第２２卷第６期（２０１７） 甘青高旰孑拒 银纳米粒子的制备、表征及抗茵性能研究 龙世佳，刘 妍，董小宁，唐惠安，王晓峰，刘 岿 （天水师范学院化学工程与技术学院，甘肃天水摘７４１００１） 要：采用化学还原和晶种诱导结合法制备银纳米粒子，并用紫外一可见分光光度计（ｕＶ一 、ｒｉｓ１和透射电子显微镜（ＴＥＭ）对所制备的银纳米粒子进行表征；用大肠杆菌为受试菌株进行药 敏实验．采用纸片法通过比较抑菌圈大小测试了不同浓度银纳米粒子的抗菌性能．结果表明 单分散的、平均粒径约为１５ｎｍ的准球形银纳米粒子对埃希氏大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）具有明显的抗 茵作用。且抗茵效果随着纳米粒子浓度的增加而增强． 关键词：银纳米粒子；大肠杆菌；抗菌性能 中图分类号：ＴＢ３８３．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００８—９０２１（２０１７）０６—０２０—０５ 银纳米颗粒因其小尺寸效应、表面效应、量子尺 寸效应和宏观量子隧道效应等特异性，从而具备特 殊的光、热、电、声、磁、力学性能、催化性能和化学活 公司：ＵＶ一２５５０型紫外可见分光光度计，日本岛津 公司；ＫＱ一２１８型超声波清洗机，昆山市超声仪器有 限公司：ＷＨＹ一２Ｓ型数显旋转水浴恒温振荡器，中 国金坛诚辉仪器厂；ＴＧＬ一２０Ｍ高速台式冷冻离心 机。长沙湘仪离心机有限公司；立式压力蒸汽灭菌 机．上海申安医疗器械厂：ＺＨＷＹ一２０１２Ｃ型恒温培 性等等【 ．可广泛应用于催化、生物、工程等众多领 域．在整个新兴功能材料开发应用方面占据着核心 位置．近几年，银纳米抗菌技术发展迅速，显示出广 阔的应用前景，银纳米粒子作为一种重要的纳米抗 养振荡器。上海智城分析仪器制造有限公司；ＺＤＰ一 ２１２０型全自动新型电热培养箱．上海智城分析仪器 制造有限公司． 菌剂．其高效、广谱、持久及不产生耐药的抗菌性能， 引起研究者的极大关注．因此彰显银纳米优异性能 的开发应用研究如火如荼，其物理化学制备方法也 越来越多．常用的如化学还原法、微波法、微乳液 １．２实验材料 （１）药品及试剂：银、硼氢化钾、十六烷基三 法、光诱导法、电化学法等． ｌ 使用一种纯化学还原法制备了银纳米粒子， 采用紫外一分光光度计（ｕｖ—ｖｉｓ）和透射电子显微 镜（ＴＥＭ）对所制备的银纳米粒子进行表征，并通 过抑菌圈法Ｉ ９】对纳米银的抗菌性能进行定性测试 研究． 甲基溴化铵、柠檬酸钠、抗坏血酸、氢氧化钠、琼脂、 庆大霉素、普通琼脂、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠均为国 产分析纯试剂． （２）培养基配方 牛肉膏固体培养基［ ｏｌ：牛肉膏３ｇ，蛋白胨５ｇ， ＮａＣ１ ５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，琼脂１５－２０ｇ，ｐＨ＝７．４． 牛肉膏液体培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨５ｇ，ＮａＣ１ ５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ＝７．４． （３）实验菌株 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２）由天 水师范学院基因工程实验室保存备用． １材料与方法 １．