以丙酸钙作抑菌剂制备猕猴桃酒工艺研究

2019 Vol.38 No.5Serial No.327China BrewingResearch Report以丙酸钙作抑菌剂制备猕猴桃酒工艺研究周文「2，舒学香打张崇军蔦唐贤华1（1.四川工商职业技术学院，四川都江堰611830;2.四川大学轻纺与食品学院，四川戚都610065）摘要:该研究采用Box-Behnken响应面法对以丙酸钙作抑菌剂制备猕猴桃酒的工艺进行了优化，以最优工艺制备猕猴桃酒，对其理

化指标进行了检测，并采用顶空固相微萃取技术和气相-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）分析其挥发性风味物质成分。结果显示， 猕猴桃酒最优工艺条件为发酵温度24七，初始pH值为3.5,接种量0.09%，所得猕猴桃酒与以SO2为抑菌剂制得的猕猴桃酒具有相似

的理化性质和挥发性风味物质成分组成，但挥发性风味物质含量具有较大差别。关键词:猕猴桃酒;丙酸钙;工艺优化;理化指标;挥发性风味物质中图分类号:TS262.7 文章编号：02-5071 （2019）05-0146-06 doi:10.11882/j.issn.02-5071.2019.05.029引文格式:周文，舒学香,张崇军，等.以丙酸钙作抑菌剂制备猕猴桃酒工艺研究［J］.中国酿造,2019,39（5）:146-151.Fermentation technology of kiwi fruit wine using calcium propionate as bacteriostatZHOU Wen12, SHU Xuexiang1, ZHANG Chongjun1 , TANG Xianhua1( l.Sichuan Technology & Business College, Dujiangyan 611830, China;2.College of Light Industry, Textile & Food Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)Abstract： Calcium propionate is a commonly used food additive and nearly non-toxic to humans, which has antibacterial activity in the acidic condi­

tion but is harmless to yeast. In this study, the fermentation technology of kiwi fruit wine using calcium propionate as bacteriostat was optimized by

Box-Behnken response surface methodology. The physicochemical indexes of kiwi fruit wine produced under the optimum technology were deter­mined, and its volatile flavor compounds were analyzed by HS-SPME-GC-MS. The results showed that the optimum technology conditions were as

follows: main fermentation temperature 24 七，initial pH value 3.5 and inoculum 0.09%. The physicochemical properties and volatile flavor compounds composition of the kiwi fruit wine produced under the optimum conditions were similar to that using SO2 as bacteriostat, but the content of volatile

flavor compounds showed big difference.Key words： kiwi fruit wine; calcium propionate; technology optimization; physicochemical index; volatile flavor compounds猕猴桃发酵酒及其他果酒酿造过程中大多采用SO2 课题组前期研究发现在猕猴桃果浆中添加0.6 g/L丙酸钙

作为抑菌剂，以防止杂菌生长从而造成发酵异常甚至产生 毒素但SO2可能破坏人体的酶活力，影响人体新陈代谢，

可以起到良好的抑菌效果,且安全性更高问。在此基础上，

进一步进行发酵工艺条件的优化，并对其进行理化指标测 定,以及通过顶空固相微萃取气质联用（headspace solid phase

对肝脏造成一定的危害,SO2在酒中存在是对人体健康的 一种潜在威胁，而且过量摄入会刺激呼吸道粘膜组织，进而 诱发多种呼吸道炎症氏因此其每日允许摄入量（acceptable

microextraction-gas chromatography mass spectrometry, HS- SPME-GC-MS） 和香气成分分析评价，以获得一种风味优 良且对人体危害小的猕猴桃发酵酒非常有必要。daily intake, ADI）为 0〜0.7 mg/kg,我国国标GB 2760—20 14 《食品添加剂使用标准》规定了 SO?在果酒中的最高限量

（£0.25 mg/kg）冋,然而在规定最大量的前提下,SO：在果酒 中并不能充分的起到抗氧化及抗菌等作用［7-8］，所以寻找 SO2的替代物是有必要的。丙酸钙具有一定的抗菌活性［9］，是一种常用的食品添

