第１６卷第５期 ２０１４年１Ｏ月 滁州学院学报 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＵＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖ １．１６ Ｎｏ．５ ｏＣｔ．２０１４ 常见酸奶酸菜中乳酸菌的筛选及 乳酸菌素的特性研究 鲁志彬，柴新义，李强，周玲玲，胡兴翠 摘 要：以日常生活中常见的也是深受人们喜爱的酸奶和下饭菜（酸菜、泡菜）等富含乳酸菌的食品为原材料，通过 ＭＲＳ分离培养基等选择性培养基分离出若干株乳酸菌，进一步纯化分离得到单一的乳酸菌种保存待用，并对乳酸茵的生 长条件进行测定。以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等病原茵作为指示茵，通过抑茵实验、蛋白酶处理实验 等系列实验来检测乳酸菌具有较好抑制病原菌生长能力的内在物质——某种多肽类物质，称之为乳酸菌素。对筛选出的 菌株进行相应的生理生化实验，鉴定出有乳杆菌属、链球菌属、片球菌属和明串珠菌属等多个属的乳酸菌株。 关键词：酸奶；酸菜；乳酸茵；乳酸菌素；筛选鉴定 中图分类号：Ｃ９３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３．１７９４（２０１４）０５．００３７．０７ 作者简介：鲁志彬，李强，周玲玲，胡兴翠，滁州学院生物与食品工程学院；通讯作者：柴新义，滁州学院生物与食品 工程学院副教授，博士，研究方向：真菌生理生态学（安徽滁州２３９０００）。 基金项目：滁州学院校级重点项目（２０１３ＣＸＸＬ０５０）；国家级大学生创新创业训练计划项目（２０１３１０３７７０１２） 收稿日期：２０１４—０４．２３ 乳酸菌是一类革兰氏阳性球菌或杆菌、无芽 道内有害微生物，不破坏肠道菌群的平衡，抑菌 实验表明，乳酸菌素对一些致病的革兰氏阳性菌 孢、无运动性、接触酶阴性，能够发酵一些碳水 化合物产生乳酸的细菌的总称…。乳酸菌的功能特 性是近百年来相关科学工作者们一直比较偏爱的 研究热点，也是目前人类利用较为全面的微生物， 和阴性菌均有不同程度的抑制作用，因此，它可 以用于治疗肠内消化不良、腹胀、腹泻、肠炎等 疾病ｎ 。在幼儿时期，很多的孩子容易出现消化不 乳酸菌中的一些益生菌已被广泛应用到酸奶酸菜 等发酵食品的制作和微生态制剂的生产中。 乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核 糖体合成机制产生的分泌到环境中的一类具有生 良和腹胀的肠道问题，而小孩也不喜欢吃药，同 时使用别的抗生素对幼儿的身体也会造成伤害， 这时如果可以让小孩食用含有乳酸菌的酸奶等食 品或许可以起到一举两得的效果；在老年时期， 物活性的蛋白质、多肽或前体多肽，它对其他相 近种类的细菌具有抑制作用，但是其抑菌范围又 不仅仅局限于有亲缘关系的种，且产生菌对其分 泌的乳酸菌素有自身免疫性口 。 近几年来，许多国家出现过超级细菌感染的 老年人的肠道内有益菌群数量下降的很厉害，这 时乳酸菌类的药品或食品则能起到调节肠道微生 物生态平衡防止大肠内蓄积有害物质，可以延缓 机体的衰老，促进胃肠蠕动与胃液分泌的作用。 乳酸菌素也可广泛应用到乳制品、罐头食品、 肉制品、啤酒饮料等食品工业中，例如在干酪加 工过程中，尽管经过高温灭菌，但仍会有耐热性 的革兰氏阳性菌孢子（肉毒素梭菌和厌氧梭菌芽 病例，这是由于抗生素的滥用导致细菌耐药性的 加剧而产生的，而且抗生素的长期应用会引起肠 道菌群的紊乱、抗生素伴联腹泻等，这已成为一 个严重的公共健康问题，所以人们开始试图研究 孢等）存在，而加入ｎｉｓｉｎ乳酸菌素可有效阻止这 其他副作用较弱的抗菌剂，乳酸菌素作为一种天 然抗菌肽，安全无毒，在为肠道内可被降解，不 会引起细菌的抗药性，并且可以选择性的杀死肠 些孢子的萌发和毒素形成，印度的牛奶生产中使 用了ｎｉｓｉｎ让仅能存放３～７天的消毒牛奶延长保存 至６０余天；利用乳酸菌素不抑制酵母菌生长这一 ３８ 鲁志彬，等：常见酸奶酸菜中乳酸茵的筛选及其乳酸菌素的特性研究 特性，可将它应用于啤酒饮料等的生产酿造中防 度为４－５ｅｒａ，然后将乳酸菌悬液０．１ｍｌ加入融化的 止其他腐败菌的污染 。总之，使用乳酸菌素这类 生物添加剂不仅可以较大地延长贮存期还可以保 证食品的安全性、良好的风味和质地。 