*CN102649967A*
(10)申请公布号 CN 102649967 A(43)申请公布日 2012.08.29
(12)发明专利申请
(21)申请号 201210177083.2(22)申请日 2012.05.31
(71)申请人中国农业大学
地址100193 北京市海淀区圆明园西路2号(72)发明人王琦 汝津江 李燕
(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人关畅(51)Int.Cl.
C12N 15/75(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/125(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 9 页权利要求书1页 说明书9页序列表 2 页 附图 3 页序列表2页 附图3页
(54)发明名称
一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法(57)摘要
本发明公开了转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。本发明提供的方法包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；所述制备感受态细胞依次包括如下步骤：（1）将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基，使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为1.8×107-7.7×107CFU/mL，35-37℃振荡培养2-3.5h；（2)将1体积份完成步骤(1)的培养体系与0.8-1.2体积份诱导培养基混匀，35-37℃振荡培养1.5-3.5h；所述电击转化包括如下步骤：将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，然后采用1.2-1.8kV的电压进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。本发明提供的方法，转化效果好，操作简便。CN 102649967 ACN 102649967 A
权 利 要 求 书
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1.一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；所述制备感受态细胞依次包括如下步骤：（1）将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基，使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为1.8×107-7.7×107CFU/mL，35-37℃振荡培养2-3.5h；所述生长培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8-2.2g/L、磷酸氢二钾14-16g/L、柠檬酸三钠1.5-2.5g/L、硫酸镁0.09-0.1g/L、葡萄糖4.8-5.2g/L和酪蛋白水解物0.18-0.22g/L；
（2)将1体积份完成步骤(1)的培养体系与0.8-1.2体积份诱导培养基混匀，35-37℃振荡培养1.5-3.5h；所述诱导培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8-2.2g/L、磷酸氢二钾14-16g/L、柠檬酸三钠1.5-2.5g/L、硫酸镁0.09-0.1g/L和葡萄糖4.8-5.2g/L；
所述电击转化包括如下步骤：将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，然后采用1.2-1.8kV的电压进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比为：100ng-5μg所述待转化质粒：0.2×109CFU-0.49×109CFU感受态细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述制备感受态细胞还包括如下步骤（3）：将完成所述步骤（2）的培养体系冰浴30min，然后4℃离心收集细胞。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述电击转化中，所述冰浴的时间为30min。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述电击转化中，所述电击的电阻为200Ω、电容为25μF。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述电击转化还包括在所述电击后进行如下处理的步骤：向电击杯中加入700-1000μL 30-37℃预热的LB液体培养基并混匀，然后30-37℃振荡培养3h。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述待转化的质粒为穿梭载体pBE2、穿梭载体pS4GFP或穿梭载体pMarA。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述野生型枯草芽孢杆菌为未经过遗传工程改造的枯草芽孢杆菌。
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说 明 书
