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携带HGF基因的脐带血干细胞异种移植促进烧伤创面修复的实验研究

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宁夏医学杂志2013年11月第35卷第11期Ningxia Med J,Nov.2013,Vol 35,No.11 ・1033・ 文章编号:1001—5949(2013)11—1033—03 ・论 著・ 携带HGF基因的脐带血干细胞异种移植 促进烧伤创面修复的实验研究 金丽娟,汪玉海 [摘要] 目的探讨携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad—HGF)修饰的脐血干细胞局部异种移 植对烧伤创面愈合的作用。方法用密度梯度离心法检测体外分离培养人脐血干细胞,并以感染复数(MOI= 100)体外转染Ad—HGF。将24只Wistar大鼠分为脐血干细胞治疗组(A组,n=8),Ad—HGF修饰脐血干细胞 治疗组(B组,n=8),空白对照组(c组,n:8)。建立大鼠深Ⅱ度烧伤模型,根据不同组别将细胞悬液及生理盐水 于创面下多点注射,伤后3、5、7、14、21 d观察创面收缩率并采集创面标本,行HE染色以及创面组织羟脯氨酸的测 定。结果伤后7、14、21 d,B组创口收缩率高于与其他2组,差异有统计学意义意义(P<0.05);HE染色显示, 3、5 d各组HE染色差异无统计学意义,7 d可见B组表皮化明显;21 d B组再生表皮明显厚于其它各组,并可见较 多的新生血管和皮肤附属器生成。伤后5 d B组羟脯氨酸升高明显,与其他2组比较差异有统计学意义(P< 0.05);14 d羟脯氨酸含量降低,与其他2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论Ad—HGF修饰脐血干细 胞异体移植可显著提高烧伤创面愈合速度和质量,为烧伤创面修复提供了新的策略。 [关键词] 烧伤创面;重组腺病毒;脐血干细胞;愈合 [中图分类号] R644 [文献标识码] A Effects of Ad—HGF modified umbilical cord blood stem cell oll healing of burn wounds after xenograft JIN L旬 n,WANG Yuhai.Ningxia People Hospital,Yinchuan 750021,China [Abstract] Objective To explore effects of umbilical cord blood stem cell with transfection of adenoviral vector expressing hu— man hepatocyte growth factor(Ad—HGF)after xenograft on healing of burn wounds.Methods Umbilical cord blood stem cell were collected,cultured and transfected with Ad—HGF.24 Wistar rats were subjected to boiling water for 12 seconds to produce a partial thickness skin burn.The rats were randomly divided into 3 groups:umbilical cord blood stem cell treatment(group A),transplantation of Ad—HGF modiifed umbilical cord blood stem cell(group B),and saline control(group C).According to different roups,gthe suspen— sion of stem cells,and saline were injected into the derma of burn wounds.The contraction rate of burn wounds was calculated and histo- logical examination was performed at 3,5,7,14 and 21 days after the injury.At the same time,hydroxyproline content in wound tissue was analyzed.Results During the first,second