以益生乳酸菌为基础，衍生出的众多系列产 软琼脂柱内（温度约为４７％～４８￣Ｃ，试管不烫手 即可）。混匀后在上面加盖一层约７ ｍｌＹｌ的２％琼 脂，置于适温培养。观察是否有气泡出现将２％的 琼脂层向上顶起。 １．３主要实验仪器与设备 品以其原生态、绿色、安全、无毒副作用的特点 完全符合现代社会消费者对天然、绿色有机食品 的追求。本实验为进一步的实际应用提供一些基 础理论依据。 １ 实验材料与方法 １．１ 实验材料 大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（均 为滁州学院微生物实验室保存的菌种） １．２主要培养基 ＭＲＳ固体培养基：蛋白胨１０ｇ，牛肉膏１０ｇ， 酵母膏５ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐温８０ ｌｍｌ，Ｋ２ＨＰ０４ ｇ， 醋酸钠５ｇ，柠檬酸二铵２ｇ，ＭｇＳ０４．７Ｈ２０ ０．５８ｇ， ＭｎＳ０４．４Ｈ２０ ０．２５ｇ，琼脂２０ｇ，超纯水１ ０００ｍｌ， ｐＨ调至６．０。 ＭＲＳ液体培养基：蛋白胨１０ｇ，牛肉膏１０ｇ， 酵母膏５ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐温８０ ｌｍｌ，Ｋ２ＨＰ０４ ｇ， 醋酸钠５ｇ，柠檬酸二铵２ｇ，ＭｇＳ０４．７Ｈ２０ ０．５８ｇ， ＭｎＳ０４．４Ｈ２０ ０．２５ｇ，超纯水１０００ｍｌ，ｐＨ调至６．０。 分离培养基：蛋白胨１０ｇ，牛肉膏１０ｇ，酵母 膏５ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐温８０ ｌｍｌ，Ｋ２ＨＰ０４ ｇ，醋 酸钠５ｇ，柠檬酸二铵２ｇ，ＭｇＳ０４．７Ｈ２０ ０．５８ｇ， ＭｎＳ０４．４Ｈ２０ ０．２５ｇ，ＣａＣ０３粉末（加入２％）琼脂 １０ｇ，超纯水１０００ｍｌ。 营养琼脂培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨１０ｇ， ＮａＣ１ ５ｇ，琼脂２０ｇ，超纯水１０００ｍｌ，ｐＨ７．２。 肉汤培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨１０ｇ，ＮａＣ１ ５ｇ， 超纯水１０００ｍｌ，ｐＨ７．２。 ＰＹ基础培养基：蛋白胨５ｇ，胰蛋白胨５ｇ， 酵母粉１０ｇ，盐溶液４０ｍｌ，超纯水１０００ｍｌ。 葡萄糖产气培养基：在ＰＹ基础培养基 （１０００ｍ１）中加入３０ｇ葡萄糖和０．５ｍｌ的吐温８０， 再添加６ｇ琼脂做成软琼脂柱，分装于试管中，高 １．４实验步骤与方法 １．４．１乳酸菌的分离 在超净台中完成以下的操作，将冷却至５０℃ 左右的２０ｍｌ ＭＲＳ固体培养基倒人培养ＪⅢ，待培养 基完全凝固后再将加有２％ＣＡＣ０３的半固体ＭＲＳ 培养基１０ｍｌ平铺至上面；取待筛选的乳酸菌材料 ｌｍｌ加入到装有９ｍｌ无菌水的试管中，连续１０倍 梯度稀释，然后用移液器吸取５组适当浓度梯度 的菌液２００ Ｌ，分别涂布于上述双层平板上，放 置到生化恒温培养箱中３７℃培养４８～７２ｈ 。将具 有明显溶钙圈、革兰氏染色阳性、接触酶反应阴 性的乳白色或白黄色且表面圆滑的菌落初步确定 为乳酸菌 。 １．４．２乳酸菌的纯化 将革兰氏染色阳性，接触酶阴性的菌落进行 纯化分离出单个的菌体。在超净台中，用无菌接 种环挑取少许乳酸菌菌落在ＭＲＳ固体培养基平板 上反复划线分离，直至革兰氏染色在显微镜下观 察菌株颜色、大小、形态一致 。将单个菌株形成 的菌落在平板上划线培养使其扩大保存备用。 乳酸菌菌株的初步鉴定：根据乳酸菌在ＭＲＳ 滁州学院学报２０１４年第５期 ３９ 固体平板上生长的菌落形态特征和革兰氏染色显 微镜下观察乳酸菌菌体的形态特征来做出初步的 判断。 １．４‘３乳酸菌菌悬液的制备 用移液管吸取２５ｍｌ ＭＲＳ液体培养基装至带 塞的试管中，用无菌接种环从上述已纯化的乳酸 菌平板上挑取ｌ～２环乳酸菌落接种到装有２５ｍｌ 液体培养基的试管中，置上橡胶塞放人生化恒温 培养箱中３７℃培养１８ｈ左右，至看见培养基明显 变浑浊即可。 １．４．４甘油法和斜面法保藏菌种 甘油长期保藏：此方法是将菌种长期保存待 以后实验室中使用，首先制备好无菌甘油（６０％浓 度），用移液器吸取０．５ｍｌ上述乳酸菌悬液置人 ２ｍｌＥｐ管中，再加入０．５ｍｌ的无菌甘油于培养液面 上，振荡混匀，最后将Ｅｐ管作好标记置于一２０℃ 低温冰柜中保藏。 