下[32]：
蒸发海盐(NaCl)： 5.0g MgSO4* 1.3g
MgCl2 1.0g CaCl2 0.3g KCl* 0.2g NaHCO3* 2.0g 自来水 1 000ml
3．酸碱度 卤虫休眠卵孵化时适宜的酸碱度为pH8～9。Sato指出，卤虫无节幼体前期，孵化是由一种酶引起的。这种酶的最大活性的pH是在8~9之间[33]。如果孵化时pH小于8，孵化率就会下降，可在每升水中加入碳酸氢钠1 g或氧化钙6 5 mg进行调节。
4．溶解氧 水中溶解氧含量的高低对卤虫休眠卵孵化影响甚大。Gilchrist(1954)报道，溶解氧含量最少也要3mg／L，休眠卵才能孵化。Nimura(1968)用美国加利福尼亚卤虫卵试验，认为溶解氧含量低于0.6~0.8mg／L，卵完全不能孵化，正在孵化中的卵也停止孵化。他指出，卤虫卵孵化的最低限溶解氧含量，要在lmg／L左右，能维持在2～8mg／L之间，卵可保持较稳定的孵化速度[33]。为了达到理想的孵化效果，溶解氧含量最好能维持在接近饱和状态。另一方面，防止卵沉在底部堆积成团，产生局部缺氧，也是十分重要的。因此，应使用底部成漏斗形的卤虫孵化桶孵化，在孵化过程中连续充气，使溶解氧含量接近饱和，并保持卵在水层中呈悬浮状态。
5．光照P．Sorgeloos(1973)，证明，在黑暗中大约只有一半多的卵能孵出幼体，其余的卵在光照条件下仍可孵出。光照不但影响卵的孵化率，而且还影响卵的孵化速度[2]。光的作用是触发休眠卵重新开始发育。当休眠卵在海水中泡湿之后，短时间的光照即能触发休眠卵的发育，提高孵化效率。徐利生等(1989)试验，若以一般室内自然光的强度进行边刺激边孵化是不够的，必须在孵化前先经一段时间自然光刺激，激发卵内胚胎发育。为了取得理想的孵化效果，在孵化过程中给以光照是必要的，至少在经海水浸泡后的头几个小时是如此。考虑到卤虫各个品系之间的差别，连续进行约1 0001x的光照可以获得最佳效果。 (三)孵化方法
1．优选 国内粗加工的卤虫卵，一般没有经过优选处理，混杂有泥沙、杂物，也有一部分卵壳破裂卵内胚胎已死亡的坏卵。因此，在孵化前首先宜采用比重法进行优选处理，除去泥沙、杂质和坏卵。优选处理的具体方法上文已介绍。 如果是罐装产品，则不需要再作优选处理。
2．消毒 卤虫卵壳表面上，通常附着有细菌、纤毛虫以及其他有害生物，这些有害生物在孵化海水中恢复生长、繁殖，并在投饵时随无节幼体进入育苗池，造成感染。因此，卤虫卵在孵化前应进行消毒，把沾附在卵壳上的生物杀死。
首先把卤虫卵放人120目筛绢袋内，用海水冲洗几次后，放在海水中浸泡15min让乾卵吸水散开，然后用化学药物消毒。常用的处理方法有如下两种：
(1)用浓度为200mg/L福尔马林溶液浸泡3 0 min，再用海水冲洗至无气味即可。
(2)用浓度为300m/L的高锰酸钾溶液浸泡5min，再用海水冲洗至漏出海水无颜色为止。 3．孵化密度 我国天津产卤虫卵，每克约18.5~20万粒。国外进口的各种品系，卵的大小和重量存在差异，因而每克卵的数量也不同，较小的卵每克可达25万粒。
在卤虫卵孵化中，孵化卵的密度应根据孵化容器及提供的孵化条件来确定。用平底容器
孵化，不充气，每升水可放卵0.1g左右，充气则可增加至0.2～0.5g，最高不宜超过1 g。用特制的卤虫孵化桶孵化，充气，每升水可放卵2~3g，效果甚佳，甚至放卵多至10g，孵化率仍相当高。
4．孵化 卤虫卵孵化可按下列步骤进行。
(1)把孵化容器、气管、散气石清洗消毒：后把经沉淀或再经砂过滤的海水灌入孵化容器至额定水位。如果种苗场是使用次氯酸钠消毒水进行育苗的，孵化卤虫卵也应该使用经次氯酸钠消毒的海水。
