同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品、方法与应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112048566 A(43)申请公布日 2020.12.08

(21)申请号 202011054697.2(22)申请日 2020.09.29

(71)申请人 山东绿都生物科技有限公司

地址 256600 山东省济南市黄河二路169号(72)发明人 李书光　沈志强　程立坤　曲光刚　

王文秀　杨立芳　赵家磊　(74)专利代理机构 济南千慧专利事务所(普通

合伙企业) 37232

代理人 种道北(51)Int.Cl.

C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)G01N 33/569(2006.01)

(54)发明名称

同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品、方法与应用(57)摘要

本申请公开了同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品、方法与应用。所述产品和方法以鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的共有的特异性蛋白质抗原优选为外膜蛋白WP_041352022.1为检测对象，在该蛋白的基因组DNA水平上设计并筛选出了PCR引物对S1，该PCR引物对具有特异性强、灵敏度高、无引物二聚体产生的优点，本申请提供了使用一对PCR引物即可同时检测两种病原的产品和方法，杜绝了多重PCR引物和产物间的相互干扰，提高了检出率，具有经济、简便、效率高的优点。CN 112048566 A

权利要求书2页 说明书6页

序列表8页 附图2页

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1.一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品，其特征在于，所述产品中包括针对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的共有的特异性蛋白进行检测的试剂。

2.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述共有的特异性蛋白包括外膜蛋白、和/或细胞质膜蛋白，优选，外膜蛋白，

和/或，所述共有的特异性蛋白具有抗原性，优选的，所述抗原性的强度为抗原参数在0.5以上，

和/或，所述共有的特异性蛋白在鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体中的同源性在99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、70％、60％、50％、40％、35％、30％以上，优选，85％以上，更优选，90％以上，更优选，95％以上。

3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，所述共有的特异性蛋白包括外膜蛋白，所述外膜蛋白包括蛋白WP_041352022.1、WP_041352020.1、WP_041351882.1、WP_011283540.1、WP_020003021.1、WP_081420552.1、和WP_041352050.1，

优选，蛋白WP_041352022.1，更优选的，蛋白WP_041352022.1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，更优选的，蛋白WP_041352022.1的基因序列如SEQ ID No.1所示。

4.如权利要求1-3中任一所述的产品，其特征在于，所述试剂选自所述共有的特异性蛋白的蛋白或抗原水平检测试剂、抗体水平检测试剂、基因组DNA水平检测试剂、RNA水平检测试剂中的任一种或任两种以上组合；

优选的，所述试剂选自酶联免疫检测试剂、Western blot检测试剂、PCR检测试剂、RAPD检测试剂、AFLP检测试剂、LAMP检测试剂、SOE-PCR检测试剂中的任一种或任两种以上组合。

5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述PCR检测试剂包括PCR引物对，所述PCR引物对的检测靶序列位于所述共有的特异性蛋白的基因序列上，

优选的，所述PCR引物对的检测靶序列位于蛋白WP_041352022.1，更优选的，所述PCR引物对的检测靶序列位于SEQ ID No.1所示序列上，更优选的，所述PCR引物对的检测靶序列包括SEQ ID No.1的第3976-4459位所示序列，更优选的，所述PCR引物对包括引物对S1，所述引物对S1的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述引物对S1的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

6.一种用于同时特异性检测鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体的PCR引物对，其特征在于，所述PCR引物对的检测靶序列位于SEQ ID No.1所示序列上，

优选的，所述PCR引物对的检测靶序列包括SEQ ID No.1的第3976-4459位所示序列，更优选的，所述PCR引物对包括引物对S1，所述引物对S1的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述引物对S1的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

7.一种用于同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的PCR引物对、和含dNTP和/或Mg2+和/或DNA聚合酶的PCR反应预混液。

8.权利要求1-5中任一所述产品、权利要求6所述PCR引物对、或权利要求7所述PCR试剂盒在检测鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体中的应用。

9.一种检测鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取待测DNA样品；

2)使用权利要求5所述产品、权利要求6所述PCR引物对、或权利要求7所述PCR试剂盒对

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所述待测DNA样品进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)当所述扩增产物中含有目的扩增片段时，判断所述待测DNA样品中含有鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体；

优选的，所述PCR扩增的退火温度为50-60℃。

10.一种筛选两种以上支原体检测用特异性靶蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：从已知蛋白数据库中筛选所述两种以上支原体的共有的特异性蛋白；

优选的，所述共有的特异性蛋白包括外膜蛋白、和/或细胞质膜蛋白，优选，外膜蛋白，和/或，所述共有的特异性蛋白具有抗原性，优选的，所述抗原性的强度为抗原参数在0.5以上，

和/或，所述共有的特异性蛋白在所述两种以上支原体的同源性在99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、70％、60％、50％、40％、35％、30％以上，优选，85％以上，更优选，90％以上，更优选，95％以上。

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同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品、方法与应用

技术领域

[0001]本发明涉及动物病原检测领域，具体说是一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品、方法与应用。背景技术