一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法
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技术领域
[0001]
本发明涉及细菌转化领域，具体的涉及一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于自然界中，很多植物内生和土
壤习居枯草芽孢杆菌是潜在的植物病害生物防治因子，建立相应转化体系是对菌株进行荧光标记以原位监测其定殖、分布规律的前提。转化是指细菌摄取外界环境中DNA的过程，细菌能够通过自然转化适应复杂的外界环境，转化的发生可能会造成基因克隆、突变体产生和基因图谱等现象。
[0003] 枯草芽孢杆菌转化机制研究表明，细胞感应外界信号后经过一系列调控途径诱导感受态形成因子ComK的产生，ComK再调控一系列后期感受态形成基因（late competence genes）表达，这些基因编码细胞膜上识别并接受外源DNA的复合体和胞内保护酶等产物，目前所有转化的发生都需要细胞处于感受状态，这样才可能转化成功，因此制备性能良好的感受态细胞是实现枯草芽孢杆菌转化的关键步骤。
[0004] 传统转化方法很难在实验室条件下实现野生型枯草芽孢杆菌的人工转化，许多已经成功转化的菌株是经过遗传改良或是适应了实验室条件的菌株。对于野生型枯草芽孢杆菌人工转化来说，现有的方法主要是自然转化法、原生质体转化法和传统电击转化法等。自然转化法操作简单，但成功率极低，该方法中的培养基诱导细胞进入感受状态这一步十分关键，加入质粒后发生自然转化的概率很低。原生质体转化法转化率相对较高，但步骤繁琐，加入溶菌酶的量及处理时间、聚乙二醇（PEG）的处理方法及处理时间、细胞壁的再生及转化子筛选等步骤非常关键，很难把握。传统电击转化法使用较多，操作相对简便，但转化效率不高，电压（电容与电阻的设置）和时间常数是关键参数。
[0002]
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种转化野生型枯草芽孢杆菌的方法。[0006] 本发明提供的转化野生型枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；
[0007] 所述制备感受态细胞依次包括如下步骤：[0008] （1）将野生型枯草芽孢杆菌接种至生长培养基，使野生型枯草芽孢杆菌的初始浓度为1.8×107-7.7×107cfu/mL（如1.8×107-5×107CFU/mL或5×107-7.7×107CFU/mL），35-37℃（如35-36℃或36-37℃）振荡培养2-3.5h（如2-3h或3-3.5h）；所述生长培养基的溶剂为水（如双蒸水），溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8-2.2g/L（如1.8-2g/L或2-2.2g/L）、磷酸氢二钾14-16g/L（如14-14.8g/L或14.8-16g/L）、柠檬酸三钠1.5-2.5g/L（如1.5-1.9g/L或1.9-2.5g/L）、硫酸镁0.09-0.1g/L（如0.09-0.098g/L或0.098-0.1g/L）、葡萄糖4.8-5.2g/L（如4.8-5g/L或5-5.2g/L）和酪蛋白水解物0.18-0.22g/L（如0.18-0.2g/L或0.2-0.22g/L）；
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说 明 书
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[0009] （2)将1体积份完成步骤(1)的培养体系与0.8-1.2体积份（如0.8-1体积份或
1-1.2体积份）诱导培养基混匀，35-37℃（如35-36℃或36-37℃）振荡培养1.5-3.5h（如1.5-3h或3-3.5h）；所述诱导培养基的溶剂为水（如双蒸水），溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8-2.2g/L（如1.8-2g/L或2-2.2g/L）、磷酸氢二钾14-16g/L（如14-14.8g/L或14.8-16g/L）、柠檬酸三钠1.5-2.5g/L（如1.5-1.9g/L或1.9-2.5g/L）、硫酸镁0.09-0.1g/L（如0.09-0.098g/L或0.098-0.1g/L）和葡萄糖4.8-5.2g/L（如4.8-5g/L或5-5.2g/L）；[0010] 所述电击转化包括如下步骤：将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，然后采用1.2-1.8kV（如1.2-1.5kV或1.5-1.8kV）的电压进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。
[0011] 所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比为：100ng-5μg（如100ng-2μg或2-5μg）所述待转化质粒：0.2×109CFU-0.49×109CFU（如0.2×109CFU-0.31×109CFU或0.31×109CFU-0.49×109CFU）感受态细胞。[0012] 所述制备感受态细胞还包括如下步骤（3）：将完成所述步骤（2）的培养体系冰浴30min，然后4℃离心收集细胞。
