实时荧光定量PCR技术简介

5.1 PCR技术从定性到定量的飞跃

1985年Kary Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），并因此于1993年获得了诺贝尔化学奖。从1985年至今的20多年里，PCR技术得到了飞速的发展。

传统的PCR技术主要是对扩增产物进行定性判断，产物检测在反应结束后进行。一般通过电泳、溴化乙锭染色和紫外灯下检测等步骤判断产物是否存在，并通过与已知片断大小和含量的标准的对照，大致估测产物的大小及生成量。

从20世纪90年代初开始，许多实验室开始致力于相对准确的定量PCR技术的研究。在这一过程中，应用较多的是半定量PCR（semi-quantitative PCR）技术。半定量PCR技术是在扩增靶序列的同时，选定一对照序列（通常是管家基因）进行扩增，在PCR过程的指数增长期终止反应，再通过电泳比较目的基因和管家基因的产物相对量，从而得到起始模板在量的差异。半定量PCR技术的准确性主要受2个环节的影响，一是必须确保PCR是在扩增的指数增长即线性阶段结束，因为只有在此阶段PCR的产物量才与起始模板量有对应关系；二是检测要通过常规的电泳方法进行，人为误差的因素将会影响这种定量的准确度。

为了提高定量的准确性，人们开始设想在PCR过程中加入荧光物质，这一物质会参与到第一轮PCR循环中，随着循环的进行和产物的增加，检测到的荧光物质也在发生变化，从而通过对荧光物质的检测进而全程监控PCR进程，最终可以计算出初始的模板量。1993年，Higuchi等[31]人将这一通过荧光物质定量PCR模板量的设想付诸实现。随着荧光检测PCR仪的商品化，实时荧光定量PCR进入了一个特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应和由计算机软件进行快速统计的全新时代，实现了PCR从定性或半定量到准确定量的飞跃，目前已经成为分子生物学研究中的重要工具。

5.2 实时荧光定量PCR原理

所谓的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR），就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析 。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR的进行，反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 图1-3) 。

图1-3 实时荧光扩增曲线

Fig. 1-3 The amplifying curve of fluorescence

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量无法计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）。

图1-4 荧光定量标准曲线

Fig. 1-4 The standard curve for real-time quantification

CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值（图1-4）。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

5.3 荧光探针和荧光染料

实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。 5.3.1 SYBR Green I

SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步[32]（图1-5）。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光

染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产物可以与多个分子染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响，由解链熔解曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。

图1-5 SYBR Green I工作原理

Fig. 1-5 The principle of SYBR Green I function

5.3.2 分子信标（molecular beacon）

分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针

[33]

。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧

靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于“黑色”淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信

标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图1-6）。

5.3.3 TaqMan探针

TaqMan探针是多人拥有的专利技术[34, 35]。TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTM II

图1-6 分子信标工作原理

Fig. 1-6 The principle of molecular beacon function

DNA 聚合酶。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系（图1-7）。

5.3.4 LUX Primers

LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板

图1-7 TaqMan探针工作原理

Fig. 1-7 The principle of TaqMan probe function

的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。 5.4 实时荧光PCR 的定量方法

实时荧光定量PCR自出现以来就被迅速应用于致病微生物的检测中，与常规PCR 相比，其主要优点就是可以实现准确定量。在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知模板的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。 5.4.1 绝对定量

实时荧光PCR对样本的绝对定量是通过标准曲线法来实现的，此方法要预先知道标准品的浓度。质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中定出样品的拷贝数。做好标准曲线至关重要，应注意以下几点：要选择纯化的DNA或RNA，理想的标准品应与样本具有高度同源性, 至少要选择5个稀释度的标准品, 涵盖待测样本中目的基因拷贝数可能出现的浓度范围；由于标准品要经过几个浓度梯度的稀释，因此准确地加样非常重要；制备标准品时，要考虑标准品的稳定性，特别是对RNA而言；最好将稀释好的样品小体积分装，置于- 80℃，每份样品只用一次；由于无法对反转录的效率进行有效控制, 因此一般而言, 在进行RNA的绝对定量时, 不使用DNA样品作为标准品。 5.4.2 标准曲线法的相对定量

