Hefei University
本科毕业论文
BACHELOR DISSERTATION
论文题目： 植物油中抗氧化剂TBHQ检测方法研究_ _ 学位类别： 工 学 学 士__________________________ 学科专业： 食 品 科 学 与 工 程_________________ 完成时间： 2013 年 5 月_______________________
食品科学与工程毕业论文
目 录
摘 要 ....................................................................... I Abstract ................................................................... II 1引言 ...................................................................... 1
1.1 研究意义 ......................................................... 1 1.2 抗氧化剂的概述 ................................................... 1 1.3 抗氧化剂分类以及作用机理 ......................................... 2
1.3.1 抗氧化剂的分类 ............................................. 2 1.3.1.1 水溶性抗氧化剂 ......................................... 2 1.3.1.2 油溶性抗氧化剂 ......................................... 2 1.3.2 抗氧化剂的作用机理 ......................................... 2 1.3.2.1自由基清除剂 ............................................ 2 1.3.2.2 黄酮类抗氧化剂的作用机制 ............................... 3 1.3.2.3 氧化强化剂清除剂 ....................................... 3 1.4 抗氧化剂的提取方法 ............................................... 3
1.4.1 比色法 ..................................................... 3 1.4.2 电分析法 ................................................... 4 1.4.3 气相色谱-质谱法 ............................................ 4 1.4.4 液相色谱法 ................................................. 4 1.4.5 气相色谱法 ................................................. 4 1.5 TBHQ的性质与用途 ................................................ 5
1.5.1 TBHQ的性质 ................................................. 5 1.5.2 TBHQ在植物油脂中的用途 ..................................... 5
2 材料与方法 ............................................................... 6
2.1 实验仪器 ......................................................... 6 2.2实验材料与试剂 ................................................... 6 表2-2 实验材料与方法 ............................................... 6 2.3 实验方法（国标方法GB/T5009.30） ................................. 7
2.3.1 实验操作流程 ............................................... 7 2.3.2 实验操作预处理 ............................................. 7 2.3.2.1 TBHQ标准品预处理 ....................................... 7 2.3.3 色谱柱条件 ................................................. 7 2.3.4 标准曲线的建立 ............................................. 8 2.3.4.1 标准品储备液的配制 ..................................... 8 2.3.4.2 标品进样检测 ........................................... 8 2.3.5 样品含量测定 ............................................... 8 2.4 样品预处理优化实验 ............................................... 8