[0002]鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体是鸡的两种重要的致病性病原。目前环境中的感染压力较大，采集7-14日龄雏鸡的喉气管拭子，使用PCR方法能够检测雏鸡是否处于鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体潜伏感染状态，以确定药物投放及疫苗免疫程序。现有技术中同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法一般为多重PCR，需要加入至少4条引物，引物的增多会造成引物二聚体，并干扰PCR的正常扩增，影响PCR检测的灵敏度和特异性。发明内容

[0003]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品、方法与应用。[0004]本申请发明人发现，免疫鸡毒支原体与免疫鸡滑液囊支原体获得的血清，在平板凝集实验中存在一定程度的交叉凝集，根据这一特性，初步判定这两种病原在外膜蛋白和/或细胞质膜蛋白上存在部分相似或者相同的抗原。现有技术中尚未发现利用上述两种支原体的交叉凝集对这两种支原体同时进行检测的方法和产品，基于此，本申请要求对如下技术方案进行保护：[0005]一方面，本发明提供的一种同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品，包括针对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的共有的特异性蛋白进行检测的试剂。[0006]在上述产品中，所述共有的特异性蛋白包括外膜蛋白、和/或细胞质膜蛋白，优选，外膜蛋白；

[0007]所述外膜蛋白为镶嵌在外膜双层脂质处的蛋白质；[0008]所述细胞质膜蛋白为位于细胞质膜处的蛋白质；[0009]和/或，所述共有的特异性蛋白具有抗原性，优选的，所述抗原性的强度为抗原参数在0.5以上，[0010]和/或，所述共有的特异性蛋白在鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体中的同源性在99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、70％、60％、50％、40％、35％、30％以上，优选，85％以上，更优选，90％以上，更优选，95％以上。[0011]在上述产品中，所述外膜蛋白包括蛋白WP_041352022.1、WP_041352020.1、WP_041351882.1、WP_011283540.1、WP_020003021.1、WP_081420552.1、和WP_041352050.1，其在鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体中的同源性分别为97.21％、94.72％、93.82％、63.2％、60％、40％、和35.89％；[0012]优选，蛋白WP_041352022.1，更优选的，蛋白WP_041352022.1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，更优选的，蛋白WP_041352022.1的基因序列如SEQ ID No.1所示。

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在上述产品中，所述检测包括直接检测或间接检测，

[0014]所述直接检测包括对所述共有的特异性蛋白进行检测的蛋白或抗原水平检测，[0015]所述间接检测包括对所述共有的特异性蛋白的抗体进行检测的抗体水平检测、对所述共有的特异性蛋白的基因组DNA进行检测的基因组DNA水平检测、对所述共有的特异性蛋白的RNA进行检测的RNA水平检测，

[0016]即所述试剂选自所述共有的特异性蛋白的蛋白或抗原水平检测试剂、抗体水平检测试剂、基因组DNA水平检测试剂、RNA水平检测试剂中的任一种或任两种以上组合；[0017]进一步地，所述试剂选自酶联免疫检测试剂、Western blot检测试剂、PCR检测试剂、RAPD检测试剂、AFLP检测试剂、LAMP检测试剂、SOE-PCR检测试剂中的任一种或任两种以上组合；

[0018]所述PCR检测试剂包括普通PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR中的任一种。[0019]在上述产品中，所述PCR检测试剂包括PCR引物对，所述PCR引物对的检测靶序列位于所述共有的特异性蛋白的基因序列上，[0020]优选的，所述PCR引物对的检测靶序列位于蛋白WP_041352022.1的基因序列上，更优选的，所述PCR引物对的检测靶序列位于SEQ ID No.1所示序列上，更优选的，所述PCR引物对的检测靶序列包括SEQ ID No.1的第3976-4459位所示序列，更优选的，所述PCR引物对包括引物对S1，所述引物对S1的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述引物对S1的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。[0021]另一方面，本发明还提供了一种用于同时特异性检测鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体的PCR引物对，所述PCR引物对的检测靶序列位于SEQ ID No.1所示序列上，[0022]优选的，所述PCR引物对的检测靶序列包括SEQ ID No.1的第3976-4459位所示序列，

[0023]更优选的，所述PCR引物对包括引物对S1，所述引物对S1的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述引物对S1的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。[0024]另一方面，本发明还提供了一种用于同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的PCR试剂盒，所述试剂盒包括权利要求7所述的PCR引物对、和含dNTP和/或Mg2+和/或DNA聚合酶的PCR反应预混液。[0025]另一方面，本发明保护以上任一所述产品、所述PCR引物对、或所述PCR试剂盒在检测鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体中的应用。[0026]另一方面，本发明还提供了一种检测鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体的方法，包括如下步骤：

[0027]1)取待测DNA样品；

[0028]2)使用权利要求6所述产品、权利要求7所述PCR引物对、或权利要求8所述PCR试剂盒对所述待测DNA样品进行PCR扩增，获得扩增产物；

[0029]3)当所述扩增产物中含有目的扩增片段(优选SEQ ID No.1中第3976-4459位所示DNA片段)时，判断所述待测DNA样品中含有鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体；[0030]优选的，所述PCR扩增的退火温度为50-60℃。[0031]另一方面，本发明还提供了一种筛选两种以上支原体检测用特异性靶蛋白的方法，该方法包括：从已知蛋白数据库中筛选所述两种以上支原体的共有的特异性蛋白；