１主要仪器 ＨＩＴＡＣＨＩ一７５００型透射电子显微镜． 日本日立 收稿日期：２０１７—０４—０９ 基金项目：甘肃省教育厅项目“金银核壳纳米复合材料的形貌可控制备及形成机理研究”（２０１４Ａ一１０３）；天水师范学院科研资助 项目“超疏水性功能材料的制备及其应用研究”（ｒＩ’ＳＡ１３０９）；２０１６年度天水师范学院教研资助项目“高师院校化学实验教学中学 生创新思维能力和学习迁移能力的培养”（ＳＹＪＹ２０１６Ｙ２４）． 作者简介：龙世佳（１９７６一），女，陕西西安人，副教授．研究方向：纳米材料及化学课程与教学论． ２Ｏ 第２２卷第６期（２０１７） 龙世佳等：银纳米粒子的制备、表征及抗茵性能研究 ｖ０１．２２ Ｎｏ．６（２０１７） １．３银纳米粒子的制备 １．３．１方法 纸片在离心后的以上清液、稀释后的庆大霉素及普 通生理盐水中浸泡２４ｈ，制成药敏纸片。其中庆大霉 素和生理盐水为对照试剂．在无菌条件下，将分离 以银为前躯体，硼氢化钾为还原剂，在柠檬 酸钠的体系中还原银制得银纳米晶种：再以十六 烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）为保护剂，在ＣＴＡＢ与硝 酸银形成的生长溶液中加入晶种，用抗坏血酸做还 原剂．使晶种进一步成长为银纳米颗粒． １。３．２制备 往大试管中加０．５ｍＬ的０．０１ｍｏｌ・Ｌ—ＡｇＮＯ 和 ０．５ｍＬ的０．０１ｍｏｌ・ Ｎａ３ｃｄ－Ｉ５Ｏ６，然后加水至２０ｍＬ，不 纯培养菌株接种于普通营养肉汤中，３７ｃＩ＝培养９ｈ， 将培养菌液用普通营养肉汤稀释至１０｛．吸取 ０．１ｍＬ滴人普通营养琼脂平板均匀涂布，无菌操作 将上述药敏纸片贴于培养皿上，置于３７℃培养箱中 培养２４ｈ，观察测量抑菌圈大小并记录结果．［１３１ 将Ｂ试管银纳米粒子经多次离心分离处理，完 全去除Ｃ ｒＡＢ后，加无菌水制得５ｕｇ／ｍＬ银纳米粒子 断搅拌，并立即加入０．１２ｍＬ的０．０５ｔｏｏｌ・Ｌ～ＫＢｔＬ，反 溶胶，按２、４、８、１６、３２倍用无菌水进行稀释，重复上 述抑菌实验操作，对比不同浓度下银纳米粒子的抑 菌强弱．判定标准：菌圈直径０ｍｍ为不敏感；１～ 应３０秒后停止搅拌，溶液呈金黄色，静置两小时后。 即制得银纳米晶种．［Ｉｌｌ制备的种子必须在２ ５小时 内使用．否则晶种会失活． 往Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ每个干净的试管分别依次加入 ０．５ｍＬ的０．０１ｍｏｌ・Ｌ－Ｉ ＡｇＮＯ３、ｌｍＬ的０．１ｔｏｏｌ・Ｌ 抗坏 血酸和２０ｍＬ的０．０８ｍｏｌ・Ｌ～ＣＴＡＢ．然后向这四个 １０ｍｍ为低度敏感：１０～１５ｍｍ为中度敏感；大于 １５ｍｍ为高度敏感． ２结果与讨论 ２．１银纳米粒子的表征 如图１所示，试管Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ中为所加银纳米 试管中依次加入２ｍＬ、ｌ＿５ｍＬ、ｌｍＬ和０．５ｍＬ的种子溶 液．最后往每支试管中加人０．２ｍＬ的１ｍｏｌ・Ｌ ＮａＯＨ 溶液．加入ＮａＯＨ后。轻摇使溶液混合均匀．将试管 放在４０℃的恒温水浴中，ｌ０分钟内，每个试管由于 所加种子量的不同而出现不同的颜色，即制得银纳 种子体积依次为４ｍＬ、２ｍＬ、ｌｍＬ、０．５ｍＬ而出现不同 的颜色的银纳米溶胶，可观察其内溶胶的颜色依种 子量的递减而从深黄色到黄色再到淡绿色． 