2.4.1 提取溶剂选择 .............................................. 9 2.4.2 提取条件优化 .............................................. 9 2.4.2.1 单因素实验 ............................................. 9 2.5 实验结果评定 ................................................... 10
2.5.1 精密度测定 ............................................... 10 2.5.1.1 采用国标方法精密度测定 ................................ 10 2.5.1.2 采用优化后方法精密度测定 .............................. 11
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2.5.2 回收率测定 ................................................ 11 2.5.2.1 采用国标方法测定回收率 ................................ 11 2.5.2.2 采用优化处理方法测定回收率 ........................... 11
3结果与分析 ............................................................... 12
3.1气相色谱法绘制叔丁基对苯二酚（TBHQ）的标准曲线 .................. 12 3.2 样品中含量的测定 ................................................ 13 3.3 优化实验条件 .................................................... 13
3.3.1 提取溶剂的优化 ............................................ 13 3.3.2 提取条件优化 ............................................. 14 3.3.2.1 单因素实验 .............................................. 14 3.4 精密度测定 ...................................................... 17
3.4.1 国标方法精密度测定 ........................................ 17 3.4.2 优化处理方法精密度测定 .................................... 18 3.5 回收率的测定 .................................................... 20
3.5.1 国标方法测定回收率 ........................................ 20 3.5.2 优化处理交表回收率测定 .................................... 20
4 讨论和结论 ............................................................... 21 参考文献 ................................................................... 22 致 谢 ...................................................................... 24 附录 ....................................................................... 25
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摘 要
TBHQ（叔丁基对苯二酚）是抗氧化剂中的一种，且广泛添加于食用植物油中，具有较强的抗氧化能力。本文研究了利用乙醇对植物油中的叔丁基对苯二酚（TBHQ）进行提取，并对溶剂的使用量、混合时间、提取次数、水浴温度等条件对GC分析测定TBHQ的影响，通过正交试验，得出最优的预处理条件为溶剂使用量为6mL、混合时间为2min、提取次数为2次、水浴温度为80℃，利用气相色谱方法对其含量进行测定。最后利用精密度和回收率对该实验进行判定分析，得出该实验的相对标准偏差RSD＜5%，平均回收率为82.3%-94.2%，结果较好。该方法具有简便、快速、准确、无毒等优点，应用广泛，具有很大的研究意义。