(2)把经过优选和消毒的卤虫卵，以合理的孵化密度，按孵化容器的水容量，投入适量的卤虫卵于孵化容器内孵化。
(3)连续充气：在孵化的前阶段，充气量应大些，以能把卵冲起在水层中成翻滚状态为准。当开始孵出无节幼体后，充气量宜小些，以免造成无节幼体损伤。
(4)如水温偏低，用加热棒加温，使温度达到或接近孵化的最适范围：利用自然光或人工光源照明，满足孵化中对光照的要求。以及尽可能使其他的环境条件适合孵化的需要。
(5)在上述的条件下孵化，一般经过24~30h，可孵出无节幼体。初孵出的1龄无节幼体，品质最优且含能量最高。如果及时采收就可得到优质并含有最高热量的饵料。在25℃下，孵化后24h内进行第二次蜕皮时，无节幼体的单个干重和热量值分别下降20％和27％[11]，这就是为什么在完成孵化过程后，要尽可能早地把无节幼体采收、投喂的道理。因此，如何掌握采收时间是十分重要的。在25～28℃的水温条件下，在36～48h内，卤虫卵初孵无节幼体达60％以上，尚未完全脱离卵壳呈吊挂灯笼状的垂囊期在20％以下，是达到孵化高峰的标志[33]，应准备采收。对于那些孵化同步性差的卤虫品系，可分2次收获无节幼体，在达到最高孵化率前先采收1次。 四、无节幼体与卵壳、坏卵的分离
休眠卵孵化后，无节幼体与卵壳、不孵化的坏卵混在一起，无论是投喂或培养，都必须把无节幼体分离出来。因为卵壳被鱼类等养殖对象吞食以后，会产生非常有害的影响，有时引起肠梗塞，甚至死亡。卵壳和坏卵还会污染水质，危害养殖对象。 一般把无节幼体和卵壳、坏卵分离的方法是利用光诱及重力作用。
最简单的方法是通过光诱使幼体集中，然后利用虹吸管将幼体吸出来。由于这种方法 不需要什么特殊的设备，在实验室小型培养试验中经常采用。其缺点是花费时间长，分离 效率低。
较好的方法是使用固定式的分离装置。 1972年G．Persoone和P．Sorgoloos设计了圆筒状分离器，分离效果可达90％～95％。1977年Kinne进行了改良，改良的金尼式分离装 置，一般每次分离10～20min，分离效果可达90％以上。但方法不简便。
近年，在鱼虾种苗场孵化卤虫多使用特制的卤虫孵化桶，该孵化桶也是理想的分离器，使用十分方便。当卤虫卵孵化完成后，首先把气石连管取出，停止充气，用黑布把桶口盖密。在静止状态下，坏卵沉于底部，卵壳浮于表层，无节幼体由于趋光而向底部半透明的漏斗状部位集中。停气15min后开始分离无节幼体，分离前先用一段橡皮管连接桶下的排水管，打开桶底的排水开关，最先流出者是未孵化的坏卵，让它漏掉后，用网孔为150btm的筛绢袋收集无节幼体，把袋口绑紧在排水的橡皮管上，袋子放在浅盆中收集，当水位下降到桶底
漏斗部上线时即停止，卵壳仍留在桶内没有流出。
分离完成后，还必须用清洁海水把无节幼体冲洗几次，以除去一些有害的有机物质，然后投喂或冰冻储存。 五、无节幼体的冷藏贮存
一龄无节幼体含能量最高，品质最优。经孵化获得的一龄无节幼体，除立即投喂外，应采用低温冷藏的方法贮存。在低温条件下，无节幼体的生长受到抑制，能保持其小体型和高营养价值。还可通过冷藏贮存有效地保证供应。也为自动投饵创造了条件。 冷藏贮存方法有下列几种：
(1)把无节幼体以每毫升1.5万个的密度置于充气容器中，然后贮存在0～4℃的冷库中保存。一般可保存48h，90％可以保持活力，能量损失很少(贮存24h无明显变化，48h后个体干重下降±8％[2]。
(2)把无节幼体放人经过预冷至14℃的海水(盐度3.0％～3.5％)中，然后将海水继续冷却到8～12℃(可放入装有冰块的塑料袋冷却或者放入调节好温度为8～12℃的电冰箱中)，在此温度下，无节幼体处于昏迷状态，生长受到抑制，营养物质得以保存。如果温度降至4～5℃，3d后的死亡率为40％。如果在4℃时开始冷藏，到第二天下降至O℃的情况下，死亡率达50％。一般每毫升冷藏液可保存1 500～2 000个无节幼体。