加剂，在酸性条件下能够抑制细菌和霉菌而对酵母菌无害,

1材料与方法1.1材料与试剂红阳猕猴桃（都江堰）:市售;丙酸钙（食品级）:泰州市味

香源食品添加剂有限公司；安琪葡萄酒高活性干酵母BV8 1 &

安琪酵母股份有限公司；偏重亚硫酸氢钾、碳酸钙（分析 纯）：成都金山化学试剂有限公司；果胶酶、明胶（生化试

国标GB 2760—20 1 4《食品添加剂使用标准》中为规定其在 猕猴桃酒等果酒中的用量，但规定了在酱油、醋、面包等食

剂）:成都市科龙化工试剂厂。1 .2仪器与设备品中的使用量不超过2.5 g/kg［6］,ADI不作性规定。本

收稿日期：20 1 8- 12- 10

修回日期：20 1 9-04-04DHP-9 1 62型电热恒温培养箱:上海齐欣科学仪器有

基金项目：成都市产业集群协同创新项目（20 1 5-cp03003 1-nc）；四川省教育厅项目（18ZB0378）；四川工商职业技术学院项目（14NC05）

作者简介:周 文（1988-），男,工程师，博士研究生，主要从事酒类酿造及感官评价方向研究工作。2019年第38卷第5期研究报告中国酿造总第327期

・147・限公司；GCMS-QP2010型气相色谱质谱联用仪、Essentia

1.3.3感官评分标准LC-16型液相色谱仪：日本岛津公司；50/30 prn DVB/CAR/ 感官评分由5名专业人员按照表2中的评分标准进行, PDMS型固相微萃取头:美国Supelco公司。满分100分，每个酒样得分取5人平均值。感官评价方法参照

1.3实验方法GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行［12］。1.3.1猕猴桃酒制备工艺猕猴桃浆果T分选T清洗去皮T打浆T添加果胶酶T添加 表2猕猴桃酒的感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of kiwi fruit wine抑菌剂T调整PH-接种酵母T前发酵T倒罐T后发酵T澄清T 降酸T陈酿T过滤T猕猴桃酒项目评价标准得分清亮、透明、金黄色、有光泽15〜20添加果胶酶:猕猴桃果浆初始糖度16.5 °Bx，初始pH 外观（20分）较清亮、金黄色、无明显悬浮物10〜153.47；果胶酶添加量100 mg/L，于40 °C恒温处理1 d；浑浊、失光、有明显悬浮物或沉淀物0〜10添加抑菌剂：以丙酸钙为抑菌剂添加量为0.6 g/L，以 香气协调、具猕猴桃典型香气30〜35SO2 （偏重亚硫酸氢钾按50%SO2当量计）［11］为抑菌剂添加 香气20〜30量为 80 mg/L；（35 分）香气较协调、无异杂味香气不足、有明显异味0〜20干酵母活化:活性干酵母中加入10倍含4%蔗糖的38 C

酒体酸甜适度、口感柔和细腻40〜45温水，活化30 min；口感 分）酒体酸甜较适度、口感较好、无明显异味30〜40前发酵:接种后发酵至猕猴桃浆糖度5 °Bx，结束前发

（45酒体具明显异味、口感不适0〜30酵进行转罐后发酵；后发酵:后发酵温度15 C,时间15 d；1.3.4理化指标检测方法澄清:按30 mg/L的量向猕猴桃原酒中加入明胶；酒精度、总糖、总酸、SO2含量问测定:参照GB/T 15038— 降酸:用碳酸钙降酸至5〜6 g/L （酒石酸计）；

2006備萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。陈酿、过滤：4 C陈酿30 d,过滤后得猕猴桃酒成品。丙酸钙含量测定问:参照GB 5009.120—2016《食品中

1.3.2发酵工艺优化丙酸钠、丙酸钙的测定》,采用液相色谱法测定。（1） 单因素试验1.3.5 HS-SPME-GC-MS条件［14\"呵主发酵温度优化：调整猕猴桃果浆pH至3.5，接种量

样品处理:取样前先将萃取头插入气相色谱质谱联用

0.08%，分别于 18 °C、20 °C、22 °C、24 °C、26 C 培养箱中进 仪（gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS）进样 口， 行主发酵，对制得的猕猴桃酒分别进行感官评分。250 C老化2 h。将猕猴桃酒样吸取5 mL装入15 mL顶空瓶

初始pH值优化:接种量0.08%，用柠檬酸或碳酸钙分 中,并迅速加入1.0 g NaCl,加盖密封，置于40 C水浴锅中 别调整初始pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0,于24 C培养箱中进