关键词：抗氧化剂；TBHQ；分离；气相色谱
I
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Abstract
Tert-butyl hydroquinone is one kind of antioxidants which has strong capacity of antioxidant and it is widely added in vegetable oil. The article describles the tert-butyl hydroquinone is extracted by ethanol in vegetable oil . The orthogonal test is about consisting the factors of the amount of solvent used , the mixing time , the extraction times and water bath temperature . On the basis of this,we can get the results of the derived optimum conditions as the amount of solvent used is 6mL , the mixing time is 2 minites , and extracts 2 times, water bath temperature is 80℃，its content determination by gas chromatography method. Finally, using the precision and recovery analysis the result of the experiment. The RSD＜5%,the average recovery was 83.4%-93.5% with better results. The method is simple ,rapid,accurate,non-toxic and so on and it is widly used and of great significance.
Key words: Antioxidants; Tert-butyl hydroquinone; Extraction; Gas chromatography
II
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1引言
1.1 研究意义
在日常生活中，油脂是我们的必需品，它富含不饱和脂肪酸，对我们身体健康有益。但是它存在一个问题就是若将油脂敞开放置在空气中，过一段时间，它将产生一种特殊的味道，俗称“哈喇味”。油脂为什么会发生这种状况，这是因为油脂发生氧化酸败的结果。油脂的酸败一般分为两种方式，即水解酸败和氧化酸败[1]。水解酸败是指低碳脂肪酸的油脂在水分或酶的作用下发生水解使油脂中游离脂肪酸含量增加，并产生恶臭的气味。氧化酸败是指油脂中不饱和脂肪酸氧化生成不稳定的中间产物—氢过氧化物，氢过氧化物不稳定易分解或继续氧化生成二级过氧化物后再分解，分解则产生断链的醛、酮、酸等低分子量的化合物，具有特殊的气味。如何防止油脂不被氧化，这就需要添加抗氧化剂。我们通常在油脂当中添加的抗氧化剂有BHA（叔丁基羟基茴香醚）、BHT（二叔丁基对甲酚）、TBHQ（叔丁基对苯二酚）、PG（没食子酸丙酯）等。这些都是酚类的抗氧化剂，毒性比较小，与油脂氧化变质的危害性相比，这些毒害作用就会小很多了。油脂抗氧化剂是一类能阻止或延缓油脂或油脂类食品变质，延长其保质期的物质，叔丁基对苯二酚 （TBHQ）是一种品质优良的食用油脂抗氧化剂，因此对TBHQ作进一步深入的研究具有重要意义。
1.2 抗氧化剂的概述
抗氧化剂在添加剂中占有很大一部分，它的作用和地位也是不容小觑的，抗氧化剂能防止或延缓食品当中的成分因氧化而导致变质以及由氧化而导致的褪色、褐变、维生素破坏等。食用氧化的油脂有害人体的身体健康，所以大多数工厂生产油脂时会在其中添加抗氧化剂以防止油脂氧化裂变延长保质期。在添加抗氧化剂时，往往加入多种抗氧化剂的混合物，这是由于多种混合物抗氧化效果要明显强于单一的活性成分。而且单一成分的研究实验也因实验方法的不同而导致最后效果差异较大。因此，现在抗氧化剂的发展趋势是朝着复合抗氧化剂的趋势发展。自20世纪70年代以来，不断发现某些人工合成的抗氧化剂较之天然的抗氧化剂对人体健康有一定的毒害作用，可能对人体呼吸酶的活性油抑制作用，有的甚至还有致畸、致癌作用，从而引起了人们对人工合成的抗氧化剂持有疑问，它会不会安全？因此，越来越多的国家开始限制或禁止使用某些合成抗氧化剂。1977年，美
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国FDA( Food and Drug Administration)宣布食品中禁止使用2，6一二叔丁基对甲酚 (BHT) ，日本厚生省也曾在1982年宣布禁用丁基羟基回香醚 ( BHA)及叔丁基对苯酚 (TBHQ)因此寻找高 效、无毒、安全的天然抗氧化剂十分重要[2]。