米粒子溶胶． １．３．３ 表征 使用紫外可见分光光度计（ＵＶ—Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ） 选择扫描波长在３００ ｎｍ～６００ ｎｍ之间．进行银纳米 溶胶的吸收光谱分析与检测． 银纳米颗粒的形貌分析表征用透射电子显微 镜，加速电压为２０ ｋＶ．样品的制备是将５ ｍＬ已制 备的金纳米棒溶胶经过ｌ００００ｒ，ｓ离心清洗三次（每 次离心１５～２０ ｍｉｎ。移出上层清液将沉淀物重新分 散到２ ｍＬ二次水中，第三次离心重新分散到ｌｍＬ 乙醇中待测）．提前超声３～５分钟后，铺展在涂有碳 膜的铜网上。然后经自然干燥后再进行ＴＥＭ检测． 图１银纳米粒子 银纳米粒子的紫外可见光谱如图２所示，谱线 Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｈ分别表示在制备时所加种子的体积为 ４ｍＬ，２ｍＬ，ｌｍＬ，０．５ｍＬ银纳米溶胶的吸收谱图．由 经典紫外光谱理论可知。吸收峰的半高宽越宽，粒子 尺寸分布就越广泛：吸收峰的位置和半高宽均不改 １．４银纳米粒子的抑菌实验 １．４．１菌种的活化 取冷藏保存的大肠杆菌菌种，在琼脂平板上进 行划线培养，放置在电热恒温培养箱中，在３７℃下 培养２４ｈ后，挑取单菌落接种在液体培养基中，放 置在电热恒温振荡器中。在３７ｃＩ＝下培养２４ｈ活化 菌种．［１２１ １．４．２纸片法检测抑菌作用 变而吸收峰的峰值增大．则说明金属纳米粒子浓度 增大。即单位体积内粒子数增多【ｌ４１．由图２看出，对 比Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ谱线，发现其均在４００ｎｍ左右处有吸 收峰，且随着加人种子量的减少，峰半高宽逐渐加 宽，吸收强度减小．表明Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ试管中银纳米的 尺寸分布依次不均．粒子浓度依次减小． 将Ｂ试管中的银纳米胶体以１Ｏ０００ ｒ／ｍ高速离 心２０ ｍｉｎ。取上层清液。将直径为０．６厘米的灭菌滤 Ｂ谱线为单峰且吸收峰最强，峰形非常对称并 ２１ 第２２卷第６期（２０１７） 寸音高奸孑拒 Ｖｏ１．２２ Ｎｏ．６（２０ｌ７） 且半峰宽很窄．这表明形成银纳米粒子的形状和尺 寸分布都比较均一，且纳米颗粒浓度大；Ｃ、Ｄ谱线 为双峰．除４００ｎｍ处的峰外。在５００ｎｍ左右又出现 一比更大．纳米颗粒溶解释放银离子的能力也增强． 小尺寸释放银离子的量比大尺寸纳米银多．杀菌效 果与银离子的释放量成正相关．Ｉ Ｉ鉴于此，对照图３Ａ 和图３Ｂ．图３Ａ的银纳米粒子形状尺寸分布均一，且 尺寸保持较小的１５ｎｍ，故以下的抑菌实验采 之． 很弱吸收峰，双峰是纳米棒的特征峰，表明粒子形 状不一，球形中有杂型棒状粒子存在；Ｈ谱线虽是单 峰。但吸收峰最弱而宽，表明该粒子数目少而且不均 一２．２抑菌实验结果 ２．２．１ 庆大霉素的对照与ＣＴＡＢ的抑菌实验 将庆大霉素和生理盐水制成药敏纸片．贴于普 通营养琼脂平板上，并将其在３７℃进行培养２４ｈ，结 ．因此选则浓度较大的Ｂ试管和Ｃ试管中银纳米 粒子进行电镜表征． 果如图４所示：左侧对照平皿（纸片浸有生理盐水） 和右侧实验平皿（纸片浸有庆大霉素），左侧平虬没 有抑菌圈而右侧平皿有明显的抑菌圈． 图２纳米银粒子ＵＶ—Ｖｉｓ谱图 图４对照（左）及庆大霉素（右） 取少量经制样处理的银纳米粒子溶液．