生 三程 农品摹ＩＩ斜枝 Ｖｏ１．３ ．Ｎｏ．０７，２０１７ 浓香型白酒酿造大曲 及糟醅中功能芽孢杆菌的筛选 赵长青，徐莎，杨阳，赵阳 （四川理工学院生物工程学院，四川自贡６４３０００） 摘要：为从白酒酿造中分离筛选出有助于提高浓香型白酒风味成分的芽孢杆菌，本文从浓香型白酒酿造的大曲和糟 醅中分离得到了５５株芽孢杆菌，通过筛选得到了一株在发酵液中产生较多已酸乙酯和较少正丙醇的菌株，编号为 ＹＢ一１６，该菌株所产己酸乙酯含量符合国标高度优级酒的范围，所产正丙醇含量符合国标特级食用酒精的范围。通过 对该菌株进行形态特征观察、生理生化特征分析、分子生物学鉴定和构建系统发育树，发现ＹＢ－１６与Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＣＭ ＮＢＲＣ １５３０５聚为一个分支，亲缘关系最近，可将菌株ＹＢ一１６鉴定为蜡质芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）。若将 筛选的该Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｓ应用至浓香型白酒传统酿造工艺，ｕ将能够提升浓香型白酒的香味和品质。 关键词：浓香型白酒，功能菌，芽孢杆菌 Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｆｒｏｍ ｏｍａｇａｒｉ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｇｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌｕｚｈｏｕ－ｆｌａｖｏｒ ｌｉｑｕｏｒ ＺＨＡＯ Ｃｈａｎｇ－ｑｉｎｇ，ＸＵ Ｓｈａ，ＹＡＮＧ Ｙａｎｇ，ＺＨＡＯ Ｙａｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ ６４３０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｆｒｏｍ Ｌｕｚｈｏｕ—ｆｌａｖｏｒ ｌｉｑｕｏｒ ＳＯ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ，５５ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｏｍａｇａｒｉ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｇｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌｕｚｈｏｕ—ｆｌａｖｏｒ ｌｉｑｕｏｒ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｅｔｈｙｌ ｈｅｘａｎｏａｔｅ ａｎｄ ｌｏｗ－ｙｉｅｌｄ ｐｒｏｐａｎｏｌ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｎａｍｅｄ ａｓ ＹＢ一１６．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｅｔｈｙｌ ｈｅｘａｎｏａｔｅ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｓｔｒｏｎｇ ｌｉｑｕｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｐａｎｏｌ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａ ｅｄｉｂｌｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ．Ａｆｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ，ＹＢ一１６ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＣＭ ＮＢＲＣ １５３０５ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｂｒａｎｃｈ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ’Ｓ ｃｌｏｓｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ．Ｔｈｕｓ．ＹＢ一１６ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｓ ｃｅｒｕｅｕｓ．Ｉｔ ｉｓ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｂｒｅｗｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｌｕｚｈｏｕ－ｆｌａｖｏｒ ｌｉｑｕｏｒ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｔｓ ｆｌａｖｏｒ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｕｚｈｏｕ—ｆｌａｖｏｒ ｌｉｑｕｏｒ；ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｉｎ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ 中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—０３０６（２０１７）０７—０１５１－０５ ｄｏｉ：１０．１３３８６／ｊ．ｉｓｓｎｌ００２—０３０６．２０１７．０７．０２１ 中国白酒历史悠久，其中泸州老窖特曲酒为典 为主要类群 ］。施安辉研究了山东兰菱美大曲和辜 县酒厂发酵糟醅中的细菌类群，发现优势菌为芽孢 型代表的浓香型白酒。多年的研究证实，酿造过程 中功能菌液的质量影响着窖泥微生物生态功能及酒 糟发酵生态，从而决定着浓香型白酒的质量和风格 特征…。浓香型白酒酿造微生物主要来源于酿酒大 曲、窖泥、糟醅、原料及环境携带，但参与发酵产香微 生物主要来自于大曲、窖泥、糟醅及人工添加的生香 菌属［５ ３。刘莉萌等发现糟醅和窖泥中的乳酸菌以乳 酸片球菌和芽孢乳杆菌为主 。 。还有研究表明：对 浓香型白酒香气贡献最大的是梭状芽孢杆菌，其主 要代谢产物是己酸、丁酸和氢 。由上述可知，窖池 中的产香细菌均以芽孢杆菌为主。有报道称，芽孢 杆菌也是大曲中数量较多的细菌之一，它具有一定 水解蛋白质和淀粉的能力，在白酒固态发酵中能代 谢生成多种风味成分 。因此，本文希望能够从酿酒 菌纯培养或复合菌液、强化曲、人３２窖泥等 Ｊ。 随着微生物学的发展和应用，我国对浓香型白 酒产香或参与产香细菌的认识愈发细致，对其种群 和分布情况做了深入研究。张丽莺研究了泸州老窖 糟醅中的细菌区系，发现以芽孢杆菌和芽孢乳杆菌 大曲和糟醅中分离筛选出有助于提高浓香型白酒风 味成分的芽孢杆菌。而己酸乙酯被确定为浓香型白 收稿日期：２０１６—１０—２８ 作者简介：赵长青（１９８１一），女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｃｑ２０１０＠１６３．ｃｏｍ。 基金项目：酿酒生物技术及应用四川省重点实验室项目（ＮＪ２０１５—１１）；四川理工学院“泸州老窖科研奖学金”项目（１５ｌｊｚｋ０９）；四川省大学生创新 创业训练计划项目（２０１５１０６２２０５４）。 农昌，盐姊枝 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈ￣ｚｏｌｏｇｖ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ 酒的主体香味物质，成为制约浓香型白酒优质酒产 率的重要因素 。 