1.3 抗氧化剂分类以及作用机理
1.3.1 抗氧化剂的分类
抗氧化剂的种类繁多， 依其溶解性大致可分为以下两类： 1.3.1.1 水溶性抗氧化剂
此类抗氧化剂大多用于食品护色，主要有抗坏血酸及其盐类、异抗坏血酸及其盐类、二氧化硫及其盐类等。 1.3.1.2 油溶性抗氧化剂
此类抗氧化剂多用于含油脂食品类，主要有丁基羟基苯甲醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、维生素E等。 1.3.2 抗氧化剂的作用机理 1.3.2.1自由基清除剂[3]
油脂自动氧化链式反应产生的自由基，通过与油脂或单质氧作用，或相互作用，加剧了油脂氧化链反应的传递速度 ,对油脂的氧化起到强化的作用。自由基清除剂能借助键的均裂，释放出体积小、亲合性很强的氢自由基，被链反应生成的自由基俘获而生成分子态化合物，将高势能的极活泼的自由基转变为较稳定的分子，从而中断了链反应的传递速度，阻止了油脂被进一步氧化。作为自由基清除剂的物质必须具备两个条件：一是它本身给出氧自由基的均裂能较低，即极容易给出氢自由基；二是它自身转变成的自由基较油脂氧化链式反应生成的自由基更能稳定存在。苯多酚(PT)能将氢自由基提供给不饱和脂肪酸过氧游离基形成氢过氧化物，阻止脂肪酸形成新的自由基[4]，就属于这类自由基清除剂。
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1.3.2.2 黄酮类抗氧化剂的作用机制
由于黄酮类抗氧化剂主要是通过酚羟基与氧自由基反应，形成共振稳定的半醌式自由基而中断链式反应的，因此共振半醌式自由基的稳定性与抗氧化剂活性成正相关。抗氧化剂形成半醌式自由基前后的生成热之差(ΔHOF)是最好的衡量其活性的理论参数。ΔHOF越低说明自由基越稳定，相应的抗氧化剂活性越强[5]。通过槲皮素、儿茶素及桑色素等黄酮化合物的理论计算，证实与实际事实相吻合。 1.3.2.3 氧化强化剂清除剂
食用油脂通常含有微量的金属离子。这些金属离子的来源，一是含金属的活化酶或其分解产物；二是在食油炼制、食油氢化及食品加工中接触金属容器、重金属特别是那些具有两价或更高价态且在它们之间有合适的氧化还原电势(例如钴、铜、铁、镁等)的金属[6]，可缩短链反应引发期的时间，加快脂类化合物氧化的速度。已经证明金属和金属盐的卟啉环络合物浓度为108mol/L时，则产生强氧化效应。那些含氧配位原子的络合剂可作为抗氧化剂，因它们与金属离子络合后可降低氧化还原电势，稳定金属离子的氧化态，有效地抑制金属离子的促氧化效应。如柠檬酸EDTA、多磷酸盐、植酸、卵磷脂等。
1.4 抗氧化剂的检测方法
1.4.1 比色法
此法适用于含有BHT和PG的样品。将含有抗氧化剂BHT的食用油脂样品经水蒸气蒸馏，将抗氧化剂从油脂中分离出来，馏出物经冷凝后用甲醇吸收，然后加入邻联二茴香胺溶液和2mL 0.3%亚硝酸钠溶液，生成橙红色发色团，接着用氯仿萃取得紫红色溶液，在波长520nm处测得吸光度，绘制吸光度与BHT浓度标准曲线，进行比较定量，测定油中BHT。测定油中的PG是利用乙醚溶解利用乙酸铵溶液提取，没食子酸丙酯与亚铁酒石酸盐发生颜色反应，在波长540nm处测定其吸光度，与标准曲线比较，测定PG含量。比色法测定抗氧化剂仪器虽然简单，但操作程序比较繁琐，测定浓度稍差，不能同时测定多种抗氧化剂，难以满足现在工作的需要[7]。
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1.4.2 电分析法
利用微分脉冲伏安法同时测定脱水马铃薯片中BHA和BHT含量，二者在碳纤维电极上氧化峰电位差为300mv，利用电分析法辅以化计量技术同时测定食用油和调味粉同时测定和调味粉中BHA、BHT、PG和TBHQ。
电化学分析技术由于其高选择性和灵敏度、检测快捷方便特性，所以在复杂体系中策微量化合物和生活活性成分方面应用广泛；而酚类抗氧化剂都是电活性物质，电化学技术在抗氧化剂定量分析和抗氧化活性评价方面应用潜力巨大。 1.4.3 气相色谱-质谱法
样品经乙腈提取后，进行气相色谱-质谱分析，采用外标法定量。该方法具有简便、快
速、准确、无毒等特点，应用于大豆油、花生油、芝麻油等油中抗氧化剂的测定。 1.4.4 液相色谱法
以甲醇-水-乙酸体系为流动相，采用梯度洗脱，使用对称C柱为固定相，检测限为
2mg/Kg，回收率92%-98%,RSD为1.01%-4.47%[8]。采用基质固相分散萃取植物油中抗氧化剂，经高效液相色谱进行分离，该法适用于定量分析抗氧化剂，具有速度快，灵敏度高、色谱柱可反复使用、样品量少，容易回收等优点。 1.4.5 气相色谱法
一般传统气相色谱法测定食用油中抗氧化剂程序时先将油脂溶解于己烷，用乙腈和80%
乙醇进行混合反复萃取，除去溶剂，然后经硅烷化处理 [9]。该方法处理步骤比较繁琐、耗费试剂也多，检测时间较长，难以满足工作需求。本文在此基础上进行改进，直接利用乙醇对样品进行萃取，取上清液蒸干用二硫化碳定容，然后采用气相色谱法自动进样，所用溶剂简单易配且无毒，操作简单且大大缩短了检测时间，比较方便而且有效。
