LC_MS_MS法测定血浆中利奈唑胺浓度方法学确证

孙纯广1, 张述雷2, 白楠2,蔡芸2,梁蓓蓓2, 史录文1*,王睿2* 1. 北京大学 医学部药事管理与临床药学系 北京 100191

2. 总医院 临床药理研究室 北京 100853

[摘要]目的：建立高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中利奈唑胺浓度的方法。方法：以呋喃唑酮作为内标，血浆样品经乙腈沉淀蛋白提取分离。结果：利奈唑胺测定在20～4000ng•mL-1线性良好,最低定量限为20ng•mL-1，提取回收率在90%～98%之间，日内、日间精密度均在88.53%～110.7%之间，准确度（RSD）均≤6.83%。结论：建立的LC-MS/MS方法专属性强，灵敏度高，操作较以往简洁，快速，定量准确，实用性强，适合于利奈唑胺药代动力学测定。

关键词: 利奈唑胺；液相色谱质谱法；血浆；浓度

Determination concentration of linezolid in human

plasma by HPLC-MS/MS

SUN Chun-guang1, BAI Nan2, CAI Yun2, LIANG Bei-bei2, ZHANG Shu-lei2,

WANG Rui2, SHI Lu-wen1*

1. Department of Pharmacy Administration and Clinical Pharmacy, Peking University Health Science Center; Beijing 100191

2. Department of Clinical Pharmacology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853

[Abstract]: Objective To establish a HPLC-MS/MS method for determining

linezolid concentration in human plasma. Methods With furazolidone as internal standard, plasma samples extracted by acetonitrile. Results Determination of linezolid has good linearity in the 20-4000 ng•mL-1, lower limit of quantification is 20ng•mL-1, extraction recovery is 90% to 98%, accuracy is 88.53% to 110.7%, and precision (RSD) ≤6.83%. Conclusion: The established LC-MS/MS method is specific, sensitive, and simple, fast, accurate and suitable for determination of Linezolid in human plasma.

作者简介：孙纯广（1987-），男，研究生，主要从事临床药学工作 通讯作者：史录文，教授，博士生导师 E-mail：shilu@bjmu.edu.cn

王睿，研究员，博士生导师 E-mail：wangrui301@vip.sina.com

Key words: Linezolid; HPLC-MS/MS; human plasma; concentration

利奈唑胺(linezolid)是第一个应用于临床的新型唑烷酮类抗菌药物, 该药作用机制独特，与其他药物无交叉耐药性[1]，年龄、性别对药代动力学没有明显影响，对大多数G＋菌包括多重耐药的肠球菌属、葡萄球菌属和肺炎链球菌等具有很好的抗菌作用[2]。2007年9月在我国正式应用临床[3]。目前尚未有在中国人群的药代动力学研究，本文通过建立LC-MS/MS法检测利奈唑胺的血药浓度，为研究利奈唑胺在中国人群中的药代动力学特点提供方法学依据。

材料与方法

1．药品、试剂及仪器

利奈唑胺注射液标准品，批号：09D21Z31, 美国辉瑞公司提供；内标(internal standard, IS)：呋喃唑酮（Furazolidone），纯度为99.9%，购自美国sigma-aldrich公司；乙腈，HPLC Grade, 购自Fisher公司。

Agilent 10三重四级杆质谱仪，配有电喷雾电离源（ESI）；Agilent 1200Series高效液相色谱仪（G1322A脱气层，G1312B二元泵，G1367C自动进样器，G1316B柱温箱），以及Agilent MassHunter Workstation B.01.04(B84)数据采集和处理系统。YKH-II型混匀机（江西医疗器械厂）；Anken TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；Synergy®UV超纯水系统（法国MILLIPORE公司）； XS105型天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）；200/1000μL微量加样器(法国Gilson公司)。

2.色谱与质谱条件

前置柱为ZORBAX EP-C18柱（2.1×15mm，3.5μm，美国Agilent公司）；色谱柱为Eclipse Plus C18柱(2.1×100mm，3.5μm，美国Agilent公司)；流动相为乙腈-水（50:50，v/v）；流量为0.3 ml·min-1；进样量为2μL；柱温为35℃。

