维普资讯 http://www.cqvip.com 医 １９３ 文章编号：１ＯＯＯ一２２３５（２００２）０２—０１９３—０３ 闽产木立芦荟多糖的分离纯化及初步分析 陈 丹，包国荣，黄 鑫，李 虹 摘要： 目的分离纯化及初步分析闽产木立芦荟中的多糖。 方法芦荟经沸水提取，醇沉，Ｓｅｖａｇｅ法去除 蛋白质，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００柱色谱分离纯化，制得闽产木立芦荟多糖，以硫酸一苯酚法测定其总糖含量。 结果析由Ｄ一甘露糖和Ｄ一葡萄糖等单糖组成。 结论中图分类号：Ｒ９７７．９ 从闽产木立芦荟中可提取分离纯度较高的杂多糖。 闽产 木立芦荟多糖经紫外吸收光谱扫描具有多糖特征吸收峰，未见核酸和蛋白质吸收峰，多糖含量可达８９．７ ，初步分 关键词： 芦荟；多糖类；分离和提纯；福建 文献标识码：Ａ 芦荟系百合科植物，始载于《开宝本草》，为较常 用的中药。芦荟的原植物主要有库拉索芦荟（Ａｌｏｅ ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ Ｍｉｌｌｅｒ）、好望角芦荟（Ａｌｏｅ ，．Ｄｚ Ｍｉｌｌｅｒ）、木立芦荟（Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）和斑纹芦荟 ２方法 ２．１ 木立芦荟粗多糖的提取分离 称取芦荟鲜叶 １ ｋｇ，捣碎，加沸水约１ Ｌ，反复提取两次，滤过，滤液 浓缩，加乙醇使含醇量达８Ｏ ，静置，收集沉淀物， 并依次用无水乙醇、丙酮抽洗，沉淀冷冻干燥，即得 浅灰紫色芦荟粗多糖无定形粉末。 （Ａｌｏｅ Ｖｅｒａ ｖａｔ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）等。研究表明芦荟中含有 蒽醌、黄酮、多糖等几十种化学成分。多糖是构成生 命的四大基本物质之一，具有增强机体免疫功能的 重要生物活性。福建地处亚热带，气候温和，适宜芦 ２．２芦荟多糖的分离纯化粗多糖适量，用少量热 荟生长，除斑纹芦荟外近年又大量引种了木立芦荟 （Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）。目前国内外有些关于芦荟多糖 的研究报道［】 ］，但是有关闽产木立芦荟中多糖的研 水溶解，Ｓｅｖａｇｅ法去除蛋白质［３ ］，用紫外吸收光谱 在２ＯＯ～５００ ｎｍ波长范围内扫描。取去蛋白质后的 多糖溶液，适当浓缩，透析法流水透析、静置透析，且 菲林试剂检测无还原糖。透析液经适当浓缩，醇沉， 静置，得浅灰色絮状沉淀，收集沉淀，抽滤，冷冻干 燥，得灰白色芦荟多糖半纯品。 究，尤其是从闽产木立芦荟中提取具有调节机体免 疫功能的多糖类成分的研究工作尚未见报道。本实 验通过对闽产木立芦荟多糖的提取分离纯化及初步 分析，为闽产木立芦荟多糖的开发利用提供一定的 将多糖半纯品通过Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００色谱柱，洗 脱，硫酸一苯酚法检测，收集主要洗脱峰，浓缩，醇沉， 冷冻干燥，得到精制的白色细小针状芦荟多糖。 ２．３芦荟多糖的纯度检查 ２．３．１ 标准曲线的制备精密称取１Ｏ５ ｌＣ干燥至 恒重的无水Ｄ一葡萄糖０．０４４７ ｇ，置１００ ｍｌ量瓶中， 加水至刻度，摇匀，制得葡萄糖标准贮备液。精密量 取标准贮备液０．０，１．０，２．０，３．０，４．０，５．０，６．０，７．０ ｍｌ，分别置５０ ｍｌ量瓶中，加水至刻度，摇匀。各精密 吸取２．０ ｍｌ，置１０ ｍｌ具塞试管中，加入苯酚试剂 １．０ ｍｌ，摇匀，快速加入浓硫酸５．０ ｍｌ，静置１０ ｍｉｎ，５０℃水浴加热２Ｏ ｍｉｎ，冷却至室温，以０号溶 液为空白，在４９０ ｎｍ波长处测定吸收度，以吸收度 实验依据。 １仪器和试剂 １．１ 仪器７５６一ＭＣ可见紫外分光光度计（上海第 三分析仪器厂）。 １．２材料和试剂 闽产木立芦荟（Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓ— ｃｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｆｕｊｉａｎ）。葡聚糖凝胶Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００（瑞 典Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司）。无水Ｄ一葡萄糖（中国药品生物 制品检定所）。