解答题川大

转运RNA tRNA 转运氨基酸 核蛋白体RNA rRNA 核蛋白体组成成 信使RNA mRNA 蛋白质合成模板 不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体 小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接

小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分 反义RNA anRNA/micRNA 对基因的表达起调节作用 核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的RNA 2、酵母双杂交系统的原理以及应用？

原理：细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。 而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 酵母双杂交系统就是用这一事实基础来进行研究的。假设我们以与SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。 由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。 如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。

应用：酵母双杂交系统酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。 2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用

在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种

AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。

3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响

酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。

4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map） 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。 3、什么叫正、负？分类？举例

原核生物的基因主要发生在转录水平上，按照其机制的不同可分为负转录和正转录。在负转录系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白；而正转录中，调节基因的

产

物

是

激

活

蛋

白

。

负控诱导：阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录（乳糖操纵子） 负转录 负控阻遏：阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录(色氨酸操纵子) 正控诱导：效应物（诱导物）的存在使激活蛋白处于活化状态 正转录 正控阻遏：效应物（诱导物）的存在使激活蛋白处于非活化状态 4、RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的对比？ 酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 细胞内定位 核仁 核质 核质 转录产物 rRNA hnRNA tRNA 不敏感 敏感 存在物种特异性

对a-鹅膏嘾碱的敏感 5、突变和复制在基因进化中的作用，并举例说明

答：基因复制是进化的主要动力，而基因突变是进化的主要来源，外显子就像构建基因的模块，在进化的不同重组事件中发挥作用，在一种极端情况下，一条基因的外显子拷贝后移位到其他基因上，另外一种极端情况下包括外显子和内含子整个基因都被复制。这种突变就可以在这份拷贝中积累下去而不会受到自然选择过程中的负性影响。基因复制后，因为每份基因会发生不同的突变，因而产生拷贝见的差异，这些差异以每年10万年约1%的速率积累。重复基因可以突变演变产生不同的基因或其中一份拷贝会失活，从而导致了进化。 （A、突变改变DNA序列B、突变影响单个碱基对或更长序列C、突变效应可逆转D、突变集中在热点）

举例：原始的琼蛋白，大约产生于8亿年前，由单基因编码，现代琼蛋白基因基因家族是有一个原始基因通过一系列突变和移位演变而成的。所有琼蛋白基因是一个由三个外显子组成的，在原始鱼只有一类琼蛋白链，进化阶段表现在爪蟾上，它具有两个琼蛋白基因簇，是编码祖先琼蛋白的单链序列通过复制和变异产生的αβ基因，这一连锁的αβ基因簇发生发生复制，然后各份拷贝又发生变异，然后，整个基因簇又发生复制，在哺乳类和鸟类中，琼蛋白基因簇是分开的，两个蛋白基因簇是通过转座分离的，在更近的一段时间里，分开的两个基因簇内各自发生着碱基替换，同义突变的，从而导致了进化。 6、半保留复制

DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。DNA复制过程如下：

A、 DNA改变双螺旋构象，解链酶解开双链，在单链DNA结合蛋白（SSB）和DNA聚合

酶Ⅲ的作用下合成先导链，方向与复制叉推进的方向一致。在滞后链上，当复制叉进一步打开时，RNA引物才能与DNA单链相结合 B、 滞后链合成时，产生冈崎片段

C、 复制叉继续前进，DNA引物酶合成新的RNA引物，与DNA单链相结合准备引发合成

新的冈崎片段。

D、 当复制叉前移，遇到重复性终止子序列（Ter）时，Ter－Tur复合物能阻止复制叉的继

续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶Ⅳ的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。 7、三大实验