[0013] 所述离心的条件具体可为：5000r/min离心10min。[0014] 所述制备感受态细胞还包括如下步骤：完成所述步骤（3）后，依次用4℃预冷的双蒸水和4℃预冷的HEPES缓冲液清洗所述细胞，然后用4℃预冷HEPES甘油缓冲液重悬细胞，即为感受态细胞。[0015] HEPES缓冲液（1mM，pH7.0）的制备方法：将0.238g HEPES用双蒸水溶解并定容至1L。
[0016] HEPES甘油缓冲液（1mM，pH7.0）的制备方法：将0.238g HEPES固体粉末、100mL甘油和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L。[0017] 所述电击转化中，所述冰浴的时间具体可为30min。[0018] 所述电击转化中，所述电击的电阻具体可为200Ω、电容具体可为25μF。[0019] 所述电击转化还包括所述在电击后进行如下处理的步骤：向电击杯中加入700-1000μL（如700-800μL或800-1000μL）30-37℃预热的LB液体培养基并混匀，然后30-37℃振荡培养3h。[0020] LB液体培养基（pH7.2）的制备方法：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L。
[0021] 所述待转化的质粒具体可为穿梭载体pBE2、穿梭载体pS4GFP或穿梭载体pMarA。[0022] 所述野生型枯草芽孢杆菌可为未经过遗传工程改造的枯草芽孢杆菌。所述枯草芽孢杆菌具体可为枯草芽孢杆菌9407。
[0023] 以上任一所述的振荡具体可采用如下条件：150-220r/min，如150-180r/min或180-220r/min。所述振荡的半径具体可为12mm。
[0024] 枯草芽孢杆菌在指数生长后期会有约10-20%的细胞进入感受态，尤其在营养贫乏的培养基中易形成感受态细胞，例如以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基。本发明针对常规枯草芽孢杆菌转化方法用于野生型枯草芽孢杆菌时所存在的操作繁琐、成功率低、周期长、转化效率低等问题，提供了一种简便易行的野生型枯草芽孢杆菌快速转化新方法，该方法依托枯草芽孢杆菌的自然转化原理，思路清晰，操作简便，转化效果好，为对菌株进行
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荧光标记以原位监测其定殖、分布规律奠定了基础，为进一步的遗传操作打下基础。本发明可在野生型枯草芽孢杆菌转化上应用，前景广阔。附图说明
图1为穿梭载体pBE2的结构示意图。
[0026] 图2为实施例1中的EcoR Ⅰ单酶切鉴定结果；1为穿梭载体pBE2（阳性对照），2和3分别为从两个不同纯培养菌株中提取的质粒，M为1kb DNA ladder。[0027] 图3为穿梭载体pMarA的结构示意图。
[0028] 图4为实施例2中的Pst Ⅰ,Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ单酶切鉴定结果；3、6、9为穿梭载体pMarA（阳性对照），1、4、7为某个待验证质粒，2、5、8为双蒸水（空白对照），M为1kb DNA ladder。
[0029] 图5为实施例3中的荧光显微镜观察结果。
[0030] 图6为实施例3中的EcoR Ⅰ单酶切和EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定结果；1、4为载体pS4GFP（阳性对照），2和5为一个待测质粒，2为单酶切鉴定，4为双酶切鉴定，3和6为另个一待测质粒，3为单酶切鉴定，6为双酶切鉴定，M为1kb DNA ladder。
[0025]
具体实施方式
[0031] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本专利中的“h”均代表小时。本专利中的“min”均代表分钟。[0032] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）9407：由中国农业大学植物病害生物防治与微生态学实验室分离并保存，公众可从中国农业大学获得；参考文献：张圆圆,付学池,陈欣怡,王琦.芽孢杆菌生防制剂对苹果病害的防治.植物病理学报.2011.41(ZK):135-140。
[0033] 穿梭载体pBE2（结构示意图见图1）：公众可从中国农业大学获得；参考文献：田涛,亓雪晨,王琦,梅汝鸿.芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小麦体表定殖的初探.植物病理学报.2004.34(4):346-351。[0034] 穿梭载体pS4GFP（芽孢杆菌与大肠杆菌穿梭载体，是在pGFP4412质粒基础上改造得到的，pGFP4412质粒是在穿梭载体pBE2基础上改造得到的）：公众可从中国农业大学获得；参考文献：范晓静,邱思鑫,吴小平,洪永聪,蔡学清,胡方平.绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌.应用与环境生物学报.2007.13(4):530-534。[0035] 穿梭载体pMarA（芽孢杆菌与大肠杆菌穿梭载体，结构示意图见图3）：公众可从中国农业大学获得；参考文献：Yoann Le Breton,Nrusingh Prasad Mohapatra,W.G.Haldenwang.In Vivo Random Mutagenesis of Bacillus subtilis by Use of TnYLB-1，a mariner-Based Transposon.Applied and Environmental Microbiology.2006.72(1):327-333.。