Ｄ一甘露糖、Ｄ一木糖、Ｄ一果糖、Ｌ一鼠李糖 （上海生化试剂厂）。苯酚、硫酸、苯胺、邻苯二甲酸等 其他试剂均为ＡＲ级。 收稿日期：２００１—１２—１９ 修回日期；２０ｏ２一Ｏ２—２２ 基金项目：福建省教育厅科研基金资助项目（ＪＡＯＯ２１９） 作者单位：福建中医学院药学系制剂分析教研室，福州３５０００３ ＊ 中国药科大学生物制药学院２００１届毕业生 作者简介：陈丹（１９６１￣），女，副教授． 为纵坐标，葡萄糖浓度Ｃ（￣ｇ／ｍ１）为横坐标，绘制标 准曲线，得回归方程为Ａ一０．０５７４５Ｃ一０．００６０２８ （，．一０．９９８７）。标准曲线图见附图。 维普资讯 http://www.cqvip.com １９４ 《 ０ ０ Ｏ ０ ｌ ８ ６ ４ ２ ０ ５ ｌ０ ｌ５ ２０ 葡萄糖（ ｇ／ｍ１） 附图 芦荟多糖总糖含量测定标准曲线图 ２．３．２ 总糖含量测定 精密称取精制的多糖适量， 置小烧杯中，加水溶解，定量转移入１００ ｍｌ量瓶中， 加水至刻度，摇匀。精密量取１．０ ｍｌ，置５Ｏ ｍｌ量瓶 中，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取２．０ ｍｌ，置具 塞试管中，按“标准曲线的制备”项下同法操作，代入 回归方程计算。 ２．４芦荟多糖中单糖组成的初步分析 ２．４．１ 供试液的制备取多糖半纯品０．１ ｇ，加１ ｍｏｌ／Ｌ硫酸５ ｍｌ，１００ Ｃ封管水解，水解液用碳酸钡 中和，滤过，滤液浓缩后供纸色谱点样用。 ２．４．２对照品溶液的制备取Ｄ一甘露糖、Ｄ一木糖、 Ｄ一葡萄糖、Ｄ一果糖、Ｌ一鼠李糖等各２ ｍｇ，置２ ｍｌ量 瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，供点样用。 ２．４．３纸色谱分析将多糖酸水解供试液，各单糖 及各单糖的混合对照品溶液分别点样于新华１号中 速层析滤纸上，用正丁醇；３６ 醋酸；水（４：１；１） 为展开剂，展开，取出，晾干，以苯胺一邻苯二甲酸显 色，１Ｏ５（Ｃ烘烤１０ ｍｉｎ，多糖水解供试液在Ｄ一甘露 糖、Ｄ一葡萄糖斑点出现的相应位置有相同颜色的斑 点出现。 ３结果 ３．１ 芦荟多糖半纯品或精制品均不溶于乙醇、丙酮 和乙醚等有机溶剂，可溶于水尤其是热水中，与硫酸 一苯酚反应呈红色，茚三酮反应呈阴性。 ３．２紫外光谱分析检测显示，在２８０和２６０ ｎｍ波 长处蛋白核酸的吸收峰消失，仅在２２０ ｎｍ波长处 呈多糖的明显吸收峰。 ３．３芦荟多糖的纯度检查采用硫酸一苯酚法测定总 糖含量的方法，精制品中总糖含量测定结果见表１。 加样回收率测定结果见表２。 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏ１． ． 』 ， 表１ 芦荟多糖中总糖含量（％） ３．４ 初步分析实验结果表明，芦荟多糖主要是由 Ｄ一甘露糖和Ｄ一葡萄糖等组成的杂多糖。 ４讨论 ４．１ 闽产木立芦荟鲜叶捣碎后，因细胞组织内酶的 释放可导致多糖水解，使产率下降，所以芦荟鲜叶捣 碎后应迅速加入沸水中提取，使酶灭活。 ４．２ 芦荟粗多糖用Ｓｅｖａｇｅ法当以溶液总体积的 １／４加入氯仿，再以氯仿体积的１／４加入正丁醇时， 去除蛋白质的效果较其他比例更好，且利用蛋白核 酸在２８０和２６０ ｎｍ波长处具有特征吸收峰，而多糖 仅在２２０ ｎｍ波长处呈特征吸收峰的特点，用紫外 吸收光谱在２００ ５００ ｎｍ波长范围内扫描检测有 无残存的蛋白核酸，方法专属简便。用膜透析法可进 一步去除多糖中的无机物、还原糖等小分子杂质。 ４．３采用硫酸一苯酚法测定多糖含量，实验操作中 应注意，加入浓硫酸５．０ ｍｌ应直接加到溶液表面， 加酸后应充分摇匀，至颜色稳定（１０ ｍｉｎ）后进行测 定，实验证明结果在１ ｈ内稳定。 ４．４芦荟多糖半纯品经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００色谱柱可 进一步分离出不同分子量的多糖成分，结果表明芦 荟多糖主要含有６～７种分子量不同的多糖，且研究 发现不同产地不同季节采收的木立芦荟多糖的单糖 含量和组成有差异［６ ］。有关闽产木立芦荟多糖的组 成结构将做进一步的分析研究。 