一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106092683 A(43)申请公布日 2016.11.09

(21)申请号 201610396280.1(22)申请日 2016.06.07

(71)申请人 河南科技大学

地址 471000 河南省洛阳市涧西区西苑路

48号(72)发明人 郑轶琦　赵燕　刘晶　许晓利　

臧国长　(74)专利代理机构 洛阳公信知识产权事务所

(普通合伙) 41120

代理人 罗民健(51)Int.Cl.

G01N 1/28(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页 附图1页

()发明名称

一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法(57)摘要

本发明涉及一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法，包括以下步骤：首先在每50ml Na(ClO)2中加入2g CaCl2和1g Ca(OH)2，充分溶解，配制强效脱色液；其次按照体积比为1:1:2:6的比例，取冰醋酸、甘油、强效脱色液和无水乙醇，混合均匀后，配制得到样品脱色液；最后取样品脱色液置于玻璃器皿中，将待脱色的经DAB染色液染色的植物叶片完全浸入样品脱色液中；将玻璃器皿置于沸水浴中加热，至叶片的绿色完全脱去。采用此脱色方法，脱色效果明显，能将叶片上的杂色脱尽，更为直观、准确地反映由胁迫导致的H2O2累积情况。CN 106092683 ACN 106092683 A

权　利　要　求　书

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1.一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、配制强效脱色液：每50ml Na(ClO)2中加入2g CaCl2和1g Ca(OH)2，充分溶解，配制强效脱色液；

步骤二、配制样品脱色液：按照体积比为1:1:2:6的比例，取冰醋酸、甘油、强效脱色液和无水乙醇，混合均匀后，得到样品脱色液；

步骤三、取样品脱色液置于玻璃器皿中，将待脱色的经DAB染色液染色的植物叶片完全浸入样品脱色液中；将玻璃器皿置于沸水浴中加热，至叶片的绿色完全脱去。

2.如权利要求1所述的一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法，其特征在于：所述的DAB染色液，是将DAB粉末溶于pH 5.0，50mmol/L的 Tris-醋酸缓冲液中形成DAB染色液，其中DAB粉末的质量浓度为0.1 mg/ml。

3.如权利要求1所述的一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法，其特征在于：沸水浴加热时间为30min。

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说　明　书

一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法

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技术领域

[0001]本发明涉及一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法。

背景技术

[0002]过氧化氢（H2O2）是重要的活性氧之一，激素等发育信号和胁迫刺激可以诱导细胞内H2O2的产生和积累，继而植物的气孔运动、生长发育、衰老和逆境应答等诸多生理过程。因此，对H2O2的测定，是植物生理学最常用的测定指标。[0003]DAB，即3,3-二氨基联苯胺，DAB染色方法是目前比较常见的H2O2测定方法，其测定原理：H2O2在过氧化酶的催化下可与DAB迅速反应生成棕色化合物，从而定位组织中的H2O2 。该技术是对H2O2进行原位定位染色的方法，通过观察产生的斑点便可检测H2O2的聚集情况。该方法操作简单，成本较低，H2O2的产生具有专一性，同时能够肉眼直观地看到由于H2O2的积累产生的斑点大小与深度，常被用来检测植物受到环境胁迫时H2O2的累积情况。在DAB染色结束后，需要通过脱去叶片叶绿素和非DAB染色，从而计算DAB染色后的面积以及颜色深度。因此，DAB染色后的脱色步骤，是DAB对H2O2染色指示准确度的考验。但是，目前DAB染色后脱色的方法，分辨率不高，脱色效果不甚显著，常常无法将杂色脱尽，从而不能准确地反映由胁迫导致的H2O2累积情况。

发明内容

[0004]本发明针对目前常用的脱色方法对H2O2染色指示准确度不高的情况，提供一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法。