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1.5 TBHQ的性质与用途
1.5.1 TBHQ的性质
叔丁基对苯二酚（tertiary butyl hydroquinone,TBHQ），又称为特丁基对苯二酚，是抗氧化剂中的一种，分子式为C10H14O2，相对分子质量为166.2，分子结构式如下：
它是一种白色结晶性粉末，有极轻微的特殊气味。溶于乙醇、乙醚，在油脂中有一定的溶解度，几乎不溶于水，高温下挥发小，与铁、铜不变色，但如有碱存在可转化为粉红色。其抗氧化性能优越，比BHA、BHT 和PG的氧化性更强。
1972年，美国率先批准使用，FAO/WHO也在1995年批准在26种油脂类食品中添加应用。我国政府于1991年批准作为抗氧化剂中在食品中添加使用，并规定最大使用限量（TMDI）为0.2g/Kg[10]。
TBHQ不但作为安全高效的食用油脂抗氧化剂，应用于动、植物油以及油脂类食品中，防止油脂的氧化裂变，而且具有很好的抗细菌、霉菌和酵母菌的作用，以增强高油水食品的防腐保鲜效果及延长货架期。能单独使用也能与BHA、BHT、PG等抗氧化剂复配使用，复配使用抗氧化性能比单独使用高出数倍。 1.5.2 TBHQ在植物油脂中的用途
植物油脂中含有油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸，且含量较高，在空气中容易被氧化生成不利于人体健康的物质。部分植物油脂中本身就含有一定的天然抗氧化物质，但这些物质容易在加工等过程中发生变化，加入TBHQ能够保护这些天然物质，减少加工过程中产生的有色物质[11]。姚云游等[12]利用强制氧化法对比研究了TBHQ与茶多酚在花生油、花生大豆调和油中的抗氧化效果，研究结果表明TBHQ无论对压榨花生油、还是花生大豆调和油都有很好的抗氧化效果。王海等 [13]研究了TBHQ等抗氧化剂在棕榈油中的抗
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氧化作用，实验证明TBHQ的抗氧化效果是最好的。核桃油是一种珍贵的营养保健油,赵声兰等研究了TBHQ等常用抗氧化剂在核桃油中的抗氧化效果，结果表明TBHQ对核桃油的抗氧化效果较其他几种常用抗氧化剂很好，而且与TBHQ与柠檬酸或抗坏血酸配合使用时，效果更明显。在文献中作者研究了常用抗氧化剂在植物油脂中的抗氧化作效果，其抗氧化能力顺序为：TBHQ>PG>BHT>BHA。由此可见，TBHQ的抗氧化效果是很强的。
2 材料与方法
2.1 实验仪器
表2-1 主要实验仪器
仪器名称
生产厂家
岛津企业管理（中国）有限公司 金坛市晶波实验仪器厂 上海民桥精密科学仪器有限公司 上海民桥精密科学仪器有限公司
SP6800A气相色谱仪
数显恒温水浴锅 分析天平 电子天平
2.2实验材料与试剂
表2-2 实验材料与方法
材料与试剂名称
生产厂家
国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 购于肥东华联超市
TBHQ标准样品 甲醇（分析纯）
乙腈（分析纯） 95%乙醇（分析纯） 无水乙醇（分析纯） 二硫化碳（分析纯） 金龙鱼菜籽油
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2.3 实验方法（国标方法GB/T5009.30）
2.3.1 实验操作流程 样品 预处理 分离提取 气相色谱自动进样测定
2.3.2 实验操作预处理
2.3.2.1 TBHQ标准品预处理
利用分析天平准确称取叔丁基对苯二酚（TBHQ）0.1000g于烧杯中，用1mL的无水乙醇溶解TBHQ晶体后，加入少量的二硫化碳混合，混合液倒入100mL棕色容量瓶中。再用1mL的无水乙醇洗涤烧杯后，加入少量的二硫化碳，清洗液一并倒入容量瓶中，最后用二硫化碳稀释至100mL。此标准溶液浓度为1mg/mL，置于4℃冰箱中保存待用。 2.3.2.2 样品预处理
准确称取菜籽油试样2.00g于25mL比色管中，加入5mLL80%的乙醇溶液，振摇1min，静止片刻，放在90℃左右的水浴锅中加热30s，促其分层。分层后，将上清液用移液管转移到60mL的瓷蒸发皿中（勿将油滴带入），再用5mL的80%的乙醇溶液重复提取两次，提取液一并倒入蒸发皿中，将蒸发皿放在60℃的水浴锅上通风挥发近干（切勿蒸干）。
在蒸发皿中加入二硫化碳，用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物，转移到2mL容量瓶中，试液作为试样测定液。 2.3.3 色谱柱条件[14]
色谱柱：玻璃柱，内径3mm,长3m，内装涂有2%OV-1固定液的酸洗硅烷化处理的白色硅藻土载体（Chromosorb W AW DMCS）,粒度80-100目。
检测器温度：250℃，汽化室温度：160℃，柱温：250℃。
氮气（N2）：30mL/min，氢气（H2）：50mL/min，空气：600mL/min。
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2.3.4 标准曲线的建立
2.3.4.1 标准品储备液的配制