[0036] LB液体培养基（pH7.2）的制备方法：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L；121℃高温灭菌20min。
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LB固体培养基（pH7.2）的制备方法：将10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、
15g琼脂粉和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L；121℃高温灭菌20min。[0038] 5×无机盐母液（pH7.0）的制备方法：将10g硫酸铵、74g磷酸氢二钾、9.5g柠檬酸三钠和1.0g七水合硫酸镁用双蒸水溶解并定容至1L；121℃高温灭菌20min。[0039] 20%葡萄糖溶液的制备方法：将20g葡萄糖用双蒸水溶解并定容至100mL；用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。
[0040] 2%酪蛋白水解物溶液的制备方法：将2g酪蛋白水解物（Casamino acids）用双蒸水溶解并定容至100mL，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。[0041] HEPES缓冲液（1mM，pH7.0）的制备方法：将0.238g HEPES用双蒸水溶解并定容至1L；用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，保存于4℃。[0042] HEPES甘油缓冲液（1mM，pH7.0）的制备方法：将0.238g HEPES固体粉末、100mL甘油和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L；用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，保存于4℃。[0043] 实施例1、野生型枯草芽孢杆菌的转化[0044] 一、生长培养基和诱导培养基的制备[0045] 生长培养基（1L）的制备方法：将5×无机盐母液、20%葡萄糖溶液、2%酪蛋白水解物溶液和双蒸水混合，得到生长培养基；生长培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下：硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾14.8g/L、柠檬酸三钠1.9g/L、硫酸镁0.098g/L、葡萄糖5g/L、酪蛋白水解物0.2g/L。[0046] 诱导培养基（1L）的制备方法：将5×无机盐母液、20%葡萄糖溶液和双蒸水混合，得到诱导培养基；诱导培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下：硫酸铵2g/L、磷酸氢二钾14.8g/L、柠檬酸三钠1.9g/L、硫酸镁0.098g/L、葡萄糖5g/L。[0047] 二、感受态细胞的制备[0048] 1、取出-80℃冰箱中保存的枯草芽孢杆菌9407，在LB固体培养基上活化。[0049] 2、用灭菌牙签挑取活化后的单菌落，接种于5mL生长培养基中，37℃、180r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）10h。[0050] 3、取2mL步骤2的菌液接种于15mL生长培养基中（枯草芽孢杆菌9407的初始浓度为5×107CFU/mL），37℃、180r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3h。
[0051] 4、将1体积份完成步骤3的培养体系与1体积份诱导培养基混匀，37℃、180r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）1.5h。5、将完成步骤4的培养体系冰浴30min，然后加入4℃预冷的50mL离心管中，4℃、5000r/min离心（离心半径为7.07cm，仪器型号为Himac CR22e,日本Hitachi公司产品）10min，弃上清，收集细胞。[0053] 6、用30mL 4℃预冷的双蒸水通过移液枪吸吐清洗步骤5得到的细胞，4℃、5000r/min离心（离心半径为7.07cm，仪器型号为Himac CR22e,日本Hitachi公司产品）10min，弃上清，收集细胞。[0054] 7、用30mL 4℃预冷的双蒸水通过移液枪吸吐清洗步骤6得到的细胞，4℃、5000r/min离心（离心半径为7.07cm，仪器型号为Himac CR22e,日本Hitachi公司产品）10min，弃上清，收集细胞。
[0052]
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8、用4℃预冷的30mL HEPES缓冲液通过移液枪吸吐清洗步骤7得到的细胞，4℃、
5000r/min离心（离心半径为7.07cm，仪器型号为Himac CR22e,日本Hitachi公司产品）10min，弃上清，收集细胞。[0056] 9、用2mL 4℃预冷的HEPES甘油缓冲液重悬步骤8得到的细胞，分装于4℃预冷的1.5mL离心管（200μL/管）后立刻投入液氮中速冷。每管含有约0.31×109CFU感受态细胞。