[0005]本发明中一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法，包括以下步骤：

步骤一、配制强效脱色液：每50ml Na(ClO)2中加入2g CaCl2和1g Ca(OH)2，充分溶解，配制强效脱色液；

步骤二、配制样品脱色液：按照体积比为1:1:2:6的比例，取冰醋酸、甘油、强效脱色液

混合均匀后，得到样品脱色液；和无水乙醇，

步骤三、取样品脱色液置于玻璃器皿中，将待脱色的经DAB染色液染色的植物叶片完全浸入样品脱色液中；将玻璃器皿置于沸水浴中加热，至叶片的绿色完全脱去。[0006]进一步的，所述的DAB染色液，是将DAB粉末溶于pH 5.0，50mmol/L的 Tris-醋酸缓冲液中形成DAB染色液，其中DAB粉末的质量浓度为0.1 mg/ml。[0007]进一步的，沸水浴加热时间为30min。[0008]有益效果：本发明中配制的强效脱色液中含Na(ClO)2，CaCl2和Ca(OH)2三种成分，在样品脱色液中加入一定比例的含有这三种成分的强效脱色液，在脱色过程中，Na(ClO)2漂白效果好但挥发性强，在加热脱色过程中容易挥发失效；但是在Ca离子加入后，Ca+(ClO)2的稳定性会增加。同时，-OH的引入，保证了Na(ClO)2不会过分分解。因此，Na(ClO)2，CaCl2和Ca(OH)2三种搭配，在叶片脱色过程中相互协作，相互配合，使有效成分充分发挥其作用，脱色效果更为明显，能将正常叶片上的棕色斑点脱去，更直观、准确地反映出由胁迫

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导致的H2O2累积情况。

附图说明

[0009]图1 采用方法A对经DAB染色的受机械损伤的烟草叶片进行脱色的效果图；

图2 采用方法B对经DAB染色的受机械损伤的烟草叶片进行脱色的效果图；图3 采用方法A对 DAB染色的受真菌感染的烟草叶片进行脱色的效果图；图4 采用方法B对 DAB染色的受真菌感染的烟草叶片进行脱色的效果图；图5 H2O2含量测定结果图。具体实施方式

[0010]下面结合具体的实施方式对本发明一种经DAB染色的植物叶片的脱色方法进行解释说明。

[0011]实施例1：对经DAB染色的受机械损伤的烟草叶片进行脱色，包括以下步骤：

1．配制DAB染色液：将DAB粉末溶于pH 5.0，50mmol/L的 Tris-醋酸缓冲液中形成DAB染色液，其中DAB粉末的质量浓度为0.1 mg/ml；

2．配制强效脱色液：将2g CaCl2和1g Ca(OH)2加入到50ml Na(ClO)2中溶解，配制强效脱色液；

3．配制样品脱色液：按照体积比为1:1:2:6的比例，取20ml冰醋酸、20ml甘油、40ml强效脱色液和120ml无水乙醇于500ml玻璃杯中，混合均匀后，得到样品脱色液；

4．叶片样品处理：取烟草叶片，在叶脉两侧各用牙签对称扎2个孔，将叶片完全浸泡在DAB染色液中，黑暗处理8h，然后进行脱色；

5．脱色处理：采用本发明方法（方法A）进行脱色，将叶片浸泡在装有样品脱色液的玻璃杯中，使叶片完全浸入样品脱色液，将玻璃杯置于沸水浴中，加热30min，直至叶片的绿色完全脱去，将叶片从样品脱色液中小心取出，清水洗净，如图1；同时，采用普通脱色方法（方法B）脱色，作为对照，即按照体积比为1:2:7的比例，取20ml冰醋酸、40ml甘油和140ml无水乙醇于500ml玻璃杯中，混合均匀后，将叶片完全浸入到玻璃杯的混合液体中，将玻璃杯置于沸水浴中，加热30min，直至叶片的绿色完全脱去，将叶片从样品脱色液中小心取出，清水洗净，如图2；

6．结果分析：此次试验要检验叶片受机械损伤后的H2O2累积情况，经脱色后的叶片最理想状态应除伤口处的黑斑外，整个叶片理论上不应再有黑斑出现。试验结果如图2所示，采用普通脱色方法（方法B）进行脱色，脱色不完全，叶片上仍出现黑斑/条，不能很好地指示叶片因机械损伤造成的H2O2累积情况；而采用本发明方法（方法A）进行脱色，如图1所示，除伤口处的黑斑外，整个叶片脱得干干净净，准确直观地反映出经损伤胁迫后叶片中H2O2累积情况，同时，为以此次试验为基础的其他试验处理的结果提供一个非常好的对照。[0012]实施例2：对经DAB染色的受病菌侵染的烟草叶片进行脱色，包括以下步骤：