斜面低温保存：此方法一般只适于短期（１～３ 个月）保藏使用；制作好试管斜面，在超净台中， 用无菌环蘸取上述乳酸菌悬液（注意不要滴撒） 在斜面上从底往口划出，将试管口在酒精灯上灼 烧一下，塞上试管塞并贴好标签，放在３７￣Ｃ培养 箱中２４ｈ培养，每个菌种平行做５个保藏。放置 于４￣Ｃ冰箱中保藏，如温度太低，斜面培养基会 因结冰脱水而致菌种死亡。 １．４．５乳酸菌生长曲线的测定 生长曲线的测定可利用比浊法来测定，即吸 光值来绘制出培养时间与生长量的关系，从筛选 出来的乳酸菌中选取４株来进行测定。将各组试 管中分别装入２５ｍｌ的ＭＲＳ液体培养基，然后用 移液器按１％的量接人乳酸菌种液，将接人菌种液 的培养基放人生化恒温培养箱中３７℃培养，然后 每隔２ｈ取出相应的试管，以未接人任何菌种的培 养基作为空白对照，用７２３分光光度计测出 ＯＤ６００ｎｍ值，取平均值，并记录 。 １．４．６乳酸菌生长过程中ｐＨ的变化 以乳酸菌培养时间为横坐标，ｐＨ为纵坐标绘 制出乳酸菌在生长过程中ｐＨ值的变化情况。向 各组试管中分别加入２５ｍｌ的液体培养基，１２个 为一组，做三组平行，按１％的量接人乳酸菌种液， 置上塞子放人生化恒温培养箱中培养，每隔２小 时取出相应的试管（连续测２４ｈ） ｑ。ｐＨ计测出 其ｐＨ值大小，取平均值，并记录分析。 １．４．７不同ｐＨ下乳酸菌的生长情况 以ｐＨ为横坐标，ＯＤ６００ｎｍ值为纵坐标绘制 出乳酸菌的耐酸性情况。用ＨＣ１溶液和ＮａＯＨ溶 液分别调节液体培养基ｐＨ值为１．５、２．５、３．５、４．５、 ５．５、６．５、７．５、８．５、９．５，然后加人２５ｍｌ至相应的 试管中，按１％的量接入菌种液，置于生化恒温培 养箱中培养２０ｈ后，测出其分光光度值，并绘制 出曲线图。 １．４．８不同ＮａＣ１浓度下乳酸菌的生长情况 在液体培养基中分别加入０％、１．５％、２．５％、 ３．５％、４．５％、５．５％、６．５％、７．５％、８．５％、９．５％的 量的ＮａＣ１，取相应的培养基２５ｍｌ至试管中并标记， 然后按１％的量接人ＳＣ一３和ｓＣ一５菌种液，置于 生化恒温培养箱中２０ｈ后取出，测定其吸光值， 取平均值，并绘制出曲线图 。 １．４．９乳酸菌耐亚硝酸盐实验 ＮａＮＯ：作为食品添加剂被广泛地应用在发酵 肉制品、酸菜等的制作中，同时，酸菜泡菜等的 制作过程中自身也会产生亚硝酸盐，国家对于 ＮａＮＯ：的添加量有严格的限定，所以一些酸菜发 酵中的乳酸菌种对亚硝酸盐得有一定的耐受性 …。在培养基中分别加入０．０１％、０．０１５％、０．０２％ 质量分数的ＮａＮＯ：观察亚硝酸盐对所筛选的乳酸 菌种的生长影响情况。 ２ 产广谱抑菌活性乳酸菌细菌素的研究 采用牛津杯琼脂扩散法 ”：将加热融化的水 琼脂（２％）ｌＯｍｌ倒入无菌培养皿中，完全凝固后， 取３个已灭菌的牛津杯均匀地放置在平板上。吸 取适宜浓度的指示菌菌悬液２００ Ｌ加入半固体 营养琼脂培养基中混匀后迅速倒入上述平板上， 待凝固后取出牛津杯，然后吸取２００ Ｌ的乳酸菌 悬液注入牛津杯形成的圆孔内置于４￣Ｃ冰箱中扩 散１ｈ，然后放于３７℃生化恒温培养箱中培养２０ｈ 后，用游标卡尺测量抑菌圈的直径（ｍｍ）。 首先对所筛选出的多株乳酸菌进行抑菌能力 的初步检测，然后选取其中具有较强抑菌活性的 ３株进行进一步的研究具有较强抑菌活性的菌株 的进一步实验 ２．１有机酸的影响排除试验 用ｌｍｏｌ／Ｌ的ＨＣ１和ｌｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调节乳酸菌 滁州学院学报２０１４年第５期 ４３ 济的迅猛发展和人民生活水平的显著提高，人 ［４］周德庆．微生物学实验教程［Ｍ】．北京：高等教育出版 社。２００６：３７２—３７４． 们对绿色健康的重视程度也日益增强，而乳酸 菌素作为一种无毒的、在肠道中可被降解的绿 色天然防腐剂，正迎合了人们的需要，相信在 将来随着生物技术的不断提高，结合基因工程 ［５］凌代文，东秀珠寺Ｌ酸细菌分类鉴定及试验方法［Ｍ］． 北京：中国轻工业出版社，１９９９：ｌ１７—１２３． ［６］王亚峰，霍贵成，刘丽波．开菲尔粒中乳酸菌的分离 与鉴定［Ｊ］．中国乳品工业，２００４，３２（９）：１７—１９． ［７】 刘慧等．现代食品微生物学实验技术［Ｍ］．北京：中国轻 工业出版社，２０１１：１３７—１３９． 的手段选育出高产乳酸菌素的菌株，以及对乳 酸菌素机理的研究深入，此类产品必将会得到 更加广泛的应用。 ［参考文献］ ［８］刘文华，任慧英，邹玲等．一株优良乳酸茵的分离鉴 定与特性研究【Ｊ］．