六、休眠卵的化学去壳
1977年，P．Sorgeloos等报道了卤虫休眠卵的化学去壳方法。1982年，李茂堂、郑严等发表《去壳卤虫卵在水产养殖中的应用》，参考国外卤虫休眠卵的去壳方法，并根据我国卤虫卵的特点，提出一套卤虫卵去壳的简单工艺，并在中国对虾育苗中使用。现介绍如下。 卤虫休眠卵外面一层咖啡色硬壳的主要成分是脂蛋白和正铁血红素，这些物质可以被一定浓度的次氯酸盐溶液氧化除去，即化学去壳。使卵仅留下一层透明的膜，这层膜可以被动物消化吸收。处理后的休眠卵称“去壳卵”，其活力不受影响，能正常孵化，并且幼体孵出后不需进行分离。有些品系的卤虫卵去壳后，可以提高其孵化率。去壳卵也可以不经孵化直接投喂，省去了孵化过程。．去壳卵的个体比无节幼体小，而其能量则比无节幼体高。去壳卵在水产养殖的应用是卤虫应用研究的一大进展。但由于去壳卵容易下沉和粘结，因此，作为饵料直接投喂时，不易被养殖对象摄取。利用充气、搅拌可以收到一定效果，但仍有一部分沉在底部。此问题还有待进一步研究解决[10]。
(一)去壳溶液的配制 卤虫休眠卵的去壳加工，首先要配制去壳溶液。去壳药物大多数用次氯酸钠，也可用液态次氯酸钙(CaCl20)和粉状次氯酸钙(漂白粉)。次氯酸盐的每克有效氯可氧化2～2.5g卵的壳，去壳溶液的总体积每克卵为13ml。卤虫卵的去壳过程是一种氧化反应，氧化效率取决于HClO离解成C1O-的程度，而HClO离解成C1O-的程度又与pH有关，pH稳定在10以上，HClO离解成C10-的比例最大，因而氧化效果也最好。因此，需要在去壳溶液中加入适量的氢氧化钠，以达到稳定pH的目的。在用次氯酸钠做去壳原料时，每克卵可加入40％氢氧化钠溶液0.3ml(或每克卵加入0.13g氢氧化钠)。在用次氯酸钙作去壳原料时，每克卵可加入碳酸钠1g(或每克卵加入0.3g氧化钙代替)。 计算方法举例：
用浓度为10％的次氯酸钠溶液作去壳原料，配制生产10g卵的去壳溶液，其计算程序是：
(1)10g卵所需去壳溶液的总体积(氢氧化钠溶液+海水)为：
13ml×10g=130ml 1g (2)按1g有效氯可氧化2g卵壳计算，10g卵所需有效氯的克数为：
10=5g 2(3)含5g有效氯所需10％次氯酸钠溶液的毫升数(x)，可由下列比例式算出：
100:10=x:5
x1005=50(ml) 10(4)所需海水量为： 130ml-50ml=80ml (5)所需氢氧化钠的量为
0.13g10g=1.3g 1g
这样，80ml海水加1.3g氢氧化钠，再加10％的次氯酸钠溶液50ml，就配成了l0g卵所需的去壳溶液。
鉴于次氯酸盐，特别是漂白粉，在存放过程中，有效氯易与空气中的二氧化碳化合而消失，同时也易吸水而分解，致使有效氯的含量逐渐降低。因此，次氯酸盐存放一段时间后，使用前需要重新测定其有效氯含量。常用测定有效氯的方法，有蓝黑墨水滴定法(参考第181页)和比重法。 (二)去壳过程
1．卵的水处理 称取一定量的卵，放入盛有海水或自来水的容器中(容器底部最好呈漏斗形)，充气搅拌，使卵保持悬浮状态1h后，把卵放在孔径为150～200m的筛网上冲洗并滤出。
2．卵的去壳 把捞出的卵，放人已配好的去壳溶液中，并搅拌。卵的颜色开始由咖啡色变为白色，最后变成橘红色。此过程约需6～15min完成(超过15min会影响卵的孵化率)。在去壳过程中为了防止溶液的温度上升至40℃，影响卵的孵化率，必要时可采用自来水或冰块冷却降温。