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优选的，所述共有的特异性蛋白包括外膜蛋白、和/或细胞质膜蛋白，优选，外膜蛋

白，

和/或，所述共有的特异性蛋白具有抗原性，优选的，所述抗原性的强度为抗原参

数在0.5以上，[0034]和/或，所述共有的特异性蛋白在所述两种以上支原体的同源性在99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、70％、60％、50％、40％、35％、30％以上，优选，85％以上，更优选，90％以上，更优选，95％以上。[0035]本发明的有益效果：

[0036]本发明提供了一种新的同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体两种病原的产品和方法，该产品和方法以鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的共有的特异性蛋白质抗原优选为外膜蛋白WP_041352022.1为检测对象，在该蛋白的基因组DNA水平上设计并筛选出了PCR引物对S1，该PCR引物对具有特异性强、灵敏度高的优点，与分别针对各支原体进行PCR检测相比符合率达100％。本发明提供了使用一对PCR引物即可同时检测两种病原的产品和方法，杜绝了多重PCR引物和产物间的相互干扰，提高了检出率，具有经济、简便、效率高的优点。附图说明

[0037]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：[0038]图1为以鸡毒支原体DNA为模板在不同退火温度下的PCR扩增产物电泳结果。[0039]图2为以鸡滑液囊支原体DNA模板在不同退火温度下的PCR扩增产物电泳结果。[0040]图3为以鸡毒支原体+鸡滑液囊支原体DNA模板在不同退火温度下的PCR扩增产物电泳结果。

[0041]图4为PCR引物对特异性检测电泳结果，其中，泳道1-16的模板依次为：鸡毒支原体疫苗株F36、鸡滑液囊支原体疫苗株H株、鸡毒支原体疫苗株(F36)+鸡滑液囊支原体疫苗株(H株)、牛支原体、猪肺炎支原体疫苗株(RM48)、山羊丝状羊支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌、鸡传染性支气管病毒、鸡传感性喉气管炎病毒、新城疫病毒、鸡流感病毒、副鸡嗜血杆菌，阴性的模板为水。

[0042]图5为PCR引物对灵敏度检测电泳结果，泳道106、105、104、103、102、101、100代表质粒pucm-M的模板拷贝数，阴性的模板为水。具体实施方式

[0043]实施例1、鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体共有抗原的筛选及引物设计[0044]1、共有抗原的筛选

[0045]通过在线蛋白质数据库获得鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的全部膜蛋白数据，进一步筛选抗原性强(按网站http://www.violinet.org/vaxign/中抗原参数在0.5以上进行)的外膜蛋白，比较两种病原的共有蛋白，并分析蛋白的同源性，如获得了如下共有蛋白：WP_041352022.1、WP_041352020.1、WP_041351882.1、WP_011283540.1、WP_020003021.1、WP_081420552.1、和WP_041352050.1，其同源性分别为97.21％、94.72％、93.82％、63.2％、60％、40％、和35.89％；选择同源性在96％以上的WP_041352022.1(其氨基酸序列如SEQ ID 

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No.4所示)外膜蛋白作为研究对象，通过NCBI数据库获得其基因序列(如SEQ ID No.1所示)，BLAST分析显示，同源性在98％以上，可以作为PCR引物设计的目标基因。[0046]2、引物的设计[0047]使用PRIMER 5.0引物设计软件，设计PCR引物对S1如下：[0048]上游引物F：5'-AACGCTACTTCTACACCAA-3'(如SEQ ID No.2所示)，[0049]下游引物R：5'-CTACTACTCCCGTACCACT-3'(如SEQ ID No.3所示)，[0050]上述PCR引物对的扩增产物大小为484bp，其序列如SEQ ID No.1中第3976-4459位所示。

[0051]实施例2、PCR反应条件的优化[0052]方法：分别以鸡毒支原体DNA模板、鸡滑液囊支原体DNA模板、鸡毒支原体DNA模板+鸡滑液囊支原体DNA模板对最适退火温度的进行优化，其中，[0053]PCR反应体系如下：[0054]GENESTAR的2×PCR mix(含DNA聚合酶和dNTP)10μL，模板0.1μL(浓度30ng/μL)，上游引物F1μL(浓度0.15μg/μL)，下游引物R1μL(浓度0.15μg/μL)，水补足至20μL。[0055]PCR反应条件如下：[0056]预变性95℃5min，变性95℃40s，退火50℃-60℃40s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min；

[0057]将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。[0058]结果：如图1、图2和图3所示，三种模板在50℃-60℃的退火温度下，均可以PCR扩增得到足量的484bp扩增产物，经测序，其序列与SEQ ID No.1中第3976-4459位所示序列相同。

