实验一 培养基的制备和灭菌

实验一 培养基的制备和灭菌

培养基的制备

一、 实验目的

1. 了解配制培养基的原理和熟悉常用培养基的名称。

2. 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、 实验原理

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配置而成的一种混和营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。

微生物的生长繁殖除需一定的营养物质以外，还要求适当的pH范围。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基是中性或偏碱性的。所以配制培养基时，都要根据不同微生物对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到合适的范围。但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌后，在调整pH。

此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，此外，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基的酸碱度而带来的不利影响。

以牛肉膏蛋白胨培养为例，牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

牛肉膏蛋白胨培养配方： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15－20g 水 1000ml pH 7.4－7.4 三、实验器材

1、 溶液或试剂 营养肉汤培养基，麦芽汁培养基

2、 仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，药匙，高

压蒸汽灭菌锅，胶塞，纱布，报纸，棉绳，记号笔，电炉等。 四、操作步骤

1. 称量：按照培养基配方，准确称取各成分放入烧杯中。有些原料用量少，不易称量，

可先配成高浓度溶液，再按比例换算后，取一定量加入烧杯中。

2. 溶化 ：加入所需要的水量搅匀，然后加热使其溶解。有些原料不易溶解，如蛋白胨、

牛肉膏等，可先在小容器中加水少许，加热溶解后倒入烧杯中。配制固体培养基时，在琼脂熔化过程中要不断搅拌，并控制火力，防止培养基溢出或烧焦。当培养基完全熔化

后要补足水分。

3. 分装：根据需要将培养基分装各种不同的容器中。固体培养基都要趁热分装，各容器的量如下：

三角瓶：一般不超过1/2；试管：视需要而定，若制斜面一般装管高的1/5或1/4；倒平板一般是用时再倒。分装时应避免培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞而引起污染。 4. 加塞 ：用合适的胶塞塞好

5. 包扎：加塞后，用报纸（或牛皮纸）包 好，再用棉绳捆绑好。然后标明培养基的名称，

组别以及日期 6. 灭菌

7. 搁置斜面 8. 无菌检查 五、实验报告：

高压蒸汽灭菌

一、目的要求

1. 了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围 2. 学习高压蒸汽灭菌的操作方法 二、基本原理

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，是灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效果。

在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于冷空气的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 三、操作步骤

1. 首先将内层锅桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 2. 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。 3. 加盖，并将盖上的排气软管插入内层桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧

相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4. 加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排除后，

关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

5. 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降为0

时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 6. 将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

思考题

1. 培养基应具备哪些条件?

1. 在培养基配制操作过程中应注意什么问题?为什么?

2. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?

3. 培养不同种类微生物能否用同一种培养基?为什么?细菌、酵母菌、霉菌通常用什么培养

基培养？

4. 高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压?高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌锅内的

冷空气排尽?灭菌完毕后什么情况下才可以开锅盖取出灭菌物品? 5. 玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥?

6. 对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力，多长时间

灭菌为宜?