1. 肺炎双球菌转化实验：

肺炎双球菌可引起肺炎，细菌的荚膜多糖决定其毒性。光滑的肺炎双球菌（S型）可引起小鼠死亡，而粗糙表面的肺炎双球菌（R型）不会引起小鼠死亡。利用处理致死的S菌成分，可以使R型的肺炎双球菌转化为S型，并变得有毒性。能引起细菌转化的物质被称为转化物质。纯化转化物质，表明其为DNA。此实验说明了DNA是细菌的遗传物质。 2. T2噬菌体侵染实验：

T2噬菌体在其DNA组分被32P标记或在其蛋白组分被35S标记，分别感染大肠杆菌，接着在搅拌器中震荡破碎被感染的细菌，可分离出两种成分，一种包含从细菌表面释放出的空

的噬菌体外壳，另一种成分则含被感染的细菌本身。大部分32P出现在被感染的细菌中，而35S则出现在噬菌体外壳。说明仅仅是噬菌体的DNA进入了细菌，遗传给了下一代，DNA是遗传物质。 3. 转染实验

利用显微注射技术，将DNA注射导入小鼠卵细胞中，可以使DNA成为小鼠遗传物质的一个稳定部分。这个实验直接证明了DNA是真核生物的遗传物质。 8、真核生物在原核生物中表达需要注意些什么？ A、将内含子去掉

B、加上SD序列（mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列） C、注意原核生物中的特异启动子

D、为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。

因为然原核细胞仅靠一种RNA聚合酶就能负责所有RNA的合成，但它却不能识别真核基因的启动子。

E、注意密码子的简并性和偏爱性

9、简述真核细胞内跨膜信号转导途径中的cAMP-PKA途径。（P841）（细胞234） cAMP是一种G蛋白相关的第二信使，PKA是cAMP依赖的蛋白激酶，无活性的PKA含有两个C亚基和两个R亚基，激活的PKA脱离掉C亚基，R亚基与cAMP结合。基本路径如下：

1． 信号分子激活G蛋白耦联受体，释放活化的G蛋白a亚基； 2． 活化的G蛋白a亚基激活腺苷酸环化酶（adenylate cyclase）; 3． 腺苷酸环化酶转化ATP为cAMP； 4． cAMP浓度升高激活PKA；

5． PKA进入细胞核激活基因蛋白（是指磷酸化）； 6． 蛋白与相应序列结合，调节表达。

10、.信号转导中第二信使指的是什么？试举两个第二信使的例子与他们在细胞内的主要作用。

第二信使是一种由于效应器的被激活而释放的小分子，它能作用于下游相关受体起到信号放大作用。效应器是受G蛋白激活的目标蛋白 以下是相关的第二信使及其受体

1．cAMP:通过活化cAMP依赖的PKA使下游靶蛋白磷酸化，影响细胞代谢；

2．IP3 －DAG:引发储存在内质网中的Ca2+转移到细胞质基质中，使胞质中游离Ca2+浓度升高。

12、.何谓G-蛋白循环?有何意义 ？G蛋白的结构特点信其功能

答：G蛋白耦联受体是指配体－受体复合物与靶蛋白结合，继而激活第二信使，将膜外信号传导到细胞内的行为。

结构特点：G蛋白是三聚体结构，含GαGβGγ三个亚基，其中Gα具有GTPase酶活性，是分子开关，Gα与另外两个亚基结合锚定在膜上。 每个亚基的功能：

Gα：具有GTPase酶活性，是分子开关；

GβGγ：以异二聚体的形式存在，锚定于膜上，能结合Gα－GDP；

G蛋白循环：配体与受体结合，三聚体G蛋白解离，发生GDP与GTP交换，游离的Gα－GTP处于开启太，导致结合并激活效应器蛋白，从而传递信号；当Gα－GTP水解形成Gα－GDP时，处于失活的关闭态，中指信号传递并导致三聚体的重新组装，系统回复进入静息状态。

13、真核原核基因表达的对比：

1． 真核中，一条成熟的mRNA只翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操作子形式；

2． 真核DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合，只有小部分裸露；

3． 高等真核DNA很大部分不转录，有一部分序列是重复序列，此外，还有不被翻译的内含子；

4． 真核能够有序地根据需要进行DNA重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数，这种能力在原核生物中也是极为鲜见的；

