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抗体噬菌体展示技术研究进展 2004

来源：好走旅游网

第25卷第6期2004年12月

同济大学学报(医学版)

JOURNALOFTONGJIUNIVERSITY(MEDICALSCIENCE)Vol.25No.6

　Dec,2004

　　文章编号:1008-0392(2004)06-0530-03

抗体噬菌体展示技术研究进展

综述,成国祥　审校范建华　

(同济大学医学院病原生物学和免疫学教研室,上海　200092)

关键词:抗体工程;噬菌体;展示技术

中图分类号:Q78　　　　　　文献标识码:A　　抗体工程技术随着现代生物技术的发展而不断完善,并且是生物技术产业化的主力军,尤其在生物技术制药领域占有重要地位。噬菌体抗体展示是利用基因工程技术发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术,与多克隆抗体和单克隆抗体相比,噬菌体抗体展示技术的筛选范围从几千扩增到几百万甚至几亿,而时间则从几个月缩短到几周,且操作简便,成本低廉。一旦获得有效的噬菌体抗体,也就同时获得该抗体的基因。该技术可产生单链抗体,其分子量只有天然抗体的五分之一,很容易通过细胞间隙到达靶细胞。本文就噬菌体抗体展示的基础、优点及其前导技术在生物技术领域的应用作一综述。1　基　　础

(surfacedisplayphageanti2噬菌体抗体库

bodylibrary)技术是近年来发展起来的一种抗体筛

[1,2]

体表面,被展示的多肽蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。

噬菌体展示是一种基因表达和表达产物亲和选择相结合的技术。常以一组随机多肽编码序列或基因群体插入噬菌体展示载体,形成噬菌体展示文库。其文库中,每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链,不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链。可采用亲和选择方法,高效挑选出带有外源基因的重组噬菌体,并利用这些噬菌体再感染大肠杆菌,扩增。还可从重组噬菌体DNA中切出外源基因再克隆到其它宿主细胞中,经表达以获得大量外源基因产物。噬菌体展示已证明是一有力的技术,去获得可容纳几万甚至几亿的不同肽或蛋白质的库,并已应用于重组肽库(识别肽受体配基)的亲和筛选,确定单克隆抗体的抗原表位,选择酶作用底物以及筛选克隆的全套抗体。2　优　　点

选技术。其基本原理是采用PCR等技术从小鼠杂交瘤细胞中获取抗体可变区重链和轻链基因,通过一段一段接头DNA拼接后,在与噬菌体头部蛋白G3P等基因5’段重组,通过噬菌体表面展示技术(surfacedisplay)把单链抗体(singlechainFvScFv)

利用抗体噬菌体展示技术构建和制备出的基因工程抗体,与单克隆抗体相比,具有如下优点:(1)通过基因工程技术的改造,可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应;(2)基因工程抗体的分子量较小,可以部分降低抗体的鼠源性,更有利于穿透血管壁,进入病灶的核心部位;(3)根据治疗的需要,制备新型抗体;(4)可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式,大量表达抗体分子,大大降低生产成本。

3　噬菌体展示表达系统

表达在噬菌体表面,与天然的抗体的折叠方式一样,能与抗原有效结合。由于其筛选方式及产量明显优势,所以取代传统的杂交瘤单克隆抗体技术已成趋势。

噬菌体展示一般使用丝状噬菌体,它是将外源基因插入到噬菌体展示载体上,并使其与编码噬菌体外壳蛋白基因相连接,从而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌

收稿日期:2003-09-27

作者简介:范建华(1977-),女,硕士研究生.

在丝状噬菌体表面展示外源基因的载体有两种类型的载体[3],一类包括fUSE5,fAFF1,fd2CAT1和orfdtetDOG等;一类包括pHEN1,pComb3,

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　第6期范建华:抗体噬菌体展示技术研究进展

pComb8orpSEX等。前者是一水平展示外源蛋白

片段和多肽的载体系统。单链丝状噬菌体将编码该蛋白与多肽的DNA片段插入噬菌体编码外壳蛋白

),接着的基因中(通常为PⅢ,也有PⅣ、PⅥ或PⅧ

是将融合的外壳蛋白结合到新的噬菌体颗粒上,这些颗粒是在细菌周围间隙被装配的。但对一些大分子物质如抗体、酶等,后者则显示出其优势。相比前一种载体它有更方便的连接与转化方法、并可以建立大分子文库、在引入特征性功能具有相对简单的基因操作方案。以下就第二类载体作一总结。(1)较有代表性的表达系统是美国SCRIPPS研究所的pComb3系统。曹经瑗[4]等用该表达系统成功地克

染宿主菌,增殖后再进行下一轮筛选。一般经过3-5轮这样的筛选即可得到表达高亲和性的抗体克隆。5　进　　展

隆和表达了人源性抗甲型肝炎病毒Fab段基因。该

人源性抗甲型肝炎病毒Fab抗体能与具有中和活性的鼠源性抗甲型肝炎病毒单克隆具有竞争性抑制反应。并进一步证明其有中和甲型肝炎病毒的活性。(2)pCANTAB5E系统。