在分离高产己酸乙酯的芽孢杆菌时，应注意到 所分离菌株产杂醇油的问题。由于杂醇油的含量过 高则容易引起上头、口干 ；同时它也是白酒产生白 色浑浊的原Ｌ大Ｊ之一 ，因此，我国对白酒中杂醇油的 含量有明确的规定。作为杂醇油的重要组分之一， 被认为是酒精发酵副产物的正丙醇已经成为我国新 食品酒精质量标７停中的一项质量指标 。因此，本 文希望能够分离 高产己酸乙酯和低产正丙醇的功 能芽孢杆菌。 １材料与方法 １．１材料及仪器 大曲和糟醋均由泸州老窖提供，取样于２０１５ 年１月；色谱纯己酸乙酯、正丙醇、乙酸正戊酯（规 格：５ ｍＬ） 天津市光复精细化］二所；无水乙醇（优级 纯） 成都市科龙化：Ｉ 试剂厂；气相色谱仪（型号： ＧＣ一７８６０） 上海寅友电子科技有限公司；色谱柱 （型号：ＤＢ—ＷＡＸ） 南京伽诺色谱技术有限公司。 １．２培养基 富集培养基：乙酸钠改良培养基：乙酸钠５ ｇ，硫 酸铵０．５ ｇ，磷酸氢二钾０．４ ｇ，七水硫酸镁０．２ ｇ，酵母 膏１ ｇ，碳酸钙５ ｇ，蒸馏水１０００ ｍＬ，ｐＨ６．０～ｐＨ６．５，以 １２１℃灭菌２０ ｒｎｉｎ，接种前加无水乙醇２Ｏ ｍＬ 。 苏氨酸液体发酵培养基：葡萄糖３０ ｇ，酵母膏 ｌ ｇ，氯化钠６ ｇ，巴豆酸２ ｇ，苏氨酸２．５ ｇ，蒸馏水 １０００ ｍＬ，１ １５℃灭菌３０ ｍｉｎ 。 ＬＢ（Ｌｕｒｉａ—Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基 ：蛋白胨１０ ｇ，酵母 膏５ ｇ，氯化钠１０ ｇ，琼脂１５ ｇ，蒸馏水１０００ ｒｎＬ， ｐＨ７．０，ｌ２１ 灭菌２０ １］ｆｌｉｎ。 １．３芽孢杆菌的分离 取２．０ ｇ大 和糟醅混合样品于１００ ｍＬ灭菌蒸 馏水中，充分震荡３～５ ｒａｉｎ后，过滤。然后取２ ｍＬ滤 液于１Ｏ０ ｍＬ富集培养基中，置于３７℃、１５０ ｒ／ｒｎｉｎ培 养箱中培养２４ ｈ。富集培养完成后，将富集培养基 放在９０℃水浴锅中加热５ ｒａｉｎ，杀灭菌体，使芽孢得 到富集。冉取富集的芽孢杆菌液稀释到１０ ”～１０ 二十个梯度。稀释完成后，将不同浓度的菌液分别 接种到ＬＢ培养基上进行平板涂布，然后置于３７℃ 培养箱巾倒置培养２４ ｈ。从平板上选择菌落形态不 同且处于单独位置的菌株，待长出菌苔后，进行镜 检，按无菌操作方法在ＬＢ培养基上进行划线分离，置 于３７℃恒温箱中培养，每隔６ ｈ观察菌体生成情况。 重复此操作，直至出现单一菌落后，将该单一菌落接种 到ＬＢ培养基斜面中，然后分别进行编号 。 １．４芽孢杆菌的筛选 将经过初筛后保藏于斜面培养基中的各株芽孢 杆菌分别接种２环至１００ ｍＬ已灭菌的苏氨酸液体发 酵培养基中，使其初始菌落数为１０ ～３×１０ ＣＦＵ／ｍＬ， 置于２８ 、１２０ ｒ／ｍｉｎ摇床中培养４ ｄ。发酵结束后， 将发酵液取 ，用超高速离心机以１００００ ｒ／ｒａｉｎ于 ４℃离心２０ ｍｉｎ，取上清液。过滤后用气相色谱仪测 定发酵液中的乙酸乙酯和正丙醇含量，筛选出能在 生 王ｊｌ警 发酵液中生成较多己酸乙酯和较少正丙醇的芽孢 杆菌。 气相色谱条件：色谱柱为ＤＢ—ＷＡＸ ６０ ＩＴＩ× ２５０ ｍ×０．２５ ｍ，进样口温度２ｌ０℃；检测器温度 ２３０℃。柱箱升温程序：４０℃保持５ ｒａｉｎ，然后以 ５℃／ｒａｉｎ升至８０℃，保持２ ｒａｉｎ，最后以１０℃／ｒａｉｎ 到升至２３０℃，保持５ ｒａｉｎ，运行时间３５ ｒａｉｎ。载气： Ｎ ，Ｎ ：Ｈ ＝８０：２０，载气流量：５ ｍＬ／ｍｉｎ，载气压力： ０．０８ ＭＰａ，进样量１ Ｌ。 标准溶液配制：准确吸取色谱纯标准试剂２ ｍＬ 于１００ ｍＬ容量瓶中，万分之一分析天平称重数为 ２％的标准溶液，浓度单位为（ｍｅ，／１００ ｍＬ）。准确吸 取体积分数为２％的各标准溶液３ ｍＬ于２５ ｍＬ容量 瓶中，用６０％乙醇（超纯水稀释无水乙醇得）定容至 刻度，由此配制成混合标准溶液，用于建立系统模板 和计算校正因子。 模板建立及校正因子的计算：根据各种物质在 同一色谱柱和相同仪器条件下有确定不变的保留 值，因此可以定性混合标准液中各种成分，从而确定 其出峰顺序。