[0057] 上述步骤5至9均在冰上进行。[0058] 三、电击转化[0059] 1、取5μg穿梭载体pBE2，加入1管步骤二得到的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使穿梭载体pBE2和感受态细胞充分混匀，冰浴30min。[0060] 2、将完成步骤1的体系转移至冰上预冷的电击杯中（2mm），用BioRad Gene PulserXcell电穿孔仪进行脉冲电击（电阻200Ω，电容25μF，电压1.2kV）。[0061] 3、完成步骤2后，立即向电击杯中加入800μL 37℃预热的LB液体培养基，通过移液枪轻微吐吸混匀。[0062] 4、完成步骤3后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，37℃、150r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3h。[0063] 5、将完成步骤4的培养体系涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃静置培养。[0064] 四、转化效果的验证[0065] 1、随机挑取步骤三的平板上生长的形态与枯草芽孢杆菌9407相近的单菌落，在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上进行纯化培养，共获得8株纯培养的菌株。[0066] 2、将步骤2得到的纯培养的菌株在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）过夜。[0067] 3、取完成步骤2的培养体系，一部分提取基因组DNA并鉴定16S rDNA片段（采用63F和1387R组成的引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序；63F:5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R:5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’），另一部分提取质粒并用限制性内切酶EcoR Ⅰ进行单酶切鉴定，如果16S rDNA片段测序与枯草芽孢杆菌9407的16S rDNA片段序列（如序列表的序列1所示）一致且EcoR Ⅰ单酶切鉴定结果与穿梭载体pBE2的EcoR Ⅰ单酶切鉴定结果一致，则该菌株为成功将穿梭载体pBE2导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌。部分EcoR Ⅰ单酶切结果见图2。
[0068] 步骤1获得的8株纯培养菌株均为成功将穿梭载体pBE2导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌，转化效率为100%。[0069] 实施例2、野生型枯草芽孢杆菌的转化[0070] 一、生长培养基和诱导培养基的制备[0071] 生长培养基（1L）的制备方法：将5×无机盐母液、20%葡萄糖溶液、2%酪蛋白水解物溶液和双蒸水混合，得到生长培养基；生长培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8g/L、磷酸氢二钾14g/L、柠檬酸三钠1.5g/L、硫酸镁0.09g/L、葡萄糖4.8g/L、酪蛋白水解物0.18g/L。[0072] 诱导培养基（1L）的制备方法：将5×无机盐母液、20%葡萄糖溶液和双蒸水混合，
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得到诱导培养基；诱导培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下：硫酸铵1.8g/L、磷酸氢二钾14g/L、柠檬酸三钠1.5g/L、硫酸镁0.09g/L、葡萄糖4.8g/L。[0073] 二、感受态细胞的制备[0074] 1、同实施例1的步骤二的1。[0075] 2、用灭菌牙签挑取活化后的单菌落，接种于5mL生长培养基中，30℃、150r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）8h。[0076] 3、取2mL步骤2的菌液接种于15mL生长培养基中（枯草芽孢杆菌9407的初始浓度为1.8×107CFU/mL），35℃、150r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）2h。
[0077] 4、将1体积份完成步骤3的培养体系与1.2体积份诱导培养基混匀，35℃、150r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3.5h。[0078] 5、同实施例1的步骤二的5。[0079] 6、同实施例1的步骤二的6。[0080] 7、同实施例1的步骤二的7。[0081] 8、同实施例1的步骤二的8。[0082] 9、同实施例1的步骤二的9。每管含有约0.2×109CFU感受态细胞。[0083] 上述步骤5至9均在冰上进行。[0084] 三、电击转化[0085] 1、取2μg穿梭载体pMarA，加入1管步骤二得到的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使穿梭载体pMarA和感受态细胞充分混匀，冰浴30min。[0086] 2、将完成步骤1的体系转移至冰上预冷的电击杯中（2mm），用BioRad Gene Pulser Xcell电穿孔仪进行脉冲电击（电阻200Ω，电容25μF，电压1.8kV）。