中国畜牧兽医，２００８，３５（２）：１５２． 【９］ 李悦，孙玉梅等．产细菌素乳酸菌的筛选及其发酵特 性 ．大连工业大学学报，２００８，２７（１）：２０． 『１０】周红霞，张红琳，赵雅．发酵香肠中乳酸茵的分离筛 ［１】腾志利，产广谱细菌素乳酸菌的筛选及其细菌素特 性、发酵条件的研究［Ｄ】．大连：大连工业大学，２０１３： ２．１３． 选和鉴定『Ｊ］．江苏农业科学，２０１０（２）：２８２． ［１１］何宁，王昌禄，顾晓波等．杯碟法检测乳酸菌素活性 优化条件的研究［Ｊ］．天津轻工业学院学报，１９９９，（２）： １７．２０． 【２】蒋志国，杜琪珍 Ｌ酸菌素研究进展［Ｊ］．中国酿造， ２００８，（１８）：１—３． ［３］ 郭兴华，东秀珠等．益生乳酸细茵：分子生物学及生 物技术［Ｍ］．北京：科学出版社，２００８． ［１２］张艾青，刘书亮，詹莉等．产广谱细菌素乳酸茵的筛 选和坚定［Ｊ］．微生物学通报，２００７，３４（４）：７５３—７５６． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｆａｍｉｌｉａｒ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｙｏｇｕｒｔ，Ｓｏｕｒ Ｐｉｃｋｌｅｄ Ｃａｂｂａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｌｕ Ｚｈｉｂｉｎ，Ｃｈａｉ Ｘｉｎｙｉ，Ｌｉ ｑｉａｎｇ，Ｚｈｏｕ Ｌｉｎｇｌｉｎｇ，Ｈｕ Ｘｉｎｇｃｕｉ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｙｏｇｕｒｔ ａｎｄ ｓｏｕｒ ｐｉｃｋｌｅｄ ｃａｂｂａｇｅ ｉｎ ｏｕｒ ｄａｉｌｙ ｌｉｆｅ ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＭＲＳ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ，ｓｅｖｅｒａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃａｎ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍ，ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｓａｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ．ｔｈｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｔａｋｅｎ ｆ０ｒ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ－－ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｃａｌｌｅｄ ｌａｃｔｅｉｎ，ｉｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ａｎｄ ｓｔａｐｈｙ，ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ａｆｔｅｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ、Ｉａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓ￣ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｄ ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｅｃｔ ａｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ．ｆ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｙｏｇｕｒｔ；ｐｒｉｃｋｌｅｄ ｃａｂｂａｇｅ；ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ；ｌａｃｔｅｉｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ 责任编辑：殷培峰