离子源： ESI源；检测方式：正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM)；毛细管电压为3500V，干燥气温度为350℃，离子源雾化气（N2）流量为10L﹒338.2 min-1，雾化气压力为38psi；用于定量分析的离子对分别为利奈唑胺 m/z →m/z 296与呋喃唑酮m/z 226.1 →m/z 122；扫描时间100ms。碎裂电压分别为

140V（利奈唑胺）和115V（内标，呋喃唑酮）；碰撞能：利奈唑胺15eV,呋喃唑酮20eV。

3. 血浆样品处理方法

样品从-80℃冰箱取出后，室温下自然融化。精密吸取的血浆样品100μL及200ng•mL-1内标储备液100μL加入800μL乙腈中，涡旋混匀1min后，在13000r·min-1下离心10min，取上清液150μL加入棕色样品瓶避光进行LC-MS/MS分析。

4.利奈唑胺血浆样品标准曲线的制备

以利奈唑胺注射液（2mg·mL-1）为储备液，放置于干燥避光恒温20℃的药品柜中保存。取空白血浆，精密吸取利奈唑胺储备液适量，制成终浓度为20, 100, 200, 500, 1000,2000,4000ng•mL-1 的系列血浆样品，-20℃冰箱保存待测。按“血浆样品处理方法”处理后进样测定。

结果

1 方法学评价 1.1 方法特异性

取6名受试者给药前空白血浆，除不加内标外，按照“血浆样品处理方法”处理，得到典型谱图（图A），结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰利奈唑胺和内标呋喃唑酮的测定。取一定浓度的利奈唑胺血浆溶液加入内标，按照“血浆样品处理方法”处理，得到色谱图（图B、C、D）。利奈唑胺和内标呋喃唑酮的保留时间分别为1.02min和1.20min。取受试者给药后2h血浆样品1例，加入内标，按照“血浆样品处理方法”处理，得到色谱图（图E）。

x101+ TIC MRM (** -> **) bp07.d 21x10

112+ TIC MRM (** -> **) bp09.d 11x101+ TIC MRM (** -> **) bp11.d 21x101+ TIC MRM (** -> **) bp12.d 10x10

111+ TIC MRM (** -> **) bp05.d 10.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.9511.051.11.15Counts vs. Acquisition Time (min)

1.21.251.31.351.41.451.51.551.61.651.71.751.81.851.91.95221 A

x10343.532.521.510.50+ TIC MRM (** -> **) 50ppb-02.d110.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.951.051.11Counts vs. Acquisition Time (min)1.151.21.251.31.351.41.451.51.551.61.651.71.751.81.851.91.952

B

x103+ MRM:1 (1.029 min) (338.20001 -> **) 50ppb-02.d 2.92.82.72.62.52.42.32.22.121.91.81.71.61.51.41.31.21.110.90.80.70.60.50.40.30.20.10200210220235.00000x10287.576.565.5.3.532.521.510.50+ MRM:2 (1.212 min) (226.10001 -> **) 50ppb-02.d 122.00000139.00000296.00000230240250260270280290Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

3003103203303403509095100105110115120125130135140Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

145150155160165 C D

MRM (** -> **) Linezolid-30min-01-2hr.d x104+ TIC3.53.2532.752.52.2521.751.51.2510.750.50.25110.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.9511.051.11.151.21.251.31.351.41.451.51.551.61.651.71.751.81.851.91.95Counts vs. Acquisition Time (min)

2 E

图1. 利奈唑胺和呋喃唑酮（内标）的MRM色谱图

Figure 1． Chromatograms of linezolid and furazolidone (IS) by MRM mode A. MRM chromatogram of six healthy volunteers’ blank plasm; B.MRM chromatogram of linezolid (C=50 ng•mL-1) in human plasma spiked with furazolidone; C, Spectrum of product ion pair for linezolid；D，Spectrum of product ion pair for furazolidone; E. Chromatogram of sample 2 hrs after drug administration

1.2标准曲线和定量范围

按标准曲线制备项下进样，以利奈唑胺浓度为横坐标，系列标准血浆样品测得的利奈唑胺的峰面积（AS）与内标呋喃唑酮的峰面积（AIS）比值AS/AIS为纵坐标，用加权（w=1/c2）最小二乘法进行回归运算，求得标准曲线回归方程为AS/AIS=4.9153x-0.0241 (R2=0.9996);线性范围20ng~4000ng•mL-1（信噪比S/N>55.92）。 1.3定量下限