[0087] 3、完成步骤2后，立即向电击杯中加入700μL 30℃预热的LB液体培养基，通过移液枪轻微吐吸混匀。[0088] 4、完成步骤3后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，30℃、150r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3h。[0089] 5、将完成步骤4的培养体系涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，30℃静置培养。[0090] 四、转化效果的验证[0091] 1、随机挑取步骤三的平板上生长的形态与枯草芽孢杆菌9407相近的单菌落，在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上进行纯化培养，共获得8株纯培养的菌株。[0092] 2、将步骤2得到的纯培养的菌株在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）过夜。[0093] 3、取完成步骤2的培养体系，一部分提取基因组DNA并鉴定16S rDNA片段（采用63F和1387R组成的引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序；63F:5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R:5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’），另一部分提取质粒并分别用限制性内切酶Pst Ⅰ、KpnⅠ和EcoR Ⅰ进行单酶切鉴定，如果16SrDNA片段测序与枯草芽孢杆菌9407的16S rDNA片段序列（如序列表的序列1所示）一致且Pst Ⅰ、Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ单酶切鉴定结果均与穿梭载体pMarA的Pst Ⅰ、Kppn Ⅰ和EcoR Ⅰ单酶
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切鉴定结果一致，则该菌株为成功将穿梭载体pMarA导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌。某个质粒的Pst Ⅰ、Kppn Ⅰ和EcoR Ⅰ单酶切结果见图4。[0094] 步骤1获得的8株纯培养菌株中，6株为成功将穿梭载体pMarA导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌，转化效率为75%。[0095] 实施例3、野生型枯草芽孢杆菌的转化[0096] 一、生长培养基和诱导培养基的制备[0097] 生长培养基（1L）的制备方法：将5×无机盐母液、20%葡萄糖溶液、2%酪蛋白水解物溶液和双蒸水混合，得到生长培养基；生长培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下：硫酸铵2.2g/L、磷酸氢二钾16g/L、柠檬酸三钠2.5g/L、硫酸镁0.1g/L、葡萄糖5.2g/L、酪蛋白水解物0.22g/L。[0098] 诱导培养基（1L）的制备方法：将5×无机盐母液、20%葡萄糖溶液和双蒸水混合，得到诱导培养基；诱导培养基的溶剂为双蒸水，溶质及其浓度如下：硫酸铵2.2g/L、磷酸氢二钾16g/L、柠檬酸三钠2.5g/L、硫酸镁0.1g/L、葡萄糖5.2g/L。[0099] 二、感受态细胞的制备[0100] 1、同实施例1的步骤二的1。2、用灭菌牙签挑取活化后的单菌落，接种于5mL生长培养基中，37℃、220r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）12h。[0102] 3、取2mL步骤2的菌液接种于15mL生长培养基中（枯草芽孢杆菌9407的初始浓度为7.7×107CFU/mL），36℃、220r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3.5h。
[0103] 4、将1体积份完成步骤3的培养体系与0.8体积份诱导培养基混匀，36℃、220r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3h。[0104] 5、同实施例1的步骤二的5。[0105] 6、同实施例1的步骤二的6。[0106] 7、同实施例1的步骤二的7。[0107] 8、同实施例1的步骤二的8。[0108] 9、同实施例1的步骤二的9。每管含有约0.49×109CFU感受态细胞。[0109] 上述步骤5至9均在冰上进行。[0110] 三、电击转化[0111] 1、取100ng穿梭载体pS4GFP，加入1管步骤二得到的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使穿梭载体pS4GFP和感受态细胞充分混匀，冰浴30min。[0112] 2、将完成步骤1的体系转移至冰上预冷的电击杯中（2mm），用BioRad Gene Pulser Xcell电穿孔仪进行脉冲电击（电阻200Ω，电容25μF，电压1.5kV）。[0113] 3、完成步骤2后，立即向电击杯中加入1000μL 37℃预热的LB液体培养基，通过移液枪轻微吐吸混匀。[0114] 4、完成步骤3后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，37℃、150r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3h。