1．配制DAB染色液：将DAB粉末溶于pH 5.0，50mmol/L的 Tris-醋酸缓冲液中形成DAB染色液，其中DAB粉末的质量浓度为0.1 mg/ml；

2．配制强效脱色液：将2g CaCl2和1g Ca(OH)2加入到50ml Na(ClO)2中溶解，配制强效脱色液；

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3．配制样品脱色液：按照体积比为1:1:2:6的比例，取20ml冰醋酸、20ml甘油、40ml强效脱色液和120ml无水乙醇于500ml玻璃杯中，混合均匀后，得到样品脱色液；

4．叶片样品处理：选取烟草黑胫病菌0号生理小种，菌种用PDA固体培养基培养。当病菌长满培养基平板的时候，用塑料取孔器从平板上取等面积的菌块用于接菌。选择烟草顶部往下的第三片叶进行离体接种试验，并在叶脉两侧各用牙签对称扎2个孔。菌斑块接种于叶脉右侧两个伤口，不接种的叶脉左侧作为实验对照。接种叶片培养在垫着湿润滤纸的平板中，置于温度28±2℃，16小时光照，8小时黑暗的培养室内培养三天后，对叶片进行染色处理，将叶片完全浸泡在DAB染色中，黑暗处理8h，然后进行脱色；

5．脱色处理：采用本发明方法（方法A）进行脱色，将叶片浸泡在装有样品脱色液的玻璃杯中，使叶片完全浸入样品脱色液，将玻璃杯置于沸水浴中，加热30min，直至叶片的绿色完全脱去，将叶片从样品脱色液中小心取出，清水洗净，如图3；同时，采用普通脱色方法（方法B）脱色，作为对照，即按照体积比为1:2:7的比例，取20ml冰醋酸、40ml甘油和140ml无水乙醇于500ml玻璃杯中，混合均匀后，将叶片完全浸入到玻璃杯的混合液体中，将玻璃杯置于沸水浴中，加热30min，直至叶片的绿色完全脱去，将叶片从样品脱色液中小心取出，清水洗净，如图4；

6．结果分析：结果如图3或4所示，经方法A和B脱色后，在叶片真菌感染处，都出现黑斑，表现出明显的H2O2积累；但是在远离病斑的区域，通过方法B脱色可以显示出明显的黑色迹象，该黑色迹象容易混淆由于真菌感染造成的黑斑的判断；而通过方法A脱色没有出现明显的黑色迹象，所以，通过方法A，即本发明所述的脱色方法，可以更准确直观地反映经真菌感染胁迫后叶片中H2O2累积情况。

[0013]为了验证方法A的准确性，取20片受真菌感染的叶片，切取远离病斑的部位进行H2O2含量测定，测定过程参照其试剂盒说明书进行。结果如图5所示，该部位H2O2含量与未受侵染的叶片H2O2含量类似，即用方法A指示的结果更为清楚和准确。[0014]所述的DAB购自sigma公司，产品编号为D5637；

所述的烟草为野生型烟草品种‘威斯康辛38’，可通过中国农业科学院烟草研究所烟草种质资源库购买得到；

所述的烟草黑胫病菌0号生理小种由美国模式培养物集存库（ATCC）提供，保藏号13611；

所述的PDA固体培养基，其配制方法为每升培养基中含土豆 200 g，蔗糖20 g，琼脂15 g，余量为水；pH调至6.5；灭菌处理；

所述的H2O2含量测定采用过氧化氢检测试剂盒，购自Sigma Aldrich公司，产品编号为MAK165。

[0015]以上所述的具体的实施方案应理解为说明性的，而非本发明的保护范围。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

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说　明　书　附　图

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图1图2

图3图4

图5

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