and third week after burn,the contraction rate of burn wounds in group B was much higher than that in group A and C(P<0.05).Histolgical examination showed the thickness of epidermis in group B was signiifcantly deeper than that in the other groups,and many small vessels were observed in the derma of burn wounds.Hydroxyproline contents of wound tis- sues in group B was higher than others after 5 days,and decreased markedly at the 14th day.Conclusion Modiicatifon of umbilical cord blood stem cell with Ad—HGF transfection has positive effects on the healing of burn wounds,which may provide a new way to burn wound repair. [Key words] Burn wound;Ad—HGF;Umbilical cord blood stem cell;Healing 烧伤创面的修复常采用自体皮肤移植,但大面 积烧伤患者常存在自体皮肤不足。近十余年来,组 织工程学的发展为大面积皮肤缺损修复开辟了新途 径。脐血干细胞是一类与骨髓干细胞相同的具有多 向分化潜能的原始祖细胞,有特殊的生物学特性,表 广泛,被认为是替代自体外周血干细胞移植的理想 来源…。肝细胞生长因子(HGF)是一种有效促进血 管生长因子,已被应用于促进放射性损伤皮肤愈合 的实验性研究,并得出了肯定的结论 j。本研究利 用组织工程的原理将构建的携带肝细胞生长因子的 重组腺病毒(Ad—HGF)转染人脐血干细胞,应用于 烧伤创面,观察对创面愈合方面的效果。 1材料与动物 面抗原性弱,不易被排斥,能在体内长期存活,来源 [作者单位]宁夏人民医院,宁夏银川750021 [作者简介]金丽娟(1980一),女,主治医师,硕士研究生,从事超声 修复方向。 [网络出版地址]http://www.cnki.net/kcms/detajl/64.1008.R. 2013l112.1231.0o8.html 1.1 实验动物:3月龄Wistar雌性大鼠,体重(180g ±40g),由甘肃省中医学院提供,动物合格证号: SCXK(甘)2004—0006。 宁夏医学杂志2013年l1月第35卷第ll期Nin ̄ia Med J,Nov.2013,Vol 35,No.1】 1.2 实验材料:Ad—HGF病毒(兰州军区实验中心 梭形。 2.2 烫伤创面愈合情况观察:伤后7、14、21 d,B 惠赠),小牛血清(美国GIBCO公司),胰蛋白酶(美 国SIGMA公司)。 组创口收缩率明显较其他2组高,差异有统计学意 义(P<0.05),见表1。 表1 烫伤后不同时间各组大鼠创面愈合率的比较( ±s) 1.3 实验方法:①脐带血干细胞体外培养,用脐静 脉穿刺法抽取健康足月产妇约50 mL脐血,采用密 度梯度离心法分离,用含10%血清的DMEM—LG分 瓶培养。本实验使用细胞为传代培养的3~5代细 胞。@aa—HGF修饰脐带血干细胞,将生长旺盛的 脐血干细胞以1×10 个・孔。。接种于6孔板,24 h 后弃去培养上清,加入含Ad—HGF病毒颗粒的 DMEM—LG培养基((MOI=100,pfu/cel1)孵育2 h, 换含5%血清的培养基继续培养48 h。③动物模型 制作及分组,Wistar雌性大鼠(180±40)g 24只,经 腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg・kg )麻醉后备皮, 背部以Na,S脱毛,大块橡胶剪一2 em×2 elTl大小 小洞,覆盖于大鼠背部脱毛处,放人90℃热水中5 s,造成大鼠背部深Ⅱ度烫伤模型,病理切片证实。 将造模成功的大鼠分为3组:脐血干细胞治疗组(A 组),Ad—HGF修饰的脐血干细胞治疗组(B组), 生理盐水对照组(c组),每组8只。④细胞移植,将 生长旺盛的单纯脐血干细胞悬液(0.5 mL,3 x 10。细 胞)、Ad—HGF修饰的脐血干细胞(0.5 mL,3 X 10。 细胞)悬液以及生理盐水(0.5 mL),于造模同时按 组别注射于创面真皮下,覆盖凡士林油纱,采用打包 法缝合固定后单笼饲养。