专论与综述 中 国 酿造 2 7 63期小。 0 0 总第 3期 玉米赤霉烯酮生物脱毒与降解的研究进展 刘盼,蔡俊 (湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068) 摘要:玉米赤霉烯酮(ZEN)是由镰刀菌属(Fusarium.sp)产生的污染范围比较广的一种毒素,它在自然界中广泛存在。物理、化学脱 毒法成本高且对人类、动植物有一定的损害,生物法因其具有高效性、无污染且降解率高而被科学界关注。该文概述了玉米赤霉烯酮 的物理、化学和生物脱毒方法,并对脱毒后的产物进行了简要介绍,对不同降解菌株的降解机制以及降解酶基因的表达和产物毒性 进行了综述。 关键词:真菌毒素;玉米赤霉烯酮;脱毒;生物降解 中图分类号:¥859.8 文章编号:0254-5071(201 7)02—0001—05 doi.10.1188 .issn.0254-5071.2017.02.001 Research progress on biological detoxiicatfion and degradation of zearalenone LrUPan.CAI Jun (I-IubeiCollaborativeInnovationCenterforInduslrialFermentation,KeyLaboratoryofFermentationEngineenng(MinistryofEducation), CollegeofBiologicalEngineeringandF0od.Hubei UniversityofTechnology,Wuhan430068,China) Abstract:Zearalenone,a kind of toxin produced by Fusarium sp.and the wide pollution range is widespread in nature.The physical and chemical detoxilcatfion method had high cost and certain harmful to humans,animals and plants.Due to the high eficifency,non-pollution and high degradation rate,the biological method is concerned by the scientific community.The physical,chemical and biological detoxilcaftion method of zearalenone was summarized,the products after detoxiicatifon were introduced briefly,and the degradation mechanism of different degradation strains,expression ofdegrading enzyme gene and toxicity ofproducts were summarized. Key words:mycotoxin;zearalenone;detoxilfcation;bio-degradation 玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是STOB M等【l_在 给家兔口服zEN,家兔血浆中碱性磷酸酶(alkaline phos. 1962年从有赤霉病的玉米中得到的一种真菌毒素,由镰刀 菌产生,具有类雌激素性质,又称F.2毒素。1966年URRY W H等回确定了ZEN的化学结构,其化学名为6.(10.羟基.6。氧 基.十一碳烯基)/3.雷锁酸内酯,分子式为c。8H笠O ,具有内 脂结构。它的分子质量为318 u,熔点为165 oC,对热较稳 定,120℃加热4 h不被降解。ZEN不溶于水、二硫化碳和四 phatase,ALP)浓度在7~14 d大幅度升高,与此同时丙氨 酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和^y.谷氨酞 胺转移酶(^y.glutamine tansferase, .GT)的浓度也有所升 高,因此可 ̄NZEN具有肝毒性。