平衡20 min。将老化好的萃取针插入顶空瓶,40 C水浴中 行主发酵，对制得的猕猴桃酒分别进行感官评分。萃取40 min后插入GC-MS进样口,于250 C解吸5 min。主发酵接种量优化:调整猕猴桃果浆pH至3.5，分别调 色谱条件:色谱柱整接种量为 0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%,于24 C 培养

”KB-5MS毛细管柱（30 mx0.25 mmx 0.25 m）；进样口温度250 °C；程序升温:初始温度40 C保

箱中进行主发酵，对制得的猕猴桃酒分别进行感官评分。持2 min,以2 °C/min的速率升温至80 C后，以5 C/min的速 （2） 响应面分析率升温至150 C后，再以10 C/min的速率升温至250 C,保

在单因素试验的基础上，以感官评分为评价指标进行 持5 min；以氦气为载气，流速1 mL/min,分流比1：7。研究和分析,并确定3因素3水平的最佳参数进行响应面分 质谱条件:电子轰击离子源；离子源温度280 C ；电子 析，各因素及水平编码见表1。能量70 eV；扫描范围：30〜450 u。数据处理：采集到的质谱图利用NIST08谱库进行检 表1猕猴桃酒制备工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for

索,对各色谱峰按面积归一化法进行相对定量。kiwi fruit wine production tech nology optimization2结果与分析水平2.1单因素试验结果分析因素 --101根据试验设计分别进行了发酵温度、初始pH值、接种量 X发酵温度/C22246对主发酵影响的单因素试验，其结果分别如图1〜图3所示。Y初始pH值3.03..0由图1可知，随着发酵温度的升高，猕猴桃酒的感官质 Z接种量/%0.060.080.10量随之提升，当温度升至24 C时猕猴桃酒的质量最好，当温

・148・

2019 Vol.38 No.5Serial No.327

China BrewingResearch Report度达到26 °C时酒质又有所下降。其主要原因在于，当发酵 温度偏低时,酵母菌繁殖速度较慢，主发酵启发时间延长,

酸度增加，口感变差。当初始pH值超过3.5时，随着初始pH 值的升高猕猴桃酒品质大幅下降，其主要原因在于，随着

从而导致发酵时间延长，染杂菌机会增加,使猕猴桃酒发

初始pH值的升高丙酸钙的抑菌效果急剧下降，在酸性条

霉或酸度明显增加。当温度超过24 C时，由于酵母增殖快, 导致衰亡速度增加，发酵中止快产酸增加［I】】，同时高级醇

件下丙酸钙游离产生的丙酸分子可穿透霉菌的细胞壁,

抑制细胞内酶的活性，从而阻碍霉菌等杂菌的增殖［17］，初 始pH值越低产生的丙酸分子越多，抑菌效果越好。当初始

等副产物增多，导致酒质下降。pH值达到5.0时可看到猕猴桃酒大量发霉。9088 86 84由图3可知，当接种量V 0.08%时，随着接种量增加猕

猴桃酒的品质逐渐变好，主要原因在于当接种量较低时，发

酵初始阶段酵母菌没有占据发酵优势，导致杂菌的生长，酒 的品质变差。当接种量＞0.08%以后猕猴桃酒的质量趋于 平稳且略有下降,其原因是接种量增大，发酵后期酵母死

82亡自溶增加,给猕猴桃酒带来了一定的酵母味。18

20

22

24 262.2 Box-Behnken响应面试验利用Deign-Expert8.0.6软件进行了响应面试验分析设

发酵温度/°C计，其设计方案及结果如表3所示，回归模型方差分析见 表4。通过软件对表3进行回归拟合得到感官评分(R)与影 响发酵3因素发酵温度(X)、初始pH值(Y)、接种量(的

图1发酵温度对猕猴桃酒质量的影响Fig. 1 Effect of main fermentation temperature on the quality of

kiwi fruit wine92908886 84 82 80回归方程：R=90.8-0.063X-0.19Y+1.38Z0.62XY-4.96X2-3.21Y2-1.59Z2表3猕猴桃酒发酵工艺优化Box-Behnken试验结果与分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments for

ferme ntation tech nology optimization of kiwi fruit wi ne试验号XYZ感官评分/分13.0

3.5

-1-1-10000-1-183.083..0 4.5 初始pH值5.021-1311000083.081.082.图2初始pH值对猕猴桃酒质量的影响1-1Fig. 2 Effect of initial pH on the quality of kiwi fruit wine929190O88561-183.085.5711-1-1100000000086.084.5-1.BM87®86858483101-185.087.087.591.511121311000001000000.04 0.06 0.08