为了筛选抗人丙型肝炎病毒E2蛋白ScFv,Yan2WZ[5]等用该表达系统、ELISA及免疫组化方法成功地筛选到特异性结合于丙型肝炎E2蛋白,但不与乙型肝炎病毒抗原结合ScFv抗体。

重组免疫毒素是一种融合蛋白由抗体的Fv片段和细菌或植物的毒素组成,并且被开发为肿瘤治疗的靶点。RichardB[6]等利用该表达系成功表达了MR1(Fv)-PE38,MR1(Fv)-PE38是一单链重组免疫毒素,其靶点为突变型EGFR即EGFRvI2II。

4　噬菌体抗体筛选

噬菌体抗体选择[3,4]是通过多轮“吸附-洗脱-扩增”过程,回收、富集到具特定结合力的噬菌体上。从噬菌体抗体库中筛选表达特异性抗体的经典方法主要有两种:(1)将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体;(2)将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链霉抗生物素蛋白的磁珠上对噬菌体进行筛选。这两种方法中,均需加脱脂牛奶(或BSA)封闭未被抗原占据的位点,以避免噬菌体非特异性的结合。在前一种方法中,回收与抗原特异结合的噬菌体可用碱性溶液(如三乙基胺)或酸性溶液(如甘氨酸-盐酸)洗脱,或用可溶的抗原或半抗原洗脱。在后一种方法中,主要是通过DTT破坏抗原与生物素之间的二硫键来洗脱。回收的噬菌体可再转

在近20年,抗体噬菌体展示已成为抗体工程的前导工具,起初用于从各种靶分子中分离抗体的这一技术,现已发展成用于胞外操作抗体亲和力、特异性和稳定性的有效工具。抗体噬菌体展示的最成功的应用是从大的库中进行抗体分离,为了这个目的,三种类型的抗体库可被应用。

首先,免疫抗体库[7],是指利用从特定抗原免疫的动物或人体获取的淋巴细胞为材料所构建的抗体库。免疫抗体库对于筛选特定抗原的片段抗体是非常合适的,并已用于许多物种抗体库的构建,如鼠、人、兔、绵羊和鸡等。

但由于伦理道德的约束,人体除了用有关的疫苗免疫外,是不能随意进行免疫的,因而,发展了未经免疫的抗体库。这种抗体库进一步可分为天然抗体库和合成抗体库。天然抗体库的构建方法与免疫抗体库的构建相似,区别是作为抗体基因材料的B细胞是来自未经免疫的供体。已构建的几个天然抗体库,因它们不偏向任何特定抗原,而被用来分离抗多抗原抗体。而从天然抗体库筛选抗体,库容量的大小是一个关键因素,库容量越小,其筛选的抗体亲和力越低。因此,必须构建非常大的库以获得高亲和力抗体。

第三种就是合成与半合成抗体库[8],这是一种未经免疫的抗体库,可通过在胞外装配抗体基因Ⅴ(带有D、J片段)而人工构建的。DJ片段含有编码CDR3环(具有随机序列和不同长度)的信息。从噬菌体库筛选的抗体并不总能应用于治疗或生物技术试剂,一些情况下,需要考虑到抗体的亲和力、价、特异性或稳定性,基于这些原因,噬菌体展示即被用来产生合成抗体库,并获得高亲和力抗体。

总之,噬菌体表面呈现技术在抗体工程、疫苗学等多个领域显示出广泛的应用前景,而且随着其自身的不断完善和新的载体系统的发展,必将发挥更大的作用。

[致谢　上海转基因研究中心提供的实验条件,并感谢赵建阳、陈光云老师对课题的支持]参考文献:

[1]　HyunjungB,Kyoung2hoS,Yong2hwanK.Animproved

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展[J].同济大学学报(医学版),2003,24(4):320-322.

(上接第522页)

AnAnalysisofRiskAsymmetryonDoctor2Patient’sRelationship

HAOHai1,ZHENGPie1,ZHANGShuang2de2

(1.SchoolofManagement,TianjinUniversity,Tianjin300072,China;

2.Dept.ofBasicCourses,MedicalCollegeofChinesePeople’sArmedPolice,Tianjin300162,China)

ABSTRACT:Objective　Todiscusstherelationshipofdoctor2patientonthebasisofrisk.Methods　Theevaluatedmeth2odsofriskcostandthecertaintyequivalentutilityingametheorywereadopted.Results　Theriskcostsandthecertaintyequivalentutilitiesofthedoctorandpatientwereobtainedaccordingtotheevaluatedmethods.Conclusion　Itcomestoaconclusionthattheriskisasymmetricbetweenthedoctorandpatients.Intheendtheinferiorpositionofpatientisdis2closed.Thesuggestiontoimprovetherelationshipofthedoctorandpatientisalsoputforward.KEYWORDS:　doctor2patientrelationship;riskasymmctry;riskcost

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