3．卵去壳后的清洗和去氯 去壳完成后，溶液有大量余氯存在，在卵的表面也吸附少量余氯，需要除去。其方法是将去壳的卵放在筛网上，用自来水或海水冲洗，直至无氯味为止。然后，把经过冲洗的卵，放人盛有海水或自来水的容器中(每克卵用水5～10m1)，加入1％～2％的硫代硫酸钠或1％～2％的亚硫酸钠去氯。也可用0.1mol/L的盐酸溶液去氯。并测定无余氯存在即成。
(三)去壳卵的贮存 去氯后的去壳卵，可以孵化后投喂，也可以直接投喂，也可贮存备用。贮存的方法：
(1)把去壳卵放在低于-4℃的冰箱内保存。
(2)把去壳卵放人饱和盐水中，充气2h，把卵捞出，再放人新配饱和盐水中，再充气2h，再把卵捞出，转放入盛有新配饱和盐水的容器中，置避光处在室温下贮存备用。
第三节 卤虫的培养
一、培养方式
60年代开始，许多国家相继对卤虫的培养进行了研究、开发。各国根据不同的自然条件和经济技术实力，开发了不同的方式方法，现选择比较成功的三种，介绍如下。 (一)室内高密度精养
例一 培养系统仿照Mock等人的对虾育苗方法设计而成。培养池为方形、圆形或长宽比不超过2:1的长方形池，利于用充气方式以气提泵带动水循环。池的容量较小，比利时使用的培养池容量为300L、2m3、5m3。用水经砂滤或网滤，除去较大型的敌害生物。采用一次性培养方式，在一个养殖期间，一般不换水，通过滤板或滤袋清除粪便等废弃物，或者每隔1天用虹吸管排污1次，保持水质平衡。所有饵料主要是颗粒小于50m的米糠，预先用饱和卤水浸泡，放在冰箱中贮存备用。投喂量以透明度来控制，一般透明度维持在15～25cm之间。当溶解氧降至2mg/L时，应加大充气量。当pH降至7.5以下时，加入碳酸氢钠调节。在接种密度为每升水体1万个无节幼体，水温为25～30℃的条件下，经2周培养之后，卤虫平均体长达8mm左右，每立方米水体可产鲜卤虫5kg左右，消耗米糠4kg[18
、2、32]
。
例二 培养系统利用大量换水，来除去卤虫的粪便、残饵等废物。使用呈30角的斜式矩形网为过滤装置，在滤网下方充气，清除网上的颗粒杂质以免堵塞，并使水中溶氧增加，使饵料分布均匀。在放养密度为每升水体2万个无节幼体时，开始时滤网使用网目为130m的网片过滤，每4h换水1次。随着卤虫的生长逐渐增加换水次数，第10天起1h换水1次，滤网使用网片的网目也逐渐增大，依次为225、300和400m使用的饵料除米糠外，还有乳清、酵母粉、大豆粉等。每15min投饵1次，最好甩自动投饵机，根据养殖水体的透明度，自动增添饵料，使透明度维持在25cm左右。在培养密度为每升水2万个无节幼体，水温为25℃的条件下，经2周培养，每立方米水体可收获鲜卤虫25kg，耗用米糠18kg，培养用海水150m3[18
、2、32】
。
室内高密度精养，目前尚在试验阶段。在自然界，卤虫密度很少超过200个/L，而 精养系统的卤虫密度高达1万~2万个/L。培养2周，每立方米水体可收获鲜卤虫5～25kg。从这两项指标来看，在培养技术上已取得相当大的成功。但还存在着耗能大，成本过高的问题。
室内高密度培养，一般不能培养到性成熟，虫体生长发育较一致，适宜于收获卤虫成体为饵料以及开发为人类的医疗保健食品。
(二)室外大量培养 卤虫室外大量培养，可用水泥池或土池，而更普遍的是把盐田的原有盐池加以适当改造，通过挖环沟，加高堤埂，使水深为40～50cm，作为培养池。 通过施用有机肥(鸡粪……等)或化肥，在池内繁殖天然饵料，也可投喂米糠、乳清……等农副产品下脚料作为补充饵料。
室外大量培养卤虫，最重要的是保持水的盐度在7.0％以上，最好达到9.0％～11.0％ 之间。因为在这样的高盐度水中，一般的水生动物不能生存，大大减少了敌害生物的侵袭，
保持卤虫正常的生长、繁殖，这是成功的关键。所以室外大量培养卤虫，多采用与制盐业(盐 场)结合的方式进行。现把泰国室外大量培养卤虫两种有代表性的方式介绍如下。