接种量/%0.10 0.1214151690.091.090.5图3接种量对猕猴桃酒质量的影响Fig. 3 Effect of inoculum on the quality of kiwi fruit wine1791.0由图2可知，初始pH值为3.5时发酵所得猕猴桃酒品质最 佳，当初始pH值低于3.5时酵母菌的发酵作用受到了一定的

通过软件对模型进行方差分析及回归系数显著性检

验,其结果如表4所示。由表4可知通过响应面优化后得到的

抑制，且因为调酸加入了一定量的柠檬酸导致猕猴桃酒的

模型极显著(PV0.01),说明该模型可信。失拟项P=0.198 5,

研究报告中国酿造2019年第38卷第5期总第327期

表4回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model・149-影响不显著（P〉0.05），复相关系数疋=0.980 6,仅有0.01% 不能由该模型解释,信噪比16.148〉4。综合以上分析，可知

该模型能够很好的拟合试验结果［18-20］。由表4可以看出，一 次项中X（发酵温度）、Y（初始pH）影响不显著（P〉0.05），

项目平方和自由度均方F值Pr>F<0.000 1模型1.29921.0339.39Z（接种量）影响极显著（PV0.01）；二次项X?、Y、Z均极显 著（PV0.01）；交互项XY、XZ、YZ均不显著（P〉0.05），说 明影响发酵工艺的3个因素之间没有明显的交互作用。通 过F值推断试验范围内各因素对试验结果影响的重要性,

XY0.0311111111110.0310.0590.815 80.491 50.001 10.130 90.2815.131.560.2815.130.5328.33ZXYXZYZX2Y21.562.930.0000.000103.6943.450.0000.000103.6943.450.0000.000194.201.000 01.000 0可知各因素对感官评价影响的主次顺序是接种量〉发酵

温度〉初始pH。借助Design-Expert 8.0.6软件获得主发酵温度、初始pH 和接种量对感官评分影响的三维响应面曲线，结果见图4。

<0.000 1<0.000 181.3819.872.50Z210.6110.610.002 90.198 5残差失拟项净误差总和根据软件分析，可以得出以丙酸钙作为抑菌剂制备猕猴桃

3.747340.532.441.30193.030.81发酵酒的最优工艺条件为发酵温度23.99 °C，初始pH3.49, 接种量0.09%，在此条件下制备的猕猴桃发酵酒感官评分

0.3216预测值为91.1。92908886848280R2=0.980 6图4初始pH值、接种量以及发酵温度交互作用对感官评分影响的响应面与等高线Fig. 4 Response surface plots and contour line of effects of in itial pH, inoculum and ferme ntation temperature on sensory score2.3响应面验证试验及理化指标分析根据实际操作条件，将发酵条件调整为主发酵温度 24兀，初始pH3.5,接种量0.09%，在此条件下以丙酸钙为 抑菌剂（A）进行验证试验，同时对该条件下制得的猕猴

从表5可以看出，分别以丙酸钙和SO?作为抑菌剂制得 的猕猴桃酒具有相似的感官评分，且酒精度、总糖、总酸三

个主要理化指标检测结果相近。说明丙酸钙可以替代传统 猕猴桃酒生产中使用的抑菌剂SO?，制得了猕猴桃酒具有相 近的感官和理化性质，为猕猴桃酒的生产提供了一种新的 方法和思路。以丙酸钙为抑菌剂制得的猕猴桃酒中丙酸钙含

桃酒进行了理化指标分析，并与同样条件下以SO2为抑 菌剂CB）制得的猕猴桃酒进行了对比分析，其结果如表5 所示。表5最适条件下制得猕猴桃酒的理化指标分析Table 5 Physicochemical indexes analysis of kiwi fruit wine

produced under optimal conditions量为1.625 g/kg，符合我国食品添加剂使用标准⑹中的要求。

2.4香气成分分析采用顶空固相微萃取-气相-质谱联用技术（HS-SPME-

GC-MS） 分别对以丙酸钙和SO2作为抑菌剂制得的猕猴桃 酒进行香气成分分析，其总离子流色谱图如图5所示。项目AB感官评分酒精度/%vol91.59.292.08.9从图5可以看出，不同的猕猴桃酒挥发性风味成分的 GC-MS总离子图谱极其相似，香气成分的出峰时间几乎完