将20ng•mL-1的利奈唑胺待测物进行6样本分析，并根据当日的标准曲线

求得每一样本的浓度，求得利奈唑胺该浓度下的均值为20.37ng•mL-1，标准差（±SD）为0.105,相对标准差（RSD）为5.2%，准确度为95%～108%。结果证明，该方法下利奈唑胺待测物浓度定量下限可达到20ng•mL-1。 1.4准确度和精密度

分别配制浓度为50、400、2000 ng•mL-1的血浆样品作为质控（QC）样品，按血浆样品处理方法项操作，每一浓度平行配制测定6个样本，连续测定3d，根据当日的标准曲线测定QC样品浓度，计算准确度和精密度（RSD），结果见表2，结果表明日内准确度均在88.53%～110.7%之间，日间准确度均在92.16%～107.87%之间，日内精密度(RSD)均≤6.50%，日间精密度(RSD) 均≤6.83%，符合相关标准，证明方法学准确度，精密度良好。

表1 测定血浆中利奈唑胺的精密度和准确度

Table 1 Precision and accuracy of linezolid in human plasma

Item

Nominal

concentration(ng·mL-1)

Calculated concentration (ng·mL-1)

Precision (%)

Accuracy (%)

50 49.9±0.20 3.93 99.82±3.93

Intra-day

400 410.2±0.39 0.96 102.5±0.98 2000 2135.9±3.74 1.75 106.79±1.87 50 49.5±0.34 6.83 98.91±6.75

Inter-day

400 407.4±1.55 3.79 101.8±3.86 103.44±3.43 2000 2068.8±6.87 3.31

1.5样品稳定性

1.5.1利奈唑胺稳定性

利奈唑胺高、中、低3个浓度（2000、400和50ng•mL-1）的血浆样品在不同保存条件下的稳定性4样本考察。

1）

室温稳定性 利奈唑胺血浆样品按照“血浆样品处理方法”制备成

待测物后，室温放置前与放置8h后浓度比较，计算结果见表3，符合要求，表明利奈唑胺待测物室温放置8h后稳定。

表2 待测物室温放置8h后药物稳定性

Table 2 Stability of Linezolid put in normal temperature 8 hours（n=4）

5ng•mL-1 40 ng•mL-1 200 ng•mL-1

Relative Error(%)

RSD(%)

0.±1.76 10.93±2. 3.83±1.09 1.77 2.49

1.03

2）

血浆样本冻融稳定性 含药血浆样本经历3次-80℃反复冻融后浓

度与冻融前样品比较，计算结果见表4，表明药品在血浆中-80℃反复冻融3次稳定。

表3 3次反复冻融后药物稳定性

Table 3 Stability of Linezolid after 3 times repeated freezing and thawing（n=4）

50ng•mL-1 400 ng•mL-1 2000ng•mL-1

Relative Error(%)

RSD(%)

4.48±9.11 7.21±4.06 3.00±4.37 3.77

3.49 4.38

1.5.2 内标稳定性

呋喃唑酮乙腈溶液（200ng•mL-1）在4℃冰箱保存的稳定性。分别于4h和20h取出储备液用乙腈稀释到20ng•mL-1,进行样本分析。结果表明，内标呋喃唑酮乙腈溶液在室温（20℃）避光放置4h和20h峰面积比较，相对偏差（RE）为1.58%±0.82%，表明内标20℃放置20h稳定。 1.6 提取回收率

将血浆与乙腈1:9（v/v）比例混合，涡旋混匀1min，13000r·min-1离心10min,取上清液，采用倍比稀释法，用刚刚制得的上清液将利奈唑胺储备液稀释成高、中、低三个浓度（2000、400和50 ng•mL-1）的待测物，每一浓度平行

配制测定4样本，得到相应峰面积，与当日高、中、低三个浓度的质控（QC）样本的峰面积比较，计算提取回收率。高、中、低三个浓度药物的提取回收率、精密度见表5，可见测定的精密度良好，提取回收率结果比较稳定。

表4 提取回收率及精密度

Table 4 Absolute recovery of linezolid (n=4)

50ng•mL-1 400ng•mL-1 2000ng•mL-1

Abosolute recovery(%)

RSD(%)

90.02±3.32 .±2.81 97.97±3.46

3.69 3.14 3.