取混合标准液１ Ｌ进样色谱分析，进 样４次。出峰顺序依次为：正丙醇、乙酸正戊酯（内 标）、己酸乙酯。根据峰面积和混合标准样品的质量 浓度（ｍｇ／１００ｍＬ）计算校正因子。校正因子＝内标 物的峰面积×标准物质的浓度／内标物的浓度／标准 物质的峰面积。 发酵液测定：取各样品１．５ ｍＬ，加入０．１５ ｍＬ体 积分数为２％的标准内标物（乙酸正戊酯），内标物浓 度２０８．５９６ ｍｇ／１００ ｍＬ。混匀后，在与ｆ值测定相同 的条件下进样，根据保留时间确定己酸乙酯和正丙 醇峰的位置，并测定己酸乙酯和正丙醇与内标峰面 积，求 峰面积之比，计算 样品中己酸乙酯和正丙 醇的含量。己酸乙酯和正丙醇的浓度＝校正因子× 香气物质的峰面积×内标物的质量浓度／内标物的 峰面积。 １．５芽孢杆菌的鉴定 １．５．１ 形态观察将所筛选的菌株进行菌落形态观 察、菌体形态观察、革兰氏染色和芽孢染色 。 １．５．２生理生化鉴定将所筛选的菌株进行生理生 化鉴定，包括甲基红实验、Ｖ．Ｐ实验、淀粉水解实验、 明胶水解实验、过氧化氢酶实验 。 １．５．３分子生物学鉴定参考文献［１８］利用十六烷 基ｊ甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法在高离子强度的溶液中 可以与蛋白质和多聚糖形成复合物，但是却不能沉 淀核酸的原理，并充分结合酶法、ＳＤＳ法提取ＤＮＡ， 通过有机溶剂的抽提去除蛋白质、多糖、酚类等杂质 （胶孑Ｌ里没有明显的蛋白质残留，条带清晰），并加入 异丙醇沉淀使核酸分离出来。 步骤如下：首先接种２环菌种于液体ＬＢ培养基 中，１５０ ｒ／ｍｉｎ、３７℃摇床培养１２ ｈ。然后收集０．２ ｇ 菌体于２ ｍＬ离心管中，再加入５００ Ｌ ＣＴＡＢ溶液和 ５０ Ｌ溶菌酶（１００ ｍｇ／ｍＥ），置于２２５ ｒ／ｒａｉｎ、３７ ｏＣ摇 床培养过夜。在经过溶菌酶作用后的菌液中加入 ２５０ ＩｘＬ，２０％ＳＤＳ和２５ Ｌ蛋白酶（２０ ｍｇ／ｍＬ），置 生 王程 食品，ＩＩ钟枝 Ｖｏ１．３８，．Ｎｏ．０７，２０１ ７ 表１混合标准液的校正因子 Ｔａｂｌｅ １ ＣｍＴｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３２∞∞于６５ ｏＣ恒温水浴锅中水浴１ ｈ，每１５ ｒａｉｎ震荡混匀１ 次。当水浴完成过后，将离心管于一８０℃冰箱冷冻 １５ ｍｉｎ后又置于６５℃恒温水浴锅中水浴１５ ｍｉｎ，如 此反复三次。再加入与离心管中液体等体积ｔｒｉｓ 酚一氯仿一异戊醇（２５：２４：１），经过涡旋混匀后静置 １０ ｒａｉｎ。然后以１２０００ ｒ／ｒａｉｎ于４ ｏＣ离心１５ ｍｉｎ，取 上清液，重复至无白色沉淀为止。然后，加入等体积 氯仿一异戊醇（２４：１），经过涡旋混匀后静置１０ ｍｉｎ，于 １２０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１５ ｒａｉｎ，取上清液。在取得的上清液 中加入０．６倍体积的预冷异丙醇并混匀，放入一２０℃冰 箱中沉淀１ ｈ。沉淀完成后，于４℃，１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １５ ｔｒａｉｎ，弃去上清液取沉淀。随后用１ ｍＬ乙醇 （７０％）洗涤，再于４ ｏＣ，１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｒａｉｎ，取 沉淀重复一次。然后将离心管于超净工作台烘干至 无酒精昧后加人５０ Ｌ无菌双蒸水，放入６５℃恒温 水浴锅中水浴１ ｈ。最后将所提取的ＤＮＡ送至上海 杰李生物技术有限公司测序，获得ＤＮＡ拼接序列。 测序结果在ＮＣＢＩ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ／）中进行比对并采用ＭＥＧＡ ６．０软件（邻接法）构 建１６Ｓ ｒＲＮＡ系统发育树。 ２结果与讨论 ２．