[0059]实施例3、特异性检测[0060]方法：分别以鸡毒支原体疫苗株F36、st-11株和6/85株、鸡滑液囊支原体疫苗株H株和滑液囊支原体ATCC25204、鸡毒支原体疫苗株(F36)+鸡滑液囊支原体疫苗株(H株)、牛支原体、猪肺炎支原体疫苗株(RM48)、山羊丝状羊支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌、鸡传染性支气管病毒、鸡传感性喉气管炎病毒、新城疫病毒、鸡流感病毒、副鸡嗜血杆菌为模板，按照实施例2中的反应条件和反应体系，进行PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。[0061]结果：鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、和鸡毒支原体+鸡滑液囊支原体均能够扩增出484bp的目的片段，其它支原体、细菌或者禽源病毒以及阴性对照结果均为阴性，无任何扩增产物，这说明引物对S1对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的检测特异性很好，其中部分结果如图4所示。[0062]对比例1、[0063]方法：按照实施例3的方法进行，不同之处在于：使用鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的另一个共有外膜蛋白WP_041352020.1的基因序列设计的特异性PCR引物对C1(上游引物序列：5'-TCGGAACTAAAGAATACGG-3'，下游引物序列：5'-ATGACTCTAAGGCTTGACG-3')，进行PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。[0064]结果：该引物对C1对鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、和鸡毒支原体+鸡滑液囊支原体均能够扩增出453bp的目的片段，牛支原体、巴氏杆菌中分别可以扩增出约600bp和

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1000bp的目的片段，其它支原体、细菌或者禽源病毒以及阴性对照结果均为阴性，无任何扩增产物，这说明引物对C1对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的检测特异性不好。[0065]对比例2、[0066]方法：按照实施例3的方法进行，不同之处在于：以SEQ ID No.1设计的另一对PCR引物对C2(上游引物序列：5'-AACGCTACTTCTACACCAA-3'，下游引物序列：5'-GTAATCGCTTATGCCTAAAT-3')，进行PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。[0067]结果：该引物对C2对鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、和鸡毒支原体+鸡滑液囊支原体均能够扩增出237bp的目的片段，但是在100bp左右存在非特异性引物二聚体条带，其它支原体、细菌或者禽源病毒以及阴性对照结果均为阴性，无237bp扩增产物，这说明引物对C2对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的检测特异性较好，但由于引物对会形成二聚体而存在干扰。

[0068]实施例4、PCR的灵敏度检测[0069]方法：将实施例2中PCR扩增出484bp的产物片段连接到T载体，得到质粒pucm-M，计算质粒拷贝数，并进行10倍浓度梯度稀释后，按照实施例2中的反应条件和反应体系，进行PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。[0070]结果：如图5所示，引物对S1的灵敏度为103拷贝(即模板在反应体系中的浓度为50拷贝/μL)，该灵敏度足以检测感染了鸡毒支原体和/或鸡滑液囊支原体的动物。[0071]对比例3、

[0072]按照实施例4的方法进行，不同之处在于：使用实施例5中的方法1和方法2进行PCR扩增，结果，方法1和方法2的灵敏度与实施例4的灵敏度相同。[0073]实施例5、PCR的临床应用

[0074]采集病死鸡的气囊和8日龄鸡喉气管轼子，获取其DNA样品做为模板，按照实施例2中的反应条件和反应体系进行PCR扩增，同时使用如下现有的检测方法为对照，结果如表1所示，40个临床样本(盲样)中，实施例2检测方法与现有的分别检测方法的结果相比，符合率为100％，可以用于同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体。[0075]现有的鸡毒支原体PCR检测方法1：[0076]上游引物Pvpa-1：5’-TACTTACAGATTACAGGAGCAG-3’，[0077]下游引物Pvpa-2：5’-TTCCGTTGGTTGTTGACT-3’，[0078]PCR扩增目的片段大小358bp，退火温度为：50.3℃。[0079]现有的鸡滑液囊支原体PCR检测方法2：[0080]上游引物MSF：5’-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3’，[0081]下游引物MSR：5’-GTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3’，[0082]PCR扩增目的片段大小207bp，退火温度为：52.6℃。[0083]表1不同方法检测结果对比

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[0084]

表1中空白表示无扩增结果，即阴性；√表示有相应的扩增产物，即阳性。

[0086]本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

[0085]