5． 原核中，转录调节区很小，离转录启示位点近，蛋白结合后直接促进或抑制RNA聚合酶对它的结合。真核中，转录调解区大，原理启动子核心，不直接影响启动子区对RNA聚合酶的接受程度，而是通过改变整个上游序列的构型来影响。

6． 真核生物的RNA在细胞核中合成，需经过转移穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质。原核则无这样严格的空间；

7． 真核的DNA需经过复杂的成熟和剪接过程，才能被翻译。 14、试比较原核和真核细胞的mRNA的异同

1、 原核生物mRNA的半衰期非常的短，而真核生物的稍微长一些。

2、 许多原核生物的mRNA以多顺反子的形式存在，而真核生物多以单顺反子存在。 3、 原核生物的mRNA5’端无帽子结构，3’无或只有较短的poly结构，而真核生物

mRNA的最大特点就是在5’端的帽子结构和3’端的poly结构。 15、简述原核和真核细胞在蛋白质翻译过程中的差异 1、 核糖体不同，真：80s，原：70s

2、 模板不同，原核生物的mRNA多是多顺反子，而原核多是单顺反子

3、 起始的胺酰tRNA不同，原核为fMet-tRNAMet；而真核是Met- tRNAMet 4、 原核生物mRNA具有能与16sRNA序列反向互补的SD序列，而真核生物没有 5、 原核生物起始复合物的形成中，30s小亚基先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过

SD序列与mRNA模板结合；而真核生物，GTP先与eIF2结合，增加其与起始tRNA的亲和力，然后三者合成一个三元复合物与40s亚基结合，此过程不需要mRNA的存在，三元复合物在Eif3的存在下与mRNA结合，需要ATP供能

6、 延伸因子不同，原核生物每次需要三个延伸因子：EF-Iu，EF-Is,EF-G；而真核需要

EF-1,EF-2。

7、 终止因子不同：细菌内部存在3个不同的终止子RF1,RF2,RF3;而真核细胞只有RF。 16、原核细胞和真核细胞在合成蛋白质的起始过程有什么区别

真核生物蛋白质合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met- tRNAMet不甲酰化，5’端的帽子结构和3’端的poly结构都能参与形成翻译起始复合物 17、转座子

transposon, Tn，是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位，介导遗传物质重排现象

1． 最简单的转座子：

不含任何宿主细胞的基因，被称为IS，是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。IS序列都是可以存在的单元，带有介导自身移动的蛋白 特点：

1． 末端是倒置重复区，转座时会复制宿主细胞靶位点的一小段DNA，，形成IS序列两端的正向重复区；

2． 除IS1外，所有已知的IS序列都含有开放阅读框，翻译起始于第一倒置重复区，终于第二倒置重复区；

3． 转座频率高于恢复频率。

2． 复式转座子（composite transposon）： 1． 带有某些宿主基因；

2． 两翼是相同或高度同源的IS序列；

3． 其中的IS序列功能已被修饰，不能单独移动，只能随整个复合体移动； 4． 转座能力由IS序列决定和调节。 3． TnA(>5000bp): 1． 体积庞大； 2． 无IS序列；

3． 带有3个基因：belta-内酰胺酶基因，另外两个转座必需基因； 4． 两侧带有38bp的倒置重复序列。 转座子的遗传学效应：

1． 引起插入突变，如果插入突变发生在操纵子前半部，将导致极性突变，使该操纵子后半部基因失活； 2． 产生新基因：

3． 产生染色体畸变：当复制性转座发生于宿主DNA原有位点附近时，会导致转座子两个拷贝间的同源重组，造成DNA缺失或倒位；

4． 引起生物进化：使原来相距较远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生一些具有新的具有生物学功能的蛋白质分子。