BANJERDPONGCHAI R 等[8】通过实验验证了由zEN引起的人类白血病细胞死亡的 方式和机制。 氯化碳,但可溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、 乙酸乙醋、醇类和酸类等物质,微溶于石油醚。研究发现ZEN 的甲醇溶液在紫外光下呈现出明亮的绿.蓝色荧光圈。在自然 界中ZEN存在多种衍生物,比较常见的是o1.zearalenol和 B.zearalenol。其中仅.zearalenol的毒性是ZEN毒性的3~4 倍,但B.zearalenol的毒性要比ZEN的低 。 世界各地的谷物以及农副产品中都能检测到ZEN的 存在,王金勇等[ 调查发现中国饲料中玉米赤霉烯酮检出 率也比较高。世界大部分国家规定粮食谷物和食品中的 ZEN的含量为60~1 000 ̄g/kgtⅫ,我国饲料卫生标准规定 饲料中ZEN允许量<500 Ixg/kgt“],食品安全国家标准规定 食品中ZEN的限量标准为60 ̄g/kgt 。 玉米赤霉烯酮具有很强的生殖毒性,能够与雌激素 受体产生竞争性结合继而表现出雌激素活性。雌激素受 玉米赤霉烯酮(ZEN)是由镰刀菌属产生的污染范围 比较广的一种毒素,会进入人和动物体内产生雌激素效应 的综合症状,特别是对于雌性哺乳动物而言,会影响其乳 房发育、抑制多倍排卵,生殖周期紊乱,给种养殖业带来了 很大的损失。本文对玉米赤霉烯酮的物理、化学和生物脱 体与ZEN结合后受体构型发生改变,转移到细胞核中进一 步与染色质结合,调节基因转录和蛋白质合成这两大过 程,因此使细胞的和生长受到影响阎。CONKOVA E等17] 收稿日期:2016.09.01 基金项目:国家自然科学基金(31401807) 作者简介:刘+通讯作者:蔡盼(1992一),女,硕士研究生,研究方向为玉米赤霉烯酮的生物降解。 俊(1968-),男,教授,博士,研究方向为发酵工程。 2・加17Vo’・s柏.China Brewing Forum and Summary 毒方法,以及对脱毒后的产物进行了简要的介绍,并对不 同降解菌株的降解机制以及降解酶基因的表达和产物毒 常用的吸附剂有蒙脱石、葡聚糖、活性炭等。GIRISH C K 等㈣对火鸡分别喂养被真菌毒素污染过的玉米、没有被真 菌毒素污染过的玉米、加入了一定量葡甘聚糖后被真菌 性进行了综述。以期通过研究微生物法降解ZEN的毒性, 同时提高微生物酶在市场中的应用。 1玉米赤霉烯酮的脱毒方法 玉米赤霉烯酮的脱毒方法有很多,主要分为物理法、 化学法、微生物降解法。在进行脱毒的过程中需满足:(1) 去除玉米赤霉烯酮毒性或者使之失去活性;(2)处理过的 饲料不产生任何有毒的副产物;(3)破坏产玉米赤霉烯酮 毒素污染过的玉米,探究发现喂养被真菌毒素污染过的 玉米的火鸡体内的淋巴细胞数减少,加入了一定量葡甘 聚糖后火鸡体内被真菌毒素污染过的玉米毒素量降低, 说明葡甘聚糖可以吸附ZEN。 化学法主要包括碱处理和氧化处理。通过玉米赤霉 烯酮毒素与碱、氧化剂等的化学作用来降解谷物原料中 的ZEN。MCKENZIE K S等 在含有ZEN的水溶液中通入 质量分数为2%、10%、20%的臭氧,结果发现通入质量分数 为10%的臭氧后可在15 s内完全降解ZEN,并用高效液相 色谱法检测不到有毒的物质。 物理法成本过高,仅适合于部分食品生产过程中对 ZEN的清除,并不适合大批量的储藏过程中受ZEN污染的 粮食。化学法在添加化学试剂时会带来不确定的危害,而 且用此方法脱毒时成本也较高。微生物法是利用微生物 资源对玉米赤霉烯酮毒素进行降解,包括微生物吸附和 微生物降解两种。表1对几种方法的实施方式以及其优缺 点进行了总结。 毒素的孢子或菌丝体;(4)脱毒时不能严重破坏产品的营 养成分,保持其原有的营养价值;(5)要求考虑成本,技术 具有可操作性。 物理法降解玉米赤霉烯酮包括高温处理、辐照处理、 物理吸附等。高温处理是将被玉米赤霉烯酮污染过的粮 食、谷物等在温度约为ll0~160 oC烘烤,使能够产生ZEN 的菌被杀死,这种方法较为古老,现在已经不采用。辐照 法是指用电离辐射线辐照受污染的玉米,使菌体死亡。赵 琳等[ 3]用 .射线降解玉米粉中的ZEN,发现在辐照剂量为 50 kGy时能降解43.28%的ZEN,该降解过程符合一级反应 动力学。