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序列表<110> 山东绿都生物科技有限公司<120> 同时检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的产品、方法与应用<130> JN-CNP201731<160> 4<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 4728<212> DNA<213> 鸡滑液囊支原体<400> 1atgaaaagaa aatttaaatt attattagct cttaatgcct caagcatttt tgttttaact 60cctttgctta ctgcttgtgt taatcgtgag gctataaatg aagaattaaa acgtttaaat 120gctaataatt ttgactttaa ttatcctaat aaaaatcaaa cttatgcatt agatgttaaa 180gcagaacagt ttacaactaa ttctaatgat caaatagaat tagttgaacc aaaaataatt 240gagcaagtta atcaggaagc taaagcaact ttacaatatc gtttaaaaag tttaaaaact 300aatttaaatg ctgaaataat tagtgatatt ttaactaaag aaatatctgg atttaaacaa 360ggtttatctt tagaggaatt aataactaat gaaaaagaaa aattaaataa aactaatttt 420acttttgatt atccttataa agaaaacact tttaccgaag aagctaaatt agaaaaaatt 480caaattaaaa caaataataa ttatcaaaat gaagagttaa aaaattttac tcatgattta 540aaaacaaata gtataagttt tgaatatcaa atttttatag aaaattttta tggacaaaaa 600atatcttcaa atgttaaaaa agttactatt tcaggattta aaaataaaca aacttttgaa 660aatcaaaata gtgtagatac ttttttagca tcttataaaa ttgctgaaaa tccttcaatt 720aatcaagatt taaatattaa actttattca actagtattt cagaacaaaa tgctccttat 780tttttaaatt tagtaaatga taaagaaata aatttaaaaa ttaaaaatat caaaatagat 840gataataatt taaatcaaat tagttttact ttagtggctc aaaaaggtga ttatactaaa 900gaagaacaaa gaacatttac ttttaaaaat gatgtagctt ctttaactaa tggtttgagt 960tttaactcaa ttgaagaatt atatgatgta gattatgctt ttttaaattc tctagcagga 1020aatgatttaa gaaataaaac taatttgtta aatagtgctt ttagtaaaaa agtagaaaaa 1080ttaaataatt tatttgatta tgaaattaat tgacaaaaat caaaaaatga tataacacaa 1140gtagaaaaaa aagttagaga tgttaatcgt caagtaaaaa atgctaaagc ttttgtttta 1200aaatgaaatt tagttgttga tgttaaatta aatggtaaaa ctattaaaag ttttaataat 1260ttaaaaacag ctgataatcg taatcaacac gattattttg gtggtaatta tttatatact 1320tatttactta atgatgattt taatgtcaca tataaaccta gtcaatatta tttaaccaat 1380gctaaattta ataataataa aacggatgaa gttttattaa cttatattaa taatactgct 1440gaagaaatta aaaaaactaa cgaaaaatat aaaaatatta ctacaacagg cagatatcct 1500actttaaatc aaaatgatgc attaagcaga gaattattca aagaaattgt tctaaaaagc 1560tttgatttta atcttaatgg ttgacaaatt gaagaagttg taagttattt aaataatgat 1620

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序　列　表

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actgataaat ttaattattt ttattttcaa ccaaataatt tagttaaatt attattaaaa 1680ttaactaaga ataatcaagt tgtttattta cctctaattt ttaacaattt taattatgat 1740attaatcaat tagaagatgc tttttttgtt aatttagtta ctggaaataa tatttctaaa 1800atactttcac aagtaaaaat taaaaaaaat aatgatacac atcaaaatta tttagcttct 1860aaaatttatg ataatttaaa tgatttttat gaattgcctg ctaatggacg ctatcaaatt 1920aaatttttaa ctaaagatca aactagactt ggtttaccaa ataaaccaat tcaacacttt 1980aacgatatca aaggtgaagc aattgttcaa tttggcttat ttgaaaatgg taaatatact 2040ggcattagca ctttaggtta tactttaaaa tattttaaaa ctatagaaga aagtgatttt 2100tatccagcga gaaattgatt tagtgcaaat gattttaatg atgcaaccaa atatacaaaa 2160cctcaagcaa acattattaa tgaaataggt aaaattaata gtacaaactt tatttataat 2220tttgtacaag gttcaccaaa taatcaaaat gatttaagaa ccagaagaac tttggatcct 2280aagttattag tagaacaaaa agcttttgca caattaaatc atttattaac tatggttaat 2340aacaatagtt cacaaaaaca acatgattta attaaaaatt caacagattt agtaaataat 2400gtcaatataa ctaatttatt aaaagattat tatgtttatt actatgatgt taacaatcct 2460aaagaaaata gtttaagttt taaattaggt tttattaaca aaactaatag taatataaga 2520tatagcgcta ataaagatat tactttagaa aatctttata atgattatca attagaagct 2580tatcctgaag ctttaataaa cagtattact ttgaaaaatt tcaatgttaa agtagatgtt 2640cttaaaaatc aaacgtcagc aacattgtta aattatttta aaactaataa aaatattaat 2700aataattatt tcaatttaac tgaaataagc tataacaatt gaaaattacc caattgaaat 2760gatttaaaaa tagctgaagt aaaaaatatt gaaaatagaa tttttgtcag actaaaatat 2820tcaaaataca tttttccaca atatgtcaat agacctaaag atattttagg tgatacatga 2880tatgaaattg gtcattttag tgattgaaca gatgataatt taactgatga acaaatttta 2940aactttttaa gtgctcaata taatatgaaa aaagtctttt tagctaatgg taaaatttta 3000agacaaagaa aaattaaatt aaattacaaa gataattatt ttgatttaag caataacaaa 3060aaagagatta cttgattatt taaaaaagat tattataacc cattattaaa acaagataag 3120gtaactaatg ctaaaatcaa ttttgaattt tttaccaata ttttatattt agacgagaat 3180cgttacaaga gagttttaga ttctcaacaa aatttaaata ttactttaga ttgaaatgaa 3240ttagtaaaac aaaaaactct tatttttaaa aaagaaactc aaagtgttaa taatattaaa 3300attgatttta ctttaacatt tactttaaat gaagaaggta ttcattttag ttatagatta 3360agtgatgata atgattattt aatagttgca aataatatag ctgaaactct ttattatcat 3420caaaaaactt tgccagaagt taaattcgat aaaaataaag caatttactt taatcaaaat 3480tttggagcta atattaacat tcaataccaa aatgaaattg aaaacgagac ttttagcaaa 3540tatcaaagta ataaatttga ttatcaaaat ttaagtataa cacctgaaaa tatgcccttt 3600tatatttata atgaagctta taatcatggt gaattattta aatataatcc taatgaaaat 3660ttaatttata aatgacatga aggatataaa ccttcagttg aatttatgca tttaagttat 3720gatgatcaaa gaattaaaga tattaacaat cgagttttag cctttaataa tggttcttct 3780ttaatgcttg gtaaagttaa taaagataaa caagatggca aatattactt tattactaat 3840aatcatgtag ttaataacaa taatacaatt gaaacacctt gagaaaatgc ctgaaaaaca 3900aatgctaatt tcactttaaa tggaactaat aaacatgtta tttcggctga tgctaaaaaa 3960