⑤组织学检查,分别于伤 后第3、5、7、14、21 d在无菌条件下用手术刀在烫伤 创面取材,标本常规石蜡包埋制片,HE染色,光镜下 观察。⑥细胞移植后皮肤创面的观察每组8只大 鼠,每天观察创面愈合情况,以完全上皮覆盖作为创 面愈合时间的依据。每组于伤后7、10、14 d采用透 明胶片描记加称重法测定局部创面面积,按下列公 式计算:创面愈合率=(原始创面面积一未愈合创 面面积)/原始创面面积×100%。⑦皮肤组织中 羟脯氨酸(HYP)的测量,烫伤创面取材的标本一 70 ̄C保存,按照HYP试剂盒(上海继锦化学科技有 限公司)说明书步骤,测定所取的第3、5、7、14、21 d 皮肤组织中HYP的含量。 1.4统计学方法:计量资料以 ±s表示,采用方差 分析及两两比较q检验,以P<0.05为差异有统计 学意义。 2结果 2.1脐血干细胞的分离培养与扩增:原代细胞经过 24 h体外培养后有少量细胞贴壁,在4 d内呈相对静 止状态,之后细胞生长;速度加快,并呈克隆样生长; 12 d左右达到细胞融合,细胞形态成比较均一的 注: 与A组比较,P<0.05; 与C组比较,P<0.05。 2.3各组烫伤愈合的组织学观察:肉眼观察烫伤后 7 d,3组动物所有创面均形成痂皮,未见溃破。伤后 12 d创缘有新生表皮生成,21 d部分创面愈合。HE 染色光镜显示,3、5 d各组无明显差异;7 d可见B组 表皮化明显,21 d B组再生表皮明显厚于其它各组, 并可见较多的皮肤附属器及新生血管生成(图1— 2,目录后)。 2.4 烫伤创面皮肤组织羟脯氨酸含量测定:见表2。 烫伤后3 d B组羟脯氨酸含量高于其它组,但差异无 统计学意义;伤后5、7 d羟脯氨酸继续高于其它2组 (P<0.05),14 d后B组羟脯氨酸含量低于其它2 组(P<0.05)。 表2各组大鼠烧伤创面羟脯氨酸含量比较( g・mg~,元±s) A组8 1.6±O.3 2.5±0.7 1.9±0.7 1.6±0.6 B组8 1.8±0.5 2.9±O.4 1.8±O.7 1.2±0.6 C组8 1.5±0.6 2.1±O.7 2.0±O.5 1.7±O.6 F值 3.83 3.72 3.51 3.43 笪 : : :堕 ! :堕 3讨论 创面修复是机体通过自身的再生能力,其本质 是以干细胞为主,包括内皮细胞、角质细胞等修复细 胞在创面不断生长、扩增,从而完成对创面的修 复 J。如何有效地对创面进行修复是目前创面临床 治疗的难点。近年来,随着对脐血干细胞研究的深 入,国内外学者认为,通过脐血干细胞移植修复创 面,可以较好地解决皮源供给以及皮肤结构、功能重 建等问题。需要探索新的途径以提细胞治疗的 效果。HGF是一种多功能生长因子,可以促进血管 生成和抑制细胞凋亡。以往作者的研究已证实单纯 应用细胞因子流失大,且大面积创伤后创面周围存 活细胞少,为细胞因子的单独应用也带来困难 。 因此,本实验将两者联合应用,采用携带HGF基因 的重组腺病毒转染脐血干细胞,使脐血干细胞表达 HGF蛋白而发挥HGF与脐血干细胞的双重作用,用 于促进对大鼠皮肤烫伤的研究。 宁夏医学杂志2013年l1月第35卷第ll期Ningxia Med J,Nov.2013,Vol 35,No.11 ・1035・ 文章编号:1001—5949(2013)11—1035—03 ・论 著・ 持续输注瑞芬太尼抑制鼻内镜手术后 气管拔管反应的临床观察 曹池 ,张永海 ,马玲 ,马汉祥 将66例ASM—II级 ・( [摘要] 目的 观察持续输注瑞芬太尼抑制鼻内镜手术后拔管期间应激反应的效果。方法择期行鼻内镜鼻中隔矫正手术患者分为3组:瑞芬太尼0.075 ・(kg・min) (R1组,n=22)、瑞芬太尼0.05 ・min) (R2组,n=22)与空白对照组(C组,n=22)。手术结束时,R1组和R2组停用丙泊酚,R1组继续输注瑞芬太尼 0.05 ・(kg・min)~,R2组继续输注瑞芬太尼0.750 Isg・(kg・min) 至拔出气管插管后5 min,C组手术结束时同时 停用丙泊酚和瑞芬太尼。观察3组停药前(TO)、拔管前(T1)、拔管后1 min(T2)、3 min(T3)、5 min(T4)时刻的血压和心率 变化,同时观察3组患者苏醒时间的变化。结果2组患者的性别、年龄、体重、拔管前SBP、DBP、HR差异无统计学意义 (P>0.05)。2组患者的睁眼时间、拔管时间差异无统计学意义(P>0.5)。空白组苏醒时间明显短于瑞芬太尼组,03组 患者苏醒时间R1组(9.8±2.6)min,R2组(8.9±2.3)min,C组(6.7±1.8)min,空白组苏醒时间明显短于瑞芬太尼组 (P<O.5)。结论0术后以0.05一O.75 ・(ks・min) 速度持续静脉输注瑞芬太尼可减轻患者围拔管期心血管反应, 患者可清醒耐受气管插管通气,是一种安全、有效、可控的麻醉方法。 [关键词] 瑞芬太尼;气管拔管;鼻中隔手术;内镜手术;应激反应 [中图分类号]R614.2 [文献标识码]A The clinical observation of tracheal extubation response of remifentanil infusion in nasal endoscopic surgery CAO Chi ,ZHANG Yonghai ,MA Ling ,MA Hanxiang .1.General Hospital ofNingxia Medical University,Yinchuan 750004,Chi— ha;2.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China Corresponding author:MA Hanxiang,Email:mahanxiang@hotmail.com [Abstract] Objective To observe the effect of tracheal extubation response of remifentanil infusion in nasal endoscopic operation. 胶原是构成烧伤创面的基质,其代谢状况可反映 创面愈合隋况,而羟脯氨酸是合成胶原的特有原料,在 组明显的上皮化以及修复后良好的表皮质量,均提示了 转染HGF后的脐血干细胞在促进创面愈合上的优势。 胶原中的含量恒定 ,测定其含量可反映组织愈合过程 中胶原代谢水平,从而反映创面愈合情况。实验中显 示,伤后3 d B组羟脯氨酸含量高于其它组,但差异无 统计学意义,5 d后差异有统计学意义。早期的羟脯氨 酸升高,体现了对创面较好填充作用,14 d后各组羟脯 氨酸含量均较前降低。已有文献报道 ,羟脯氨酸含量 的变化趋势与创面组织的上皮化程度表现出明显的相 关陛,随着表皮细胞覆盖创面的发展,羟脯氨酸逐渐减 少,提示创面上皮化的过程正是胶原合成抑制的过程。 B组羟脯氨酸含量降低的最显著,从而得出推断,Ad— HGF修饰的脐血干细胞与其它组相比,加速创面上皮 创口收缩率结果也同样肯定了HGF修饰的脐血干细胞 提高创面愈合速度和质量的效应。对上述实验结果分 析,显而易见,经HGF转染后的脐血干细胞对创面愈合 有一定的促进作用,而且其作用明显优于单独使用脐血 干细胞,这种促进作用可能是双方协同作用的结果。 [参考文献] [1]王杨,张翼,王锦之,等.脐血干细胞移植治疗压疮性溃疡创面 [J].吉林医学,2012,12(33):7421—7423. [2] 哈小琴,张俊,邓芝云,等.肝细胞生长因子基因重组腺病毒修 饰间充质干细胞修复急性放射性损伤大鼠的创面[J].中国组 织工程研究,2012,16(49):9226—9231. 化进程更为显著,这与本实验中组织学观察得出的结果 相一致。组织学HE染色显示,在治疗后7 d B组出现 [3] 罗瞳,李利平.脐血干细胞与创面愈合[J].现代生物医学进展, 2011,1l(O5):986—988. 的上皮化程度要明显优于其他各组,21 d再生皮肤表皮 层明显增厚,并可见较多的新生血管和附属器生成。B [基金项目]宁夏医科大学校级课题(XQ2012006) [作者单位]1.宁夏医科大学总医院麻醉科,宁夏银川750004 2.宁夏医科大学,宁夏银川750004 [通讯作者]马汉祥,Email:mahanxiang@hotmm1.corn [网络出版地址]http://www.cnki.net/kcms/detaiL/64.1008.R 20l3l112.1230.003.html [4]金丽娟,哈小琴,张诚,等.Ad—HGF修饰MSCs异体移植对烧 伤创面愈合的作用[J].西北国防医学杂志,2007,28(1):12. [5]Dimicco MA,Waters SN,Akeson WH,et a1.Integrative articular cartilage repair:dependence on developmental stage and collagen metabolism[J].Osteoarthritis and Cartilge,a2002,10:218. [6]Sanwal R,Chaudhary AK.Wound healing and antimicrobial poten・ tial of carissa spinarum linn.in albino mice[J].J Ethnopharmacol, 2011,135(3):792—796. [收稿日期]2013—05—20 [责任编辑]李洁 

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