参考文献 ［１］ Ｑｉｕ Ｚ，Ｊｏｎｅ ｋ，Ｗｙｌｉｅ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｌｏｅ ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｅ Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ，２０００，６６（２）：１５２～１５６． ［２］Ｋｉｍ ＨＳ，Ｋａｃｅｗ Ｓ，Ｌｅｅ ＢＭ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐ０ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（Ａｌｏｅ ｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌｅｎｔｉｎｕｓ 维普资讯 http://www.cqvip.com 福建医科大学学报２００２年６月 第３６卷筮 研究ＥＪ］．中国药学杂志，２０００，３５（１】）：７３１～７３３． ｌ９５ （，。（， ５．Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ａｎｄ Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）Ｌ Ｊ ｊ． Ｃ“ｒｃ ｇＰ Ｐ“ ，】９９９，２Ｏ（８）：】６３７～】６４０． ［６］Ｙａｇｉ Ａ，ＭａｋｉｎｏＫ，Ｎｉｓｈｉｏｋａｌ，ｅｔ ａ１．Ａｌｏｅ ｒ／／ｆｉ￣１ｒｌｆｉ１１，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａ— ｒｉｄＰ，ｆｒｏｍ Ａｌｏｅ Ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｖｆｌｒ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ Ｌ Ｊｊ．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ， １ ９７７，３１（１）：１７～２Ｏ． Ｅ３］周慧萍，朱海燕，陈琼华．浒苔多搪的分离、纯化和分析ｇＪ］．生 物化学杂志，１ ９９５，１１（１）：９１～９４． ［４］陈春英，丁玉强，Ｅｌｍａｈａｄｉ ＥＡ，等．箬叶多搪的分离纯化及其 理化性质研究［Ｊ］．中国生物化学与分子生物学报，１ ９９８，１ ４ （４）：４２２～４２６． Ｅ７３ Ｇｏｗｄａ ＤＣ．Ｎｅｅｌｉｓｉｄｄａｉａｈ Ｂ。Ａｎｊａｎｅｙａｌｕ ＹＶ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄ— ｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａｌｏｅ ｖｅｒａ［Ｊ］．（Ｔａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ， 】９７９，７２（】）：２０１～２０５． ［５］孙玉军，陈彦，吴佳静，等．草乌多搪的分离纯化和组成性质 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｐｕｒ ｃａｔｉＯｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＯＩｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ ＡＩｏｅ ａ厂ｂｏ厂ｅｓＣｅ门ｓ ｆｒＯｍ Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ＣＨＥＮ Ｄａｎ，ＢＡＯ Ｇｕｏ—ｒｏｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｘｉｎ，ｅｔ ａｌ （Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｆｕｊｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００３，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ，ｐｕｒｉｆｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ Ａｌｏｅ＆， 一 ｂｏｒｅｓｃｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｆｕｊｉａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｂｏｉｌｉｎｇ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｐｉ— ｔａｔｅｄ ｂｙ ａｌｃｏｈｏ１．