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序　列　表

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ggtgtagaca atgaaaacgc tacttctaca ccaattttta ctttctgaac aggatataaa 4020caatataatg atgacggcga aatacatgtt gatagtaaag ataaaaataa attagctgtt 4080ttacctgatt tatctactta catgattgat gttaataata ttattaataa tcttaaaaaa 4140caaggcaaat ttagcgctgc tttatgattt gaaaatctga aaaaattacc aaatttaggc 4200ataagcgatt acaataaaga taatattact tattttttag aaatgcacaa agctgttaat 4260aaaagcccta gttttgaaaa taaattgaat ttttcaacta atcgtttaat aacaggtttt 4320cctggttata aacaaattgg ttatatttat aatgatagta ctataggaag agcaagagaa 4380agttatcaaa gaacttctgt agaaactagt tatgccccaa tattctttag aggcggttta 4440agtggtacgg gagtagtaga tgatagaggt aattatatta ctagtttaaa tgctgcatca 4500ttctataatt ttgctacttc atattacaat tattctgtag cttgaaataa tgataaaaat 4560aaatatgaaa aatttaattg atttggtttt gctcctaata ttgaacaatt atataaatta 4620gctaataaaa attctcttgc ttcaactttt ttaaaattaa gttcttgaga tagtacaatc 4680gaaatacctg aatgagtatt taatcctaaa caattacaca aaaattaa 4728<210> 2<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 2aacgctactt ctacaccaa 19<210> 3<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 3ctactactcc cgtaccact 19<210> 4<211> 1575<212> PRT<213> 鸡滑液囊支原体<400> 4Met Lys Arg Lys Phe Lys Leu Leu Leu Ala Leu Asn Ala Ser Ser Ile1  5  10  15Phe Val Leu Thr Pro Leu Leu Thr Ala Cys Val Asn Arg Glu Ala Ile 20  25  30Asn Glu Glu Leu Lys Arg Leu Asn Ala Asn Asn Phe Asp Phe Asn Tyr 35  40  45Pro Asn Lys Asn Gln Thr Tyr Ala Leu Asp Val Lys Ala Glu Gln Phe 50  55  60Thr Thr Asn Ser Asn Asp Gln Ile Glu Leu Val Glu Pro Lys Ile Ile

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序　列　表

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65  70  75  80Glu Gln Val Asn Gln Glu Ala Lys Ala Thr Leu Gln Tyr Arg Leu Lys 85  90  95Ser Leu Lys Thr Asn Leu Asn Ala Glu Ile Ile Ser Asp Ile Leu Thr 100  105  110Lys Glu Ile Ser Gly Phe Lys Gln Gly Leu Ser Leu Glu Glu Leu Ile 115  120  125Thr Asn Glu Lys Glu Lys Leu Asn Lys Thr Asn Phe Thr Phe Asp Tyr 130  135  140Pro Tyr Lys Glu Asn Thr Phe Thr Glu Glu Ala Lys Leu Glu Lys Ile145  150  155  160Gln Ile Lys Thr Asn Asn Asn Tyr Gln Asn Glu Glu Leu Lys Asn Phe 165  170  175Thr His Asp Leu Lys Thr Asn Ser Ile Ser Phe Glu Tyr Gln Ile Phe 180  185  190Ile Glu Asn Phe Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Ser Asn Val Lys Lys Val 195  200  205Thr Ile Ser Gly Phe Lys Asn Lys Gln Thr Phe Glu Asn Gln Asn Ser 210  215  220Val Asp Thr Phe Leu Ala Ser Tyr Lys Ile Ala Glu Asn Pro Ser Ile225  230  235  240Asn Gln Asp Leu Asn Ile Lys Leu Tyr Ser Thr Ser Ile Ser Glu Gln 245  250  255Asn Ala Pro Tyr Phe Leu Asn Leu Val Asn Asp Lys Glu Ile Asn Leu 260  265  270Lys Ile Lys Asn Ile Lys Ile Asp Asp Asn Asn Leu Asn Gln Ile Ser 275  280  285Phe Thr Leu Val Ala Gln Lys Gly Asp Tyr Thr Lys Glu Glu Gln Arg 290  295  300Thr Phe Thr Phe Lys Asn Asp Val Ala Ser Leu Thr Asn Gly Leu Ser305  310  315  320Phe Asn Ser Ile Glu Glu Leu Tyr Asp Val Asp Tyr Ala Phe Leu Asn 325  330  335Ser Leu Ala Gly Asn Asp Leu Arg Asn Lys Thr Asn Leu Leu Asn Ser 340  345  350Ala Phe Ser Lys Lys Val Glu Lys Leu Asn Asn Leu Phe Asp Tyr Glu 355  360  365Ile Asn Trp Gln Lys Ser Lys Asn Asp Ile Thr Gln Val Glu Lys Lys 370  375  380