此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样品的量来自于相对标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基因是1×的样本，其他的样本为参照基因的n倍。使用本方法进行定量时需要注意，在试验中为了标准化加入反应体系中的DNA或RNA的量，通常在反应中同时扩增一内参基因，Freeman等推荐使用内源性管家基因（house keeping

gene）作为内参。管家基因的作用主要有：①用于目的基因拷贝数的比较； ②作为内参补偿待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因损失，以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的抑制因素；③参照物标准化。由于管家基因在各种组织中的恒定表达, 所以可用管家基因的量来作为标准，以比较来源不同样本的目的基因表达量的差异，此即相对定量。通常选用的管家基因有GAPDH、β-actin、β-微球蛋白和rRNA 等[36, 37]。 5.4.3 比较CT值的相对定量法

ΔCT 值法，该方法是同时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的基因片段，一般是一个内源性管家基因片段。这两个扩增反应可在2个反应管中分别进行， 也可在同一反应管中进行，测得两者的CT值之差，即ΔCT。比较不同待测标本DNA 的ΔCT值与正常标本DNA的ΔCT值的变化，即可对未知标本靶基因的原始拷贝数作出判断, 从而对病理状态进行判断或诊断。Sangkitporn等运用这一方法区分了东南亚型地中海贫血杂合子与纯合子。 5.5 实时荧光定量PCR的应用 5.5.1 环境监测

水资源及居家、办公环境质量报告中很重要的一项指标就是微生物含量是否超标，若不能及时有效的对微生物的含量进行监测，将对人体造成潜在的威胁。应用实时定量荧光PCR对环境进行监测和传统的方法相比，可以缩短检测时间，增加灵敏度和准确性。目前应用实时定量荧光PCR方法已对水资源及居家、办公环境中的大肠杆菌、藻青菌和一些寄生虫成功的进行了监测。 5.5.2 转基因生物中的应用

在转基因植物中，需要考查阳性植株中外源基因的拷贝数，因为拷贝数通常会影响基因的表达和后代性状的表现。目前常用的检测技术是Southern杂交，但此技术需要大量的材料，操作繁琐，相当耗时。应用实时定量荧光PCR也可以对基因的拷贝数作测算，即用一个已知拷贝数的内源基因作为参照，同时对样品作内源基因和外源基因的实时荧光定量PCR，通过两者达到荧光阈值时的CT值便可得到外源基因的拷贝数。实时荧光定量PCR在转基因动物的纯合性鉴定上也有出色的表现，另外，利用定量PCR还可以对转基因后外源基因表达情况

进行监测。

5.5.3 基因转录的检测

PCR应用之前，mRNA的定量是用传统的Northern印迹的方法，其定量的下限是106-107个分子。这种方法要求的mRNA的量较大，因而其在基因表达研究应用上受到很大的。实时荧光定量PCR的发明，解决了这个难题，其灵敏度可检测到40个分子的mRNA。它以其精确、快速、污染小，已广泛应用于分子遗传学领域。实时荧光定量PCR方法已广泛应用于不同生物体间、同一生物体不同部位间基因转录水平的研究。 5.5.4 基因病的诊断

在单基因病的诊断方面，对于基因的大片段缺失可设计跨基因片段的荧光探针，然后对其进行扩增。若有基因缺失，将无荧光的产生。直接观察荧光的有无，免去了常规PCR后的电泳检查，且敏感性大大超过常规的PCR，现已能够对单细胞的核酸进行检测。针对遗传病的基因突变，设计跨越突变位点的荧光探针,对跨越突变位点的一段基因进行扩增。扩增结束时，对产物进行缓慢加热以获得熔解曲线,，根据熔解曲线判断是否有基因突变。结果诊断符合率达到百分之百。说明了运用荧光定量PCR 检测基因突变具有准确、快速的优点，同时能有效地减少污染。