滴加到 碳网上，防尘条件下干燥后，使用透射电镜，调整合 适放大倍数．得到电镜图片． 图５对照（左）及ＣＴＡＢ（右） 将ＣＴＡＢ溶液和生理盐水制成药敏纸片．贴于 普通营养琼脂平板上．并将其在３７℃进行培养２４ｈ． 图３ Ｂ试管中银纳米粒子电镜图Ａ 和Ｃ试管中银纳米粒子电镜图Ｂ 结果如图５所示：左侧对照平皿（纸片浸有生理盐 水）和右侧实验平皿（纸片浸有ＣＴＡＢ溶液），左侧没 有抑菌圈．右侧平皿有明显的抑菌圈．说明ＣＴＡＢ本 身具有很强的杀菌能力． 图３Ａ为Ｂ试管中的银纳米颗粒的电镜图．从 图中可以看到银纳米粒子呈单分散的准球形．粒度 尺寸分布均匀，粒径平均在１５ｎｍ左右．该电镜照片 由此可知，制备银纳米粒子时所用的保护剂十 六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）本身具有明显的抑菌 作用，因此在检测纳米银的抑菌性能时必须先分离 正好与紫外表征Ｂ谱线的单峰，峰形对称且半峰宽 窄相吻合． 图３Ｂ为Ｃ试管中银纳米颗粒的电镜图．从图 或彻底去除纳米银体系中ＣＴＡＢ．分离操作选用高 速离心机以１００００ ｒ／ｍｉｎ离心二十分钟，去除清液． 沉淀再次用无菌水分散，经多次重复离心后．为确保 ＣＴＡＢ与银纳米粒子的彻底分离，取上清液来制备药 敏纸片．验证无明显的抑菌圈，说明ＣＴＡＢ完全除去． ２．２．２银纳米粒子的抑菌实验 中可以看到银纳米球中混有少量纳米棒．其中球形 银纳米粒度分布较均匀，分散度较好，粒径平均在 １５ｎｍ左右．纳米棒长径比大概是２５ｎｍｘ１０ｎｍ．杂型 约占粒子总数的１０％．这也与紫外表征Ｃ谱线预测 的基本一致． 目前研究表明．纳米银的尺寸越小．其毒性越 强．这是因为纳米银颗粒尺寸减小．其表面积／体积 ２２ 将Ｂ试管中的经多次离心分离完全去除ＣＴＡＢ 后的银纳米粒子．加无菌水制得５ｕｇ／ｍＬ银纳米粒子 ２２替 ６ Ｉ９］（２０１ ７） 龙世佳等：银纳米粒子的制备、表征及抗茵性能研究 Ｖ‘）１．２２ Ｎｏ．６（２０１ ７） 齐胶，１ ｊ Ｌ按２（２．５ｕｇ・ｍ１ 。）ｆ 、４（１．２５ｕｇ・Ｔ１】Ｉ ）ｆ『ｆ、８ （０．６２５ Ｌｌｇ－Ｉｉ１Ｉ 。）１ 、ｌ６（０．３ｌ２５ｕｇ・Ｔ『１ ）俯、２０（０．２５ｕｇ・ ｌ１】Ｉ ～ ）俯川尢 水怖释．将稀释前 ｆ１９ ６份溶胶制成 』ｊ敏纸片， ｒ 越 养Ｄ￣ＪＪ８、 板Ｉ （标号Ａ、｝｛、Ｃ、 Ｉ）、 、（ ），将Ｊ ３７ 进ｆ 培养２４ｈ，Ｊｉ ｊ ｆＪ‘ ｆ ｌｌＩ 盐水的刈 ｌ『ｌ【（ｐ’）进仃埘比．结 『』【ｊ ６』听，Ｉ：． Ｉ ６ Ｉｆ１ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｉ）、Ｅ ＩｌｌＩ．１ 、（浸有生理盐水）对ｊ｛（｛、ｆ￡ＩＩｌＬ 埘比仃Ｉ Ｊ！ ｌｆｉ９抑 ，ＩＩ＿抑Ｉ柑 银纳米粒 浓度 依次降低 减小： ７的（、、１，．…【 ｊ ｌ１’对照儿 尤抑 ， 叫ｉ发浓度时儿 尤抑 作川．结果衷『１Ｊｊ： 银纳水粒广浓度ｆ｛１ ５Ｕｇ／ｌｌｌ１ 降ｊ ０．３１２５ｕｇ／ｍ［ 【１’『对 人肠朴 的抑 一： 均人Ｊ １ ５ｒａｍ，聃小 持 ２０ｎｌｌｎ以ｌ ，ｌＩ．随 纳米粒Ｊ 浓度的降低抑 仃所减小．蜕ｆ』Ｊ】纳水银时埃希氏火肠朴 （Ｅ． ｒ．１ｉ）ｊ ｉｌＪ 洲 抗 作』ｔｔ，｝ｉ＿随符 纳米粒 浓度 的增『ＪＩｌ 抑 能，Ｊ也逐渐增 ，ｆＩ银纳水粒 浓度 ｌ｝０．