１ 校正因子 如表１所示，混合标准样品（正丙醇、乙酸正戊 酯、己酸乙酯）中３种成分相对标准偏差（ＲＳＤ）相对 较小，校正因子可靠，适用于香气成分定量分析。 ２．２ 色谱图 图１是混合标准样品（正丙醇、乙酸正戊酯、己 酸乙酯）的气相色谱离子流色谱图。由图１可知，三 种混合标准样品的溶液离子流色谱图出峰清楚，因 此是可信的。 童 图１ 混合标准溶液离子流色谱图 Ｆｉｇ．１ Ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ 注：１：正丙醇；２：乙酸正戊酯；３：己酸乙酯。 ２．３芽孢杆菌的筛选 经稀释平板法筛选出菌株共５５株，从ＹＢ一１到 ＹＢ一５５编号后分别于斜面试管培养基中培养，然后 接种于发酵培养基中。培养后按与校正因子值测定 相同的条件下进样，测其发酵液中产生的己酸乙酯 和正丙醇含量。各菌株发酵液中测定出的己酸乙酯 含量和正丙醇含量如表２所示。 己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味物质，能较 大程度提高白酒的风味成分，正丙醇较少能够降低 因正丙醇含量过高而带来的上头、口干 。中国国 标ＧＢ／Ｔ １０７８１．１—２００６（（浓香型白酒》规定，高度优级 酒的己酸乙酯含量为１２０～２８０ ｍｇ／１００ ｍＬ。而国标 ＧＢ／Ｔ １０３４３—２００８《食用酒精》规定，特级食用酒精中 的正丙醇含量应≤２．０ ｍｇ／Ｌ。由表２可以看出， ＹＢ一１２、ＹＢ一１３和ＹＢ～１６菌株产己酸乙酯量较多，分 别为２４５．９９、２５６．６２、２３３．７０ ｍｇ／１００ ｍＬ，但ＹＢ一１２和 ＹＢ一１３产正丙醇含量也较多，分别为４．６７９２、 ３．９２３５ ｍｇ／ｌＯ０ ｍＬ，超过了优级酒中的正丙醇含量要 求。ＹＢ一１６产正丙醇含量为０．０３９２ ｒａｇ／１Ｏ０ ｍＬ，符 合优级酒对正丙醇含量的要求。此外，ＹＢ一８菌株产 的正丙醇含量（０．０３５６ ｍｇ／ｌＯＯ ｍＬ）略低于ＹＢ一１６，但 ＹＢ一８产己酸乙酯量（７６．５９ ｍｇ／１００ ｍＬ）远小于 ＹＢ一１６。因此，可选择ＹＢ一１６菌株作为本实验的目的 菌株，即高产己酸乙酯、低产正丙醇。 表２各菌株产己酸乙酯与正丙醇产量 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｅｔｈｙｌ ｈｅｘａｎｏａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｐａｎｏｌ ｙｉｅｌｄｓ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｓｔｒａｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃ＆ｏｌｏｇ￣ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ 续表 生 王程 孢，芽孢呈椭圆形，约１．０ Ｉｘｍ，位于菌体，芽孢囊 不膨大。 图２革兰氏染色（１０００ Ｘ） Ｆｉｇ．２ Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｍａｇｅ（１０００×、 图３芽孢染色（１０００ Ｘ） Ｆｉｇ．３ Ｓｐｏｒｅｓ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｍａｇｅ（１０００×） ２．５生理生化鉴定结果 该ＹＢ一１６菌株的生理生化鉴定结果如表３所 示。由表３知，甲基红实验、Ｖ．Ｐ反应、吲哚实验、淀 粉水解、明胶水解和过氧化氢酶反应均为阳性，说明 ＹＢ一１６在糖代谢过程中，具有发酵葡萄糖产酸的能 力；具有发酵葡萄糖产生乙酰四基甲醇的能力；能水 解淀粉和蛋白质；能将Ｈ：０：催化分解成Ｈ：０和０：。 参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手 册》，初步认定ＹＢ一１６为芽孢杆菌属。 ２．