总糖/(g・L-1)总酸/(g・L-1)5.245.52未检出5.385.46162.85全相同，说明两种猕猴桃酒的挥发性风味成分组成差异不 大，由此表明使用不同的抑菌剂对猕猴桃酒挥发性风味成

总 SO2/(mg1.6250.125气成分对应峰进行定量分析，其结果如表6所示。•150*

2019 Vol.38 No.5Serial No.327China BrewingResearch Report杏子香气，癸酸乙酯具有葡萄的水果香气旳。以丙酸钙为抑

(90X)菌剂制备的猕猴桃酒丙酸乙酯、3-甲基丁酸、苯乙醇、苯甲 酸甲酯、2-乙基苯酚、苯甲酸乙酯的含量更高一些,特别是

鰹卅

丙酸乙酯增加较多，其主要原因在于丙酸钙溶解于酸性溶

液中生成丙酸，丙酸与酵母菌发酵产生的乙醇发生酯化反 应而生成大量丙酸乙酯，丙酸乙酯具有菠萝香味,可用作

食品加香剂,GB 2760—2014规定为允许使用的香料，常用

作于配制朗姆酒、白酒、菠萝型香精等。两种酒的挥发性风

时间/min味成分含量不同，说明使用不同的抑菌剂制备猕猴桃酒对

TIC10以SO2作抑菌剂酒的风味具有一定的影响。1.25 -1.00-0.75 -(90IX)3结论通过单因素试验和响应面试验优化得出，以丙酸钙作

211为抑菌剂制备猕猴桃发酵酒的最优工艺条件为发酵温度

0.50-24兀，初始pH值为3.5,接种量0.09%。在此优化条件下，实

际验证猕猴桃发酵酒的感官评分为91.5分。0.25 -

13L...45

579以丙酸钙为抑菌剂在最优工艺条件下制得的猕猴桃

10 15 20 25 30 35 40 45时间/min酒与以SO2为抑菌剂制得的猕猴桃酒相比较，在酒精度、总 糖、总酸三个主要理化指标检测结果相近,说明丙酸钙可

1为丙酸乙酯;2为3-甲基亠丁醇;3为丁酸乙酯；4为乙酸3-甲基-1 丁酯;

5为己酸乙酯；6为苯甲酸甲酯;7为苯乙醇；8为2-乙基苯酚；

9为苯甲酸乙酯；10为辛酸乙酯；11为癸酸乙酯。图5不同抑菌剂制得猕猴桃酒的香气成分的GC-MS总离子流图以替代传统猕猴桃酒生产中使用的抑菌剂SO?。通过香气

成分比较发现，两种猕猴桃酒主要挥发性风味成分组成类

似，由于丙酸钙的添加使猕猴桃酒中丙酸乙酯大量增加, 不同抑菌剂制得猕猴桃酒的挥发性风味成分含量有差别

Fig. 5 Total ions chromatogram of aroma components of kiwi fruit

wine produced by different bacteriostats by GC-MS导致风味存在一定差别。以丙酸钙为抑菌剂制得的猕猴桃酒中丙酸钙含量为

表6不同抑菌剂制得猕猴桃酒的香气成分对照Table 6 Comparison of aroma components of kiwi fruit wine

1.625 g/kg,达到了我国食品添加剂使用标准中的要求，说

明用此法生产猕猴桃酒是安全可行的。produced by different bacteriostats序号1保留时间/min2.70化合物 -相对百分含量/%A#B#参考文献：[1] YU F, MICHAEL C Q. Sensitive quantification of sulfur compounds in

丙酸乙酯32.245.378.397.8718.4410.16.16233.344.7.9714.933-甲基-1-丁醇丁酸乙酯乙酸3-甲基-1 丁酯wine by headspace solid-phase microextraction technique [J]. J Chro -

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猴桃酒；“-”表示未检出。[6] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 2760—2014食品安

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