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序　列　表

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Val Arg Asp Val Asn Arg Gln Val Lys Asn Ala Lys Ala Phe Val Leu385  390  395  400Lys Trp Asn Leu Val Val Asp Val Lys Leu Asn Gly Lys Thr Ile Lys 405  410  415Ser Phe Asn Asn Leu Lys Thr Ala Asp Asn Arg Asn Gln His Asp Tyr 420  425  430Phe Gly Gly Asn Tyr Leu Tyr Thr Tyr Leu Leu Asn Asp Asp Phe Asn 435  440  445Val Thr Tyr Lys Pro Ser Gln Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Lys Phe Asn 450  455  460Asn Asn Lys Thr Asp Glu Val Leu Leu Thr Tyr Ile Asn Asn Thr Ala465  470  475  480Glu Glu Ile Lys Lys Thr Asn Glu Lys Tyr Lys Asn Ile Thr Thr Thr 485  490  495Gly Arg Tyr Pro Thr Leu Asn Gln Asn Asp Ala Leu Ser Arg Glu Leu 500  505  510Phe Lys Glu Ile Val Leu Lys Ser Phe Asp Phe Asn Leu Asn Gly Trp 515  520  525Gln Ile Glu Glu Val Val Ser Tyr Leu Asn Asn Asp Thr Asp Lys Phe 530  535  540Asn Tyr Phe Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys545  550  555  560Leu Thr Lys Asn Asn Gln Val Val Tyr Leu Pro Leu Ile Phe Asn Asn 565  570  575Phe Asn Tyr Asp Ile Asn Gln Leu Glu Asp Ala Phe Phe Val Asn Leu 580  585  590Val Thr Gly Asn Asn Ile Ser Lys Ile Leu Ser Gln Val Lys Ile Lys 595  600  605Lys Asn Asn Asp Thr His Gln Asn Tyr Leu Ala Ser Lys Ile Tyr Asp 610  615  620Asn Leu Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Pro Ala Asn Gly Arg Tyr Gln Ile625  630  635  640Lys Phe Leu Thr Lys Asp Gln Thr Arg Leu Gly Leu Pro Asn Lys Pro 645  650  655Ile Gln His Phe Asn Asp Ile Lys Gly Glu Ala Ile Val Gln Phe Gly 660  665  670Leu Phe Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Gly Ile Ser Thr Leu Gly Tyr Thr 675  680  685Leu Lys Tyr Phe Lys Thr Ile Glu Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Ala Arg

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序　列　表

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690  695  700Asn Trp Phe Ser Ala Asn Asp Phe Asn Asp Ala Thr Lys Tyr Thr Lys705  710  715  720Pro Gln Ala Asn Ile Ile Asn Glu Ile Gly Lys Ile Asn Ser Thr Asn 725  730  735Phe Ile Tyr Asn Phe Val Gln Gly Ser Pro Asn Asn Gln Asn Asp Leu 740  745  750Arg Thr Arg Arg Thr Leu Asp Pro Lys Leu Leu Val Glu Gln Lys Ala 755  760  765Phe Ala Gln Leu Asn His Leu Leu Thr Met Val Asn Asn Asn Ser Ser 770  775  780Gln Lys Gln His Asp Leu Ile Lys Asn Ser Thr Asp Leu Val Asn Asn785  790  795  800Val Asn Ile Thr Asn Leu Leu Lys Asp Tyr Tyr Val Tyr Tyr Tyr Asp 805  810  815Val Asn Asn Pro Lys Glu Asn Ser Leu Ser Phe Lys Leu Gly Phe Ile 820  825  830Asn Lys Thr Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Ser Ala Asn Lys Asp Ile Thr 835  840  845Leu Glu Asn Leu Tyr Asn Asp Tyr Gln Leu Glu Ala Tyr Pro Glu Ala 850  855  860Leu Ile Asn Ser Ile Thr Leu Lys Asn Phe Asn Val Lys Val Asp Val865  870  875  880Leu Lys Asn Gln Thr Ser Ala Thr Leu Leu Asn Tyr Phe Lys Thr Asn 885  890  895Lys Asn Ile Asn Asn Asn Tyr Phe Asn Leu Thr Glu Ile Ser Tyr Asn 900  905  910Asn Trp Lys Leu Pro Asn Trp Asn Asp Leu Lys Ile Ala Glu Val Lys 915  920  925Asn Ile Glu Asn Arg Ile Phe Val Arg Leu Lys Tyr Ser Lys Tyr Ile 930  935  940Phe Pro Gln Tyr Val Asn Arg Pro Lys Asp Ile Leu Gly Asp Thr Trp945  950  955  960Tyr Glu Ile Gly His Phe Ser Asp Trp Thr Asp Asp Asn Leu Thr Asp 965  970  975Glu Gln Ile Leu Asn Phe Leu Ser Ala Gln Tyr Asn Met Lys Lys Val 980  985  990Phe Leu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Arg Gln Arg Lys Ile Lys Leu Asn 995  1000  1005