６ 目的菌ＤＮＡ序列的鉴定 将如图４的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列输入ＮＣＢＩ网站 （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）中，在ＮＣＢＩ数据 库中进行比对，发现目地菌株ＹＢ一１６与蜡质芽孢杆 ２．４菌株的形态观察 在普通琼脂培养基上，用低倍物镜（１０倍）观察 菌株ＹＢ一１６菌落特征为：菌落大，直径约为５ ｍｍ，表 面粗糙、扁平、不规则。在高倍镜（４０倍）下观察，该 菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）具有最高同源性达１００％。建立 系统发育树，如图５所示，观察发现，ＹＢ一１６菌株与 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＮＢＲＣ １５３０５聚为一个分支，亲 缘关系最近。查阅《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细 菌系统鉴定手册》，发现ＹＢ一１６菌株的形态特征和 生理生化特征与蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）基本 一菌株ＹＢ一１６菌体呈杆状，菌体细胞杆状，成短或长 链。革兰氏染色实验中，在油镜（１００倍）下观察，该 菌体被染成蓝紫色，证明为革兰氏阳性菌。芽孢染 色实验中，如图３所示，在油镜（１００倍）下观察，有芽 致。因．ｔｔｇ，将ＹＢ一１６号菌株鉴定为蜡质芽孢杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）。 表３生化实验鉴定结果 Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ 注：“＋”表示“有”或“阳性反应”。 生 三连 ｇｉ１６３６５５９６５４１ｒｅ￣Ｘ－５ Ｋｏ１．３８ Ｎｏ．０７ ２０１ ７ 。：一 ｇｉ１６３１２５１４３３１ｒｅｔ］ＮＲ １１２６３０ １］Ｂａｃｉｌｌｕｓ＿ｃｅｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＮＢＲＣ—．１５３０５——１６Ｓ＿ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿ＲＮＡ ｇｅｎｅ ａａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｇｉ］４８５０９９１１０１ｒｅｔ］ＮＲ－１０２５０６ １Ｉ＿Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢｔ４０７—１６Ｓ＿ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿ＲＮＡ＿ｃｏｍｐｌｅｔｅ＿ｓｅｑｕｅｎ￣ｅ ｇｉ［２１９８５６８７８￣ｅｆｌＮＲ ０２４６９７ １１ Ｂａｃｄｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ｓｒｒａｉｎ ＤＳＭ＿１１８２１＿１６ｓ＿ｒ１ｂ０ｓ。ｍ ＩＲＮＡ＿ｇ∞ ＿ｐ盯ｔｌａＬｓｅｑｕ ６３ｌ２５２７９ ｅ Ｒ １１３９９１ １１＿Ｂａｅｉｌｌｕｓ￣ｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｔｒａｉｎ＿ＮＢＲＣ一１０１２３２ １６Ｓｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ￣ｅｎｅｊｐａｔｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｉ Ｌ——————— 二二 。