准确称取上述2.3.2.1处理的TBHQ标准储备液（1mg/mL），用二硫化碳定容，分别稀释成浓度分别为0.0、50ug/mL、100.0 ug/mL、150 ug/mL、200 ug/mL、250 ug/mL的标准溶液，用一次性吸管将上述不同浓度的标准储备液装入样品瓶中，放入气相色谱的滑槽中，准备进样。
2.3.4.2 标品进样检测
打开电源总开关，打开气阀设置气压，氢气（H2）：0.25Mpa，氮气（N2）：0.25Mpa，空气：0.6Mpa。打开气相色谱仪开关，并打开软件工作站，联机进行开始进样。开始进样前若玻璃柱长久未用，一定要将柱子进行老化。老化的方法多采用气体流动法,将柱入口与进样室相连,出口勿接检测器,通小流量(一般为5-10mL/min)的载气,以(2-4)℃/min程序升温至低于固定液最高使用温度20-30℃,老化12-24h,获得平稳基线,待基线稳定后，便可以开始进样。根据保留时间进行定性，根据峰面积进行定量。根据不同浓度的标品即可绘制标准曲线。 2.3.5 样品含量测定
根据上述样品的2.3.2.2处理方法，利用一次性吸管将用二硫化碳定容的样品溶液装入样品瓶中，气相自动进样。根据上述的标准曲线，再根据出峰的保留时间和出峰的面积，即可得出样品中TBHQ的含量。
2.4 样品预处理优化实验
本实验依国标方法（GB/T5009.30）中的测定油脂中TBHQ（叔丁基对苯二酚）的方法的基础之上对菜籽油中TBHQ测定方法进行改进研究，主要是对油脂预处理方面进行改变处理，获得最佳的检测效果的预处理条件，最后对该方法的检测结果与国标方法的检测结果在准确度和精密度方面进行对照比较，验证该方法的可行性。
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2.4.1 提取溶剂选择
本实验是在国标方法中采用乙醇作为提取溶剂的基础上，研究再采用有机溶剂甲醇、乙腈分别对植物油中的TBHQ进行提取，并采用加标回收的方法确定三种溶剂对植物油的提取效果。具体操作步骤：吸取2mL的菜籽油，分别加入100ug/mL的标准品2mL，分别吸取5mL的甲醇、乙醇和乙腈对菜籽油进行提取，按照2.3.2.2的方法对样品进行处理，每个样品平行做五次，然后用气相色谱进行自动进样测定，计算比较计算结果，回收率较好者为最佳。 2.4.2 提取条件优化
在上述得出最佳的提取溶剂后，在本实验可能影响到抗氧化剂的因素有提取溶剂的总体积、混匀时间、溶剂提取次数和水浴温度，采用加标回收的方法，均在样品中加入100ug/mL的TBHQ标准品2mL。 2.4.2.1 单因素实验 （1）提取溶剂体积
选取提取溶剂分别为2mL、4mL和6mL和8mL的乙醇溶液对样品进行提取三次，按照 2.3.2.2方法，其他条件不变，测定其回收率 （2）混合时间
分别选取混合时间分别为1min、3min和5min，其他条件不变，测定其回收率。 （3）提取次数
分别选取提取次数为1、2和3，其他条件不变，测定其回收率。 （4）水浴温度
分别选取水浴温度为60℃、70℃、80℃、90℃和100℃，其他条件不变，测定其回收率。 （5）水浴时间
分别选取水浴时间为10s、20s、30s和40s，其他条件不变，测定其回收率。
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2.4.2.2 正交试验
在单因素实验的基础上，选取提取溶剂的体积、混合时间、提取次数和水浴温度四个因素水平进行正交优化实验，采取加标回收的方法得出最佳的溶剂提取条件，使样品预处理条件为最优。本实验采用L9(3)进行正交优化实验[15]见下表：
表2-3 L9(3)正交试验因素水平编码表
水平
溶剂体积/mL A
1 2 3
2 4 6
试验因素
混合时间/min B
1 2 3
提取次数 C 1 2 3
水浴温度/℃ D
100 80 60
4
42.5 实验结果评定
2.5.1 精密度测定
精密度：指在相同条件下N次重复测定结果彼此相符合的程度。精密度大小用偏差表示，偏差越小，精密度越高。
本实验直接采用标准样品的精密度对其方法进行判定。其操作步骤如下： 2.5.1.1 采用国标方法精密度测定
吸取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL的溶液2mL于25mL比色管中，加入5mL 80%乙醇溶液，振摇1min，静置片刻，放入90℃的水浴中加热30s，促其分层。分层后，将上清液用移液管转移到60mL的瓷蒸发皿中，再用5mL的80%的乙醇溶液重复提取两次，提取液一并倒入蒸发皿中，将蒸发皿放在60℃的水浴锅上通风挥发近干（切勿蒸干）。在蒸发皿中加入二硫化碳，用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物，转移到2mL容量瓶中，试液作为试样测定液。按照2.3.3的色谱条件进行自动进样，每个组每个浓度平行做七次，测定其浓度含量，计算其平均值、标准差和相对标准偏差。
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2.5.1.2 采用优化后方法精密度测定
吸取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL的溶液2mL于25mL比色管中，采用优化后的条件，即加入6mL 80%的乙醇溶液，振摇2min，然后再用6mL的乙醇溶液提取一次，放入80℃的水浴锅中水浴30s，其它条件与国标方法相同。按照2.3.3的色谱条件进行自动进样，每个组每个浓度平行做七次，测定其浓度含量，计算其平均值、标准差和相对标准偏差。