[0101] [0115]
5、将完成步骤4的培养体系涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃静置培养。
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四、转化效果的验证
[0117] 1、随机挑取步骤三的平板上生长的形态与枯草芽孢杆菌9407相近的单菌落，在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上进行纯化培养，共获得16株纯培养的菌株。[0118] 2、将纯培养的菌株进行荧光显微镜检测，能发出绿色荧光的菌株为阳性菌株，共获得12株阳性菌株，部分结果见图5，能观察到菌株发出较强的荧光。3、取步骤2得到的阳性菌株，在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）过夜。[0120] 4、取完成步骤3的培养体系，一部分提取基因组DNA并鉴定16S rDNA片段（采用63F和1387R组成的引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序；63F:5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R:5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’），另一部分提取质粒并分别进行EcoR Ⅰ单酶切和EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定，如果16S rDNA片段测序与枯草芽孢杆菌9407的16S rDNA片段序列（如序列表的序列1所示）一致且EcoR Ⅰ单酶切和EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定结果均与穿梭载体pS4GFP的EcoR Ⅰ单酶切和EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定结果一致，则该菌株为成功将穿梭载体pS4GFP导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌。部分质粒的EcoR Ⅰ单酶切和EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切结果见图6。
[0121] 步骤1获得的16株纯培养菌株中12株为成功将穿梭载体pS4GFP导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌，转化效率为75%(注：12株荧光显微镜下能发出绿色荧光的纯培养菌株全部鉴定为目标重组菌)。[0122] 对比例1、野生型枯草芽孢杆菌的转化[0123] 一、生长培养基和诱导培养基的制备[0124] 同实施例1的步骤一。[0125] 二、感受态细胞的制备[0126] 同实施例1的步骤二。[0127] 三、电击转化
[0128] 分别采用1.0kV和2.0kV的电压，其它均同实施例1的步骤三。[0129] 四、转化效果的验证[0130] 同实施例1的步骤四。[0131] 采用1.0kV的电压时，步骤1获得5株纯培养菌株，其中只有1株为成功将穿梭载体pBE2导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌，转化效率为20%。
[0119]
采用2.0kV的电压时，步骤1获得5株纯培养菌株，其中只有1株为成功将穿梭载体pBE2导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌，转化效率为20%。[0133] 对比例2、野生型枯草芽孢杆菌的转化[0134] 一、生长培养基和诱导培养基的制备[0135] 同实施例1的步骤一。[0136] 二、感受态细胞的制备[0137] 同实施例1的步骤二。[0138] 三、转化[0139] 1、取5μg穿梭载体pBE2，加入1管步骤二得到的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使pBE2质粒和感受态细胞充分混匀，冰浴30min。
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2、完成步骤1后，将步骤1的体系转移至冰上预冷的电击杯中（2mm），立即向电击
杯中加入800μL 37℃预热的LB液体培养基，通过移液枪轻微吐吸混匀。[0141] 3、完成步骤2后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，37℃、150r/min振荡培养（振荡半径为12mm，仪器型号为QDZ5-HZS-H）3h。[0142] 4、将完成步骤3的培养体系涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃静置培养。[0143] 四、转化效果的验证[0144] 同实施例1的步骤四。
[0145] 步骤1没有获得任何纯培养菌株，没有成功将穿梭载体pBE2导入枯草芽孢杆菌9407的重组菌，转化效率为0%。
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