＿ｐａｒｔｉａｌｌｓｅｑｕ ｇｉ１６３１２５２７９２１ｒｅ１］ＮＲ ｎ３９９０ ｌＩ Ｂａｃｉｌ［ｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ＿ｓｔａｉｎ＿ＮＢＲＣｌＯ１２２８ Ｉ６ｓ＿ｎｂ０ｓ０ｍａｌＲＮＡｇｃＩｌ＿ｇ ｆ６３１２５ ｇｉｊ２２８７１６５５７￣ｅｆｌＮ ０２７５５２ ｌｌ＿Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｎｔｉｌｉａ ｓｔｒａｉｎ＿ＤＳＭ＿１ １６ｓＪ ｓｏｍａＩ—ＲＮＡ—ｇ蚰巳＿ｐ 』。ｑｕｅｎｃｅ ｇｉ［６３６５５８５２５￣ｅｆｌＮＲｊ１４５８２ ＩＩ＿Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ＿ｓｔｒａｉｎ ｃｃ一１４５７９ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ＿ＲＮＡ ｇｅｎｅ￣ａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｇｉ１６３６５５８５２４￣ｅｆｉｌｑＢ一１１４５８１ ｌｌ＿Ｂａｃｉｌｌｕｓｊｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｔｓａ３￣ＡＴＣＣ１０７９２＿】６ｓＪｂｏｓ谊ｎ ＿ＲＮＡ ｎｅ＿ｐ矾 一哪 ｎｃｅ 图５ ＹＢ一１６的系统发育树 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｅ ｔｒｅｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ ＹＢ～１６ ＡＡＧＴｔ￣ＡＡ 图４ ＹＢ一１６序列测序结果 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔ ｆｏｒ ＹＢ一１６ ３讨论与结论 蜡质芽孢杆菌在工业化社会中常被认为是食物 病源菌。它能产生一种呕吐毒素和肠毒素，主要引 发呕吐和腹泻型食物中毒 。但近年来，蜡质芽孢 杆菌也被认为是一种有益的微生物。应用微生物产 生的次生代澍产物来防治植物病害是目前生物防治 的一种主要方式，蜡质芽孢杆菌是芽孢菌属中具有 生防应用价值的拮抗细菌之一 。杨春霞、廖永红 等人对酒醅中的蜡质芽孢杆菌进行发酵风味分析， 发现其在发酵液中能形成１２种风味物质，其中含己 酸乙酯１，５４％；发酵液中含有数量较多的酯类和醛 酮类化合物，占总数的５８％；蜡质芽孢杆菌不产醚 类、含氮化合物和酸类化合物 。而本实验所筛选 的蜡质芽孢杆菌能够产生产己酸乙酯含量为 ２３３．７０ ｒａｇ／１Ｏ０ ｍＬ，符合国标高度优级酒的范围；而 正丙醇产量为０．０３９２ ｍｇ／１００ ｍＬ，符合国标特级食用 酒精的范围。 本文从浓香型白酒酿酒大曲和糟醅中富集培养 共分离出了５５株芽孢杆菌，以高产己酸乙酯和低产 正丙醇为指标，筛选出了一株能在发酵液中形成较 多己酸乙酯和较少正丙醇的芽孢杆菌，命名为 ＹＢ一１６的菌株。通过对该菌株进行形态特征观察、 生理生化特征鉴定和ＤＮＡ序列分析，将ＹＢ一１６菌株 鉴定为蜡质芽孢杆菌。该菌株所产己酸乙酯含量符合 国标高度优级酒的范围，所产正丙醇含量符合国标特 级食用酒精的范围。若将筛选的该蜡质芽孢杆菌应用 至浓香型白酒传统酿造工艺，将有利于提高浓香型白 酒的风味，并具有一定降低上头、口干的作用。 参考文献 ［１］涂向勇，姚继承．窖泥与基酒成分关系的比较研究［Ｊ］．酿 酒科技，２００９，１８５（１１）：９０—９３． ［２］姚惟琦，陈茂彬，镇迭，等．浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离 及其对模拟固态发酵的影响［Ｊ］．酿酒，２０１０，３７（３）：３７—４１． ［３］熊俐，胡洋，刘俊，等．窖泥己酸茵的分离培养与诱变选育 ［Ｊ］．四川理工学院学报：自然科学版，２０１０，２３（３）：３２４－３２７． ［４］张丽莺．窖池微生态资源库的建立、管理及菌种保藏［Ｄ］． 