物理吸附法是采用毒素吸附剂来吸附ZEN,目前 表1 玉米赤霉烯酮的脱毒方法 Table 1 Detoxification methods of zearalenone 2生物法降解玉米赤霉烯酮 从20世纪6O年代起,科学家们开始用生物学的方法降 聚糖等多糖的糖苷键或肽键断裂从而使得肽聚糖结构变 薄,孔径增大,增强了菌体对真菌毒素的吸附能力[30-31]。荣 迪[32】以酵母细胞壁为原料提取JB-D_葡聚糖作为zEN一种 吸附剂,并对得到的B— 葡聚糖进行硫酸酯化改性处理, 得到另一种ZEN吸附剂,对小鼠分别喂养ZEN和这两种不 解玉米赤霉烯酮毒素。研究发现微生物在吸附和降解玉 米赤霉烯酮毒素时有重要作用,相比较物理化学法而言, 生物法由于其没有毒副作用、效率高、专一性强,因此越 来越受到学术界的关注。 同的吸附剂,结果表明,喂养这两种吸附剂的小鼠肝脏损 伤都得到缓解,且经过硫酸酯化改性处理的吸附剂对ZEN 的吸附量更大。 2.1微生物吸附玉米赤霉烯酮毒素 目前国内外研究发现,酵母细胞的细胞壁对玉米赤 霉烯酮具有吸附作用。其吸附主体主要是细胞壁上的 YIANNIKOURIS A等[33]通过建立实验模型来验证酵 母细胞壁提取物对ZEN的吸附作用,结果表明酵母细胞壁 提取物是一种有效的吸附剂,对ZEN的吸附效果达到 B.D-葡聚糖等多糖,吸附作用主要是这些多糖的疏水作 用。当对酵母细胞进行热处理或酸处理时,细胞壁上的肽 专论与综述 中 国 酿造 2017年第36卷第02期 总第300期 ● ‘ ‘ 40%。ARMANDO M R等 用不同浓度的酿酒酵母与真菌 毒素结合,实验发现不同浓度的酿酒酵母对ZEN均有一定 的吸附能力。 2I2微生物降解玉米赤霉烯酮 2.2.1玉米赤霉烯酮降解产物的毒性 研究发现一些微生物法降解玉米赤霉烯酮可得到多 种不同的产物,不同的产物结构有不同的毒性。由表2可 知,一些酵母菌、根霉菌等能使ZEN降解为毒性低于它本 身的物质或降解为无毒的物质,但当产物为 .zearalenol 时其毒性高于ZEN,这种方式的转化是不可取的。 TINYIRO S E等[35]研究表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtliis)168和纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)CICC 24640不 仅对ZEN有吸附作用同时也有降解作用,这在目前也是一 个新的发现。 表2玉米赤霉烯酮降解产物的类型 Table 2 Types of degradation products of zearalenone 2.2.2微生物酶降解玉米赤霉烯酮 目前,已发现很多微生物可以产生能降解ZEN的酶, 其中某些内酯水解酶、蛋白酶、过氧化物酶等对ZEN的降 解作用已得到国内外研究者的证实。余元善等『4 删从以ZEN 为唯一的碳源和能源的培养基上分离出一株不动杆菌 (Acinetobacter)SM04,实验初期发现不动杆菌SM04在M1 的酶解条件进行优化,使其在28℃酶解48 h(或37 oC酶解 8 h)可完全降解ZEN且产物中无B.zearalenol聚集。 通过研究能够降解ZEN的酶的结构和性质,寻找降解 ZEN酶的编码基因,并成功扩增基因片段进行活性表达, 具有很好的应用前景。ALTALHI A D等[49-50]从土壤中分离 出一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZEA.1,该菌株能够使 ZEN降解为无毒或毒性很低的物质,并从中克隆出长度约 5.5 kbp ̄.包含能降解ZEN的编码基因,并成功地将这段基 因在埃希氏肠杆菌中进行表达,表达后的产物依然能高 效降解ZEN。 培养基中可以降解ZEN,并通过人乳腺癌细胞(McF.7)增 殖实验探究到降解过程中产生了微量的过氧化物,再用 G50凝胶柱层析分离得到了能够降解ZEN的thio1.redoxin 过氧化物酶,这种过氧化物酶的基因已经得到扩增,并成 功地获得了表达,将会逐步应用于ZEN的检测和去除。 B.subtilis 168和B.nattoCICC24640在条件为30℃厌 氧培养24 h可分别降解81%和100%ZEN(20 b ̄g/mL),降解 的产物是无雌激素毒性的,经初步判断这个降解过程中 程波财等f51]将粉红螺旋聚孢霉(Gliocladium roseum) 中能够降解ZEN的蛋白酶的基因进行扩增得 ̄ljZEN-jjm 基因,通过序列比对和原核表达来确认这种蛋白酶具有降 解玉米赤霉烯酮毒素的能力。