２５ｕｇ／ｎｌｌ 以卜儿、ｒ・几Ｉ Ｊ ５ 的抑 作川． 图６浸有不同浓度的银纳米粒子及 生理盐水平皿 图７ 浸有（）．２５ｕｇ／ｎｌ１ 的银纳米粒子及生理盐水平皿 ３ 结论 迎过化 、 ： 法圳 Ｊ 牲Ｊ 较小的 纳水 ， 紫夕 分比 发、Ｉ‘、ＴＥＭ分 丧，Ｊｌ：ｉ ｝ ＩＪ １ｉ 的银纳水 粒 ｛ 约１５ｔ・ｔｎ，‘ 『１．分敞的球形．通过 抑 试验对该纳米银溶胶的抗菌性能进行＇ｒ分析 研究．结果发现所制得的准球形纳米银对大肠杆 有很强的杀菌效果．．且纳米银浓度越高、杀蒲效果越 明 ．与其它形状银纳米卡Ｉ｛ｌ比，这些１５ｎｍ、粒径较小 的准球形纳米银能更充分地 ｊ细 接触，从 杀 能力更强．可能是ｆ｝１于银纳米粒子的比表而积极 大．遇水或在水中有Ａｇ＝Ａｇ ＋ｅ的反应存在：同ｆｌ寸其 直径极其微小，可以轻易侵入细菌．Ｉ ｌＡｇ。与Ａｇ 之Ｉｈ】 的平衡典存，这也许正是银纳米的持久抗菌性所在． 参考文献： 【ｌ】Ｎｅｗｔｏｎ Ｋ Ｍ，Ｐｕｐｐａｌａ Ｈ Ｌ，Ｋｉｔｃｈｅｎｓ Ｃ Ｌ，ｅｌ ａ１．Ｓｉｌｖｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｌｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ Ｄａｐｈｎｉａ ｍａｇｎａ ｉｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｉ’ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｓｉｌｖｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ…．Ｆｎｖｉｒｏｎ— ｅｒｅｌｌｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｈ）ｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０ ｌ ３，３２（１ ０）： ２３５６－２３６４． 钟福新，蒋治良，李芳，等．纳米银胶的光化 学制备及其共振散射光谱研究…．光谱学与光谱分 析，２０００，２０（５）：７２４—７２６． 【３１于兵川，吴洪特，张万忠，等．纳米银的合成 研究进展…．化工科技市场，２００５，（３）：３０—３５． 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１５ｎｍ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｈａｖｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅ ｃｏｌｉ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｉｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｓｉｌｖｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｉｌｖｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ｍｏｌｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 责任编辑：詹紫浪