1.7 稀释效应

配制利奈唑胺20、4和0.5μg·mL-1三个浓度的血浆溶液，再用血浆分别稀释10倍，配制为2000、400和50ng•mL-1的利奈唑胺血浆溶液，按照“血浆样品处理方法”配制的高、中、低三个浓度的待测物，进行4样本分析，用当日标准曲线定量，计算稀释对测定药物含量的影响。10倍稀释样本的药物高、中、低浓度与理论值比较（表5），结果表明稀释对血浆中利奈唑胺的测定的精密度良好，影响在可接受范围之内。

表5 稀释效应对血药浓度的影响

Table 5 Dillution effect on determination of linezolid（n=4）

Dillution effect

Accuracy(%) RSD(%)

50ng•mL-1 400ng•mL-1 2000ng•mL-1

86.44±4.22 99.11±1.51 106.38±2.08

4.88 1.52 1.95

2. 方法学应用实例

健康受试者血浆样品测定 将血浆样品按照“血浆样品处理方法”制备成待测物，同时每天建立一组标准曲线，均匀将2样本高、中、低三个质量控制样本穿插在样品待测物中，根据当日标准曲线计算未知样品浓度和质量控制浓度，至少67%质量控制样本相对偏差在±15%以内，且相对偏差超出±15%的质量控制样本不是同一浓度，当日数据方可接受。图2为1名健康受试者2h静脉滴注300mg linezolid后血药浓度-时间图，本批次样品测试中均匀穿插双样本的QC样本（2000、400和50 ng•mL-1），低浓度QC样本偏差＜20%，其他浓度偏差＜15%，符合质量控制标准。

图2 .1名受试者2h内滴注300mg linezolid后血药浓度-时间图

Figure 2. Linezolid concentration – time curves of 1 volunteer who were given linezolid 300mg/600mL in 2 hours.

讨论

利奈唑胺是新型噁唑烷酮类(oxazohdinone)抗菌药物，目前国外利奈唑胺的临床试验和药代动力学研究比较广泛，其药代动力学特征得到了充分的描述，人体药动学研究结果显示，健康人口服利奈唑胺后吸收快速且完全，生物利用度达100％[4]。国内外对测定利奈唑胺浓度有微生物法[5]、高效液相色谱[6-9]等报道。微生物法操作复杂、专属性不强，而高效液相色谱法定量限较高、灵敏度较低。目前国内尚未见到用HPLC-MS/MS测定血药中利奈唑胺浓度的相关报道，而国外用HPLC-MS/MS测定其浓度的方法学报道也较少[4]。

本实验建立了LC-MS/MS检测人血浆中利奈唑胺浓度方法，采用质谱检测特异性强，可信度较高；定量限底，灵敏度高，并且本方法较以往的检测方法有如下改进：1）标准曲线各浓度点与检测系统检测性能相适应，线性良好，定量准确。实验过程中曾尝试将定量上限提高到10μg·mL-1，所得标准曲线线性较差，经过反复测试，高浓度点药物浓度明显规律性偏离拟合直线，实测浓度低于理论浓度，且色谱柱上药物残留严重，谱图基线明显升高，对离子源，毛细管，四级杆，八级杆造成污染；定量下限在实际应用中能够检测到给药后3～5个半衰期[10]的药物浓度，完全符合应用中的定量需要，无需再降低检下限。2）本文中改进了以往文献报道的血浆处理方法，避免以往使用固相萃取法的，可提高利奈唑胺的回收率；不使用氮吹法处理样品，利用前置柱过滤样品中大粒径的物质，避免大粒径物质堵塞色谱柱；改进血浆处理方法后操作步骤后，减少了定量操作

的步骤，使定量更准确，血浆处理更方便，处理效率更高，大大提高实际测定样品浓度的实用性。3）流动相的选择：使用乙腈：水（50:50，v/v），药物与内标物保留时间短，分离度好，谱图峰型标准，检测周期短；实验过程中曾尝试加入甲酸、甲酸胺离子抑制剂，对谱图基线降低有一定效果，但同时也大大降低了药物峰响应值，并且对峰型无明显改善，不能提高性噪比，未改善定量准确度。因此本实验最终采用乙腈：水（50:50，v/v）作为流动相，其可在1min内将血浆中内源性物质洗脱出，且不影响药物的检测和药物峰的峰型。

在临床应用中，该方法可以高效，准确的测定血药中利奈唑胺的浓度，适用于利奈唑胺药代动力学测定。

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