1．卤虫一盐一鱼、虾综合养殖， 卤虫池、盐池和鱼、虾池完全分开，但都位于同一 作业区域。每单元养殖系统如图4-7所示。使用风车提水1～5号池是蒸发池，6号是结晶池。根据卤虫池的盐度需要，交替使用3～5号池中的卤水。将卤虫池的池底平整，挖出环沟，修好堤埂，进行消毒除害，曝晒1周。然后把鱼、虾池中含有大量浮游植物，盐度为3.0％～5.0％的绿水和3～5号池中的卤水泵人卤虫培养池，调整盐度在9.0％～11.0％之间，保持水深为30～60cm。在整个养殖期间，偶尔添加蒸发池的卤水来调节盐度，泵取鱼、虾池中富含饵料的绿水投喂卤虫。卤虫池中的卤水有时也抽回蒸发池。根据实际情况决定是否增施有机肥(鸡粪)或化肥[18]。
2．卤虫一盐综合养殖 卤虫一盐综合养殖系统的设置如图4--8所示。卤虫池平整、消毒和曝晒后，泵入盐度为9.0％～11.0％的蒸发池水。在接种卤虫无节幼体前，先施粪肥1 250kg/hm2，待水色变绿后，再接种无节幼体。以后每周施肥1次。静止培养或每隔几天 用泵将水循环1次[18]。
卤虫室外大量培养已进入实用阶段，可收获休眠卵，也可收获成体。经济效益甚佳。 (三)盐田大面积引种增殖 引种增殖就是在没有天然卤虫生长的地区，有计划地将别处的卤虫接种到某些适宜卤虫生长的水体中，让其自然生长繁殖，形成优势种群。引种又可分 永久性和暂时性两种。引种一次就能使卤虫种群在某一水域中永久建立，为永久性引种。如巴西的东北部没有天然卤虫分布，1977年4月将250g美国旧金山湾卤虫卵引种到马考(Macau)盐场后，当年就有明显效果。此后由于人为扩散、风和鸟类的传播，逐步扩展到马考周围3 000多hm2的盐田[18]。
暂时性引种在泰国、菲律宾等国进行了成功的试验。因为这些国家炎热多雨，卤虫只能在旱季生长繁殖，在雨季卤虫就会被其他大型动物吞食或死亡而消失，卤虫接种后不能形成永久性的自然种群。一般在1hm2的盐池中，接种上50g优质卤虫卵孵化出来的无节幼体就 足够了。一个收获季节的产量为15～20kg卤虫干卵或1 000～1 500kg鲜卤虫[18]。 二、饵料与卤虫的营养价值
培养卤虫可以用各种单胞藻、酵母以及各种非活性生物颗粒饵料。饵料直接投喂或通过在培养池水中施肥培养生物饵料的方式提供。 Gibor(1957)、Provasoli等，(1959)通过培养试验，探讨了浮游植物的饵料价值，发现种类十分相近的浮游植物，其饵料价值是不同的。寺本等(1961)大量培养卤虫，用丙酮·丁醇(acetone·butanol)发酵蒸溜废液渣作饵料取得良好效果。汤弘吉(1977)用制成颗粒直径小于0.149mm的8种饵料饲育卤虫，其中以酵母粉悬浮液培养的卤虫生长最好，第14天性成熟，第19天产出子代，其他依次为浒苔、螺旋藻、鳗饲料、米糠、面粉，小球藻的饲养效果最差。而James R．Rosowski(1989)用小球藻培养卤虫，生长迅速。据日本报道，在充气条件下，用大豆粉和面粉以1:1的比例混合投喂，每10L水投0.2g，每天投喂两次，19d卤虫就可由幼体长成成体，成活率也很高。 Provasoli和Shiraishi(1959)用非生物饵料对卤虫的营养要求进行了探讨。 S．N．Dwidi，等(1980)以猪粪(300mg/L)、过磷酸钙(60mg/L)、花生饼(100mg/L)和酵母(30mg/L)培养卤虫，施肥后3天，按每升培养550个无节幼体的密度培养卤虫，取得良好效果。 Dobbeleir等(1980)利用