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序　列　表

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Tyr Lys Asp Asn Tyr Phe Asp Leu Ser Asn Asn Lys Lys Glu Ile 1010  1015  1020Thr Trp Leu Phe Lys Lys Asp Tyr Tyr Asn Pro Leu Leu Lys Gln 1025  1030  1035Asp Lys Val Thr Asn Ala Lys Ile Asn Phe Glu Phe Phe Thr Asn 1040  1045  1050Ile Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Arg Tyr Lys Arg Val Leu Asp Ser 1055  1060  1065Gln Gln Asn Leu Asn Ile Thr Leu Asp Trp Asn Glu Leu Val Lys 1070  1075  1080Gln Lys Thr Leu Ile Phe Lys Lys Glu Thr Gln Ser Val Asn Asn 1085  1090  1095Ile Lys Ile Asp Phe Thr Leu Thr Phe Thr Leu Asn Glu Glu Gly 1100  1105  1110Ile His Phe Ser Tyr Arg Leu Ser Asp Asp Asn Asp Tyr Leu Ile 1115  1120  1125Val Ala Asn Asn Ile Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr His Gln Lys Thr 1130  1135  1140Leu Pro Glu Val Lys Phe Asp Lys Asn Lys Ala Ile Tyr Phe Asn 1145  1150  1155Gln Asn Phe Gly Ala Asn Ile Asn Ile Gln Tyr Gln Asn Glu Ile 1160  1165  1170Glu Asn Glu Thr Phe Ser Lys Tyr Gln Ser Asn Lys Phe Asp Tyr 1175  1180  1185Gln Asn Leu Ser Ile Thr Pro Glu Asn Met Pro Phe Tyr Ile Tyr 1190  1195  1200Asn Glu Ala Tyr Asn His Gly Glu Leu Phe Lys Tyr Asn Pro Asn 1205  1210  1215Glu Asn Leu Ile Tyr Lys Trp His Glu Gly Tyr Lys Pro Ser Val 1220  1225  1230Glu Phe Met His Leu Ser Tyr Asp Asp Gln Arg Ile Lys Asp Ile 1235  1240  1245Asn Asn Arg Val Leu Ala Phe Asn Asn Gly Ser Ser Leu Met Leu 1250  1255  1260Gly Lys Val Asn Lys Asp Lys Gln Asp Gly Lys Tyr Tyr Phe Ile 1265  1270  1275Thr Asn Asn His Val Val Asn Asn Asn Asn Thr Ile Glu Thr Pro 1280  1285  1290Trp Glu Asn Ala Trp Lys Thr Asn Ala Asn Phe Thr Leu Asn Gly

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1295  1300  1305Thr Asn Lys His Val Ile Ser Ala Asp Ala Lys Lys Gly Val Asp 1310  1315  1320Asn Glu Asn Ala Thr Ser Thr Pro Ile Phe Thr Phe Trp Thr Gly 1325  1330  1335Tyr Lys Gln Tyr Asn Asp Asp Gly Glu Ile His Val Asp Ser Lys 1340  1345  1350Asp Lys Asn Lys Leu Ala Val Leu Pro Asp Leu Ser Thr Tyr Met 1355  1360  1365Ile Asp Val Asn Asn Ile Ile Asn Asn Leu Lys Lys Gln Gly Lys 1370  1375  1380Phe Ser Ala Ala Leu Trp Phe Glu Asn Leu Lys Lys Leu Pro Asn 1385  1390  1395Leu Gly Ile Ser Asp Tyr Asn Lys Asp Asn Ile Thr Tyr Phe Leu 1400  1405  1410Glu Met His Lys Ala Val Asn Lys Ser Pro Ser Phe Glu Asn Lys 1415  1420  1425Leu Asn Phe Ser Thr Asn Arg Leu Ile Thr Gly Phe Pro Gly Tyr 1430  1435  1440Lys Gln Ile Gly Tyr Ile Tyr Asn Asp Ser Thr Ile Gly Arg Ala 1445  1450  1455Arg Glu Ser Tyr Gln Arg Thr Ser Val Glu Thr Ser Tyr Ala Pro 1460  1465  1470Ile Phe Phe Arg Gly Gly Leu Ser Gly Thr Gly Val Val Asp Asp 1475  1480  1485Arg Gly Asn Tyr Ile Thr Ser Leu Asn Ala Ala Ser Phe Tyr Asn 1490  1495  1500Phe Ala Thr Ser Tyr Tyr Asn Tyr Ser Val Ala Trp Asn Asn Asp 1505  1510  1515Lys Asn Lys Tyr Glu Lys Phe Asn Trp Phe Gly Phe Ala Pro Asn 1520  1525  1530Ile Glu Gln Leu Tyr Lys Leu Ala Asn Lys Asn Ser Leu Ala Ser 1535  1540  1545Thr Phe Leu Lys Leu Ser Ser Trp Asp Ser Thr Ile Glu Ile Pro 1550  1555  1560Glu Trp Val Phe Asn Pro Lys Gln Leu His Lys Asn 1565  1570  1575

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说　明　书　附　图

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图1

图2

图3

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说　明　书　附　图

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图4

图5

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