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ ｒｅｍｏｖｅｄ ｂｙ Ｓｅｖａｇｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉ— ｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ ｏｎ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００． Ｉｔｓ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｓｕｌ— ｐｈｕｒｉｃ ａｃｉｄ—ｐｈｅｎｏｌ ｍｅｔｈｏｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒａ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｔｙｐｉｃａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘ— ｃｌｕｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｗａｓ ８９．７ ．Ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ Ｄ—ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ Ｄ—ｍａｎｏｓｅ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｔ ｉｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔＯ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｆｕｊｉａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ： Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｆｕｊｉａｎ 动脉灌注化疗治疗晚期乳腺癌及其诱导细胞凋亡的分子机制研究 硕士研究生何荣琦 专 业外科学（普通外科） 导 师 陈大良教授，庄建良副教授 目的探讨术前经动脉灌注化疗治疗晚期乳腺癌的临 移正相关（Ｐ＜０．０５），对照组中Ｂｃｌ一２高表达的乳腺癌５年 生存率低于低表达组（Ｐ＜Ｏ．０５）。（３）Ｂａｘ在乳腺癌中的表达 及临床预后意义Ｂａｘ与淋巴结转移负相关（Ｐ＜Ｏ．０５），与组 床预后意义，同时研究其对乳腺癌细胞凋亡的影响及其可能 的分子生物学机制。 方法 女性原发局部晚期乳腺癌８２ 例，分为术前经动脉灌注化疗（ＣＡＰ方案）组４２例，对照组 （未行化疗直接手术）４０例；术后密切随访，观察两组术后５ 织分化无明显关系，不影响对照组乳腺癌的生存率。（４）动脉 灌注化疗与细胞洲亡的关系实验组与对照组Ａ１分别为 ０．０８２１士０．０３，０．０６２３士０．０８；实验组较对照组增加（Ｐ＜ 年无瘤生存率的差异。同时运用免疫组织化学ＳＰ方法检测 ８２例乳腺癌手术标本中的凋亡相关基因Ｂｃｌ一２，Ｂａｘ的表达 状况，原位杂交检测细胞凋亡指数的变化，观察它们与乳腺 癌浸润转移等生物学行为的关系及术前动脉灌注化疗的影 响。数据予ＳＰＳＳ １０．０统计学软件分析。 结果 （１）动脉灌 注化疗治疗晚期乳腺癌的临床预后意义术前动脉灌注化疗 组的５年生存率达６１．９ ，而对照组的５年生存率仅为 ３Ｏ ，经Ｋａｐｌａｎ—ｍｅｉｒ生存分析提示有统计学显著性差异（Ｐ ０．０５）。（５）动脉灌注化疗与凋亡相关基因的关系经统计学分 析，实验组中Ｂｃｌ一２表达下降（Ｐ＜Ｏ．０５），而Ｂａｘ的表达则上 调（Ｐ＜Ｏ．０５）。 结论 （１）术前动脉灌注化疗对晚期乳腺 癌是一个有效、简便的治疗方法，可显著改善预后；（２）凋亡 相关基因Ｂｃｌ一２影响乳腺癌的生物学行为，与肿瘤的不良预 后有关；（３）动脉灌注化疗治疗乳腺癌可能主要通过细胞凋 亡途径；（４）Ｂｄ一２／Ｂａｘ在诱导细胞凋亡中起重要作用，可成 为预测化疗效应的指标。 ＜Ｏ．０５）。（２）Ｂｃｌ一２表达及临床预后意义Ｂｃｌ一２在乳腺癌中的 表达率为６７．５％，Ｂａｘ在乳腺癌中的表达率为５７．５％；Ｂｃｌ一２ 与乳腺癌的组织分化程度成正相关（Ｐ＜０．０５），与淋巴结转 关键词ｂａｘ 乳腺肿瘤；化疗／动脉灌注；细胞凋亡；ｂｃｌ一２； （现单位：泉州市第一人民医院）