稻糠(稻壳碾碎为50tam以下的微粒)培养卤虫，以10g卤虫卵孵化出的无节幼体，放入1m3的长条状水池中，当水温在28℃时，2周后可以转变为约2kg鲜重的卤虫前期成虫，用稻糠饲养卤虫其蛋白质含量不变，但其脂肪酸类型则有重要差异。渡道武(1982)用乌贼肝油等含3HUFA的油脂投喂给卤虫幼体吃，这些卤虫无节幼体脂肪酸的比例升高，饲养仔、稚鱼的生长、存活率及活力都明显提高。
以上材料说明，培养卤虫的饵料，来源广泛，容易解决，甚至可利用廉价的稻糠来大量饲养卤虫。但是这里有一个关系到培养产品(休眠卵或成体)的营养(饵料价值)问题。 卤虫的无节幼体一直广泛应用于饲育鱼、虾等水产动物的幼体，有许许多多成功的事例。但也有一些事例否定卤虫的饵料价值，有时单独饲喂卤虫会造成稚鱼的大量死亡。究其原因，主要是缺少对鱼苗生长不可缺少的3HUFA……等营养物质。
一般鱼贝类具有含有陆上动物几乎不存在的3高度不饱和脂肪酸的脂肪。如C20:53(升碳五烯酸)及C22:63(升二碳六烯酸)等3 HUFA高度不饱和脂肪酸。淡水鱼类只要摄取含有C18：33(十八碳三烯酸)的饵料，就可以在体内形成3 HUFA。但如真鲷等海产鱼这类机能是很低的，因此必须直接摄取含有高度不饱和脂肪酸的饵料才能生存下去。这样，对于淡水鱼来说，十八碳三烯酸是必需脂肪酸，同样，对于海水鱼来说；3 HUFA就是必需脂肪酸，同维生素一样，必须经常从饵料中摄取。然而，对于卤虫卵及无节幼体的分析表明，其海产鱼类所必需的3 HUFA的含量一般偏低，而且因产地、年份、收获季节的不同，含量也有所不同。如果单独投喂3 HUFA含量低的卤虫无节幼体，饲养的鱼苗就会出现大量死亡。卤虫无节幼体3 HUFA的含量主要受其母体所摄食的饵料3 HLWA含量的影响。所以，培养卤虫必须考虑到养成产品(休眠卵或成体)的饵料价值，对投喂饵料的种类和组合应进行认真研究。
对于缺少3 HUFA的卤虫无节幼体，也可以通过下列方法改善其饵料价值。
(1)将刚刚孵化出来的卤虫无节幼体放到有海水小球藻或有油脂酵母的海水中，经过24h培养，3 HUFA增加了1倍，而且用这些卤虫无节幼体饲喂的真鲷仔鱼，在生长、成活率和生活力方面都有了明显的提高[2]。
(2)取乌贼肝油或玉米油1.5g，为使油脂乳化，加入0.3g蛋黄及海水20ml，搅拌3min后，加进30L水槽中，用油直接饲喂卤虫无节幼体，饵料价值得到明显改善。但还存在着死亡率略高的问题，原因尚待查明[2]。
(3)投喂封入3 HUFA的微型胶囊给卤虫无节幼体吃，并确认这些脂肪酸为卤虫所吸收(Sakamoto等，1982)。 三、病、敌害的防治
卤虫增、养殖过程中病害和敌害的防治，是值得重视的问题。目前关于卤虫病害的资料还很少，只在一些分散的文献中报告了卤虫可被病毒、体内共生性原核生物、螺旋体、真菌……等感染，但对症状、流行情况、危害性及防治方法还缺乏更多的研究。敌害有两种，一种是直接摄食卤虫和卤虫卵的掠食者，一种是饵料和空间的竞争者。几乎所有能摄食浮游动物的水生动物都能捕食卤虫，所以在低盐度(4.5％以下)的水体中，没有发现过天然的卤虫种群。在高盐度(7.0％以上)的水体中，因耐高盐的生物不多，所以卤虫的敌害较少，客观上为卤虫的繁殖生长创造了条件。但不少水生昆虫或其幼虫能耐受很高的盐度，它们都是卤虫
的掠食者。鱼类中的梭鱼、遮目鱼等的一些种类能耐受12.0％的盐度，它们大量捕食盐池中的卤虫。另外，一些不受盐度限制的水禽，如翠鸟、海鸥、火烈鸟等也都是捕食卤虫的能手。在高盐环境中，卤虫的竞争者不多，卤绳(Ephydra)的幼虫是卤虫群落生境中最常见的生物之一。另外，还有像盐蚕豆虫等广盐性原生动物，也是卤虫的主要竞争者[18]。
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