谭强来等圈构建了zEN-jjm表 达载体,用质粒pPIC9分泌表达载体,电转化至毕赤酵母 ZEN的脱羧反应与金属蛋白酶有关闭。因此金属蛋白酶在 降解ZEN时使ZEN结构发生变化也为研究人员在后续探 (Pichia pastoris)GS1 15,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术筛 选出能表达降解酶的重组酵母,并采用高效液相色谱法 证实重组酵母同样具有降解ZEN的能力。 3总结与展望 究机制提供了一种合理的思路。 内酯酶也对玉米赤霉烯酮有降解能力。JUTERMARK J 等 从粉红粘帚霉(Gliocladium Foscum)中得到一种可以 促进ZEN进行水解的内酯酶,其作用的机制是通过去碳酸 基将ZEN结构中的环形物打开,使ZEN失去毒性。 TAKAHASHI.ANDO N等【 发现了一种由粉红螺旋 聚孢霉产生的酶可降解ZEN,并得到了一种酵母重组基因 ZHDIO1,将重组基因ZHDIO1进行表达得到重组酶,由于 玉米赤霉烯酮的生殖毒性严重影响着人和动物的健 康,物理、化学法除ZEN存在着很大的弊端,微生物法去毒 效果显著具有高效性且能将ZEN降解为无毒或毒性很低 的物质,因此微生物法是最好的选择,这种去除方法也被 越来越多的科学家所关注,主要研究ZEN的结构和毒性、 微生物法降解ZEN的机制、降解产物的结构、降解酶等。 特别是微生物酶降解具有一定的市场价值。虽然能 重组酶在降解ZEN的过程中产生了大量毒性低于ZEN的 物质一B—zearalenol,因此在后续的实验中将这种重组酶 ・4・20ber la l No uu .0 ^17China Brewing Forum and Summary 够降解ZEN的酶制剂已经在生产中得到了初步应用,但是 tion and detoxification ofmycotoxins using a novel source ofozone[J]. Food Chem Toxicol,1997,35(8):807—820. 市场的需酶量远远要高于,目前微生物降解玉米赤霉烯 酮的产物分析及降解机制的分析仍然不够完善,因此为 了保障人类及动植物的健康,应该投入更多的精力去研 究关于玉米赤霉烯酮毒素的微生物降解。通过此研究可 [16]CHOI H J,AN T J,l(IM J,et a1.Postharvest strategies for deoxyni— valenol and zearalenone reduction in stored adlay(Cob:lachryma-jobi L) raigns[J].J Food Prot,2014,77(3):466—471. [17]YUKSEL C,BULLERMAN L B.Evaluation of reduced toxicity of zearalenone by extrusion processing as measured by the MTT cell pro— 以提取出具有吸附作用的有效成分结合益生菌制出脱毒 剂,也可将能够降解ZEN的酶分离纯化后得到酶制剂以此 liferation assay[J].J Agr Food Chem 2005,53(16):6558—6563. 降低zEN在日常生活中的毒性危害。 参考文献: [1]STOB M,BALDWIN R s,TUITE J,et a1.Isolation of an anabolic, uterotrophic compound from cowl infected with Gibberella zeae[J].Na- ture,1962,196(4861):1318. [2]URRY W H,WEHRMEISTER H L,HODGE E B,et a1.The structure of zearalenone[J].Tetrahedron Lett,1966,7(27):3 109—3 1 14. [3]CHENG F Y,HAN M S,ONG C N.Intracellular thiol depletion causes mitochondrial permeability transition in ebselen—induced apoptosis[J]. 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