成都：四川大学，２００６． ［５１施安辉．浓香型白酒发酵过程窖中微生物区系的分析 【Ｊ『．酿酒，１９８６（４）：２４—２９． ［６］姚惟琦，陈茂彬，镇达，等．浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离 及其对模拟固态发酵的影响［Ｊ］．酿酒，２０１０，３７（３）：３７－４１． ［７］刘莉萌，张斌，东秀珠，等．浓香型白酒窖池中片球菌的分 离与鉴定［Ｊ］ 酿酒科技，２００７，１５２（２）：２２—２４，２８． ［８］李大和，刘念，李国红．浓香型大曲酒酿造中酯化菌研究 的现状与展望［Ｊ］。酿酒科技，２００８，１６４（２）：９２－９８． ［９］曾婷婷，章肇敏，吴生文，等．芽孢杆菌对特香型白酒风味 风格的影响研究［Ｊ］．酿酒科技，２０１２，（７）：３２－３４． ［１０］张良，沈才洪，张宿义，等．解析窖泥功能菌代谢能力的 ［Ｊ］．酿酒科技，２００８，（１）：５７—５８，６１． ［１１］雷光电，姚万春，唐玉明，等．泸州老窖窖泥中重要功能 菌群分布及代谢产物研究［Ｊ］．酿酒科技，２０１２，（１１）：５４—５７． ［１２］Ｇｅｎｏｖｅｓｅ Ａ，Ｐｉｏｍｂｉｎｏ Ｐ，Ｇａｍｂｕｔｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｒｏｎａｓａｌ ａｒｏｍａ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ａｎｄ ｒｅｄ ｗｉｎｅ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｍｏｕｔｈ ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓａｌｉｖａ Ｏ１１ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００９，ｌ１４（１）：１００—１０７． ［１３］Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｌ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ｍ［Ｊ］．，Ｍａｗｓｏｎ Ａ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｅｌ ｏｉｌｓ ｆｒｏｍ ｅｔｈａｎｏｌ／ｗａｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｉ Ｊ Ｉ．Ｊ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ ２００１，１８２：２１５－２２６． ［１４］柏永昊，张明春，缪礼鸿．芽孢杆菌对白酒发酵过程中正 丙醇含量的影响［Ｊ］．酿酒科技，２０１３，（１１）：２６—２９． ［１５］沈萍，陈向东．微生物学实验［Ｍ］．第４版．北京：高等教 育出版社，２００７． ［１６］黄思敏，刘军，朱文优，等．传统麸醋醋醅中一株芽孢杆 菌的筛选和鉴定［Ｊ］．中国调味品，２０１３，３８（５）：１８—２２． ［１７］ＲＥ布坎南，Ｎ Ｅ吉本斯．中国科学院微生物研究所《伯杰 细菌鉴定手册》翻译组译．伯杰细菌鉴定手册（第八版）［ｓ］． 北京：科学出版社，１９８４． ［１８］郑琦，邓波，关雄．酒糟和窖泥中苏云金芽孢杆菌的分离 及鉴定［Ｊ］．基因组学与应用生物学．２０１４，３３（２）：９３—２９８． ［１９］袁志明．蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）污染及其对食品 安全的影响［Ｊ］．食品科学，２００７，２８（３）：３５７—３５８． ［２０］易龙，张亚，廖晓兰，等．蜡状芽孢杆菌次生代谢产物的 研究进展［Ｊ］．农药，２０１３，５２（３）：１６２—１６４． ［２１］杨春霞，廖永红，刘峻雄，等．芽孢杆菌分离鉴定及发酵 风味分析［Ｊ］．食品工业科技，２０１２，３３（９）：７０—７４．