将两者测定的结果进行比较对照，确定哪种方法更为准确。 2.5.2 回收率测定
本实验采用加标回收的方法测定回收率[16] 2.5.2.1 采用国标方法测定回收率
用移液管分别取TBHQ标准储备液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于25mL的比色管中，并在比色管中加入2mL的样品（即菜籽油）溶液，加入5mL的80%乙醇溶液（80%乙醇是将95%乙醇80mL和15mL蒸馏水混合配置而成）。振摇1min，静置片刻，放入90℃左右的水浴中加热30s，待其分层。分层后，将上层澄清提取液用吸管转移到蒸发皿中（切勿将油滴带入）。再用5mL的80%乙醇溶液重复提取两次。提取液一并加入到蒸发皿中。将蒸发皿放入60℃的水浴上通风挥发或自然挥发至近干（切勿蒸干）并同时做空白实验[17]。
在蒸发皿中加入二硫化碳，用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物，转移到2mL容量瓶中，试液作为试样测定液。每个加标浓度做六次平行试验，利用标准曲线查出样品加标回收的浓度，取平均值并计算回收率[18]。 2.5.2.2 采用优化处理方法测定回收率
用移液管分别吸取TBHQ标准储备液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于25mL的比色管中，并在比色管中加入2mL的样品（即菜籽油）溶液，采用优化后的条件，即加入6mL 80%的乙醇溶液，振摇2min，然后再用6mL的乙醇溶液提取一次，放入80℃的水浴锅中水浴30s，其它条件与国标方法相同。每个加标浓度也是平行做六次，计算回
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收率。将两种方法测定的回收率进行比较对照。
3结果与分析
3.1气相色谱法绘制叔丁基对苯二酚（TBHQ）的标准曲线
采用国标方法，将标准样品稀释成浓度为50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL的标准液，采用气相自动进样，测得结果以浓度（ug/mL）为横坐标，以峰面积（UV*S）为纵坐标绘制标准曲线，其结果见表3-1和图3-1。
表3-1 标准品浓度与峰面积表 浓度(ug/mL)
50.000 100.000 150.000 200.000 250.000
峰面积（UV*S） 69094 127370 193676 240462 319013
浓度(x100)2.502.252.001.751.501.251.000.750.500.250.000250005000075000100000125000150000175000200000225000250000275000300000峰面积
图3-1 TBHQ标准品标准曲线
其标品的回归方程为y=7.85988e（-0.04 ）*X，R2=0.9995，表明该曲线的线性相关性较好，可以作为标准曲线。
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3.2 样品中含量的测定
将按上述2.3.2.2的方法对样品进行处理，平行做三组，可以根据色谱图上的峰面积与标准曲线来计算出样品中TBHQ的含量，其中TBHQ的出峰时间为11.5min左右，色谱图中以箭头来表示。其浓度与峰面积见表3-2和色谱图见图3-2：
表3-2 样品（菜籽油）浓度与峰面积
样品标号
1 2 3
出峰时间(min)
11.698 11.717 11.739
浓度（ug/min）
27.15784 27.22844 27.10728
峰面积（UV*S）
33872 33960 33821
uV(x10,000)5.0 色谱4.03.02.0TBHQ1.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0min
图3-2 样品（菜籽油）气相色谱图其一
对其取平均值。菜籽油中添加的抗氧化剂TBHQ的含量为27.16452ug/mL，完全符合国家标准，因此也可以判定此菜籽油符合国家标准[19]。
3.3 优化实验条件
3.3.1 提取溶剂的优化
本实验采用加标回收的方法，已知样品中的TBHQ含量，在菜籽油添加标准品，并采
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用甲醇、乙醇和乙腈三种溶剂对植物油中的TBHQ进行提取，在2mL的菜籽油中添加2mL的浓度为100ug/mL的TBHQ标准品，按照2.4.1的方法进行测定，并对其回收率进行计算，多次测定取平均值，比较其回收率的大小，其回收率较大的为最优。回收率的计算方法如下:
回收率=AC×100%
BA：加入TBHQ标准品后样品的浓度，ug/mL； B：加入TBHQ标品的浓度，ug/mL； C：样品中TBHQ的浓度，ug/mL。
三种提取溶剂对样品的回收率结果见表3-3：
表3-3 不同溶剂对样品处理的回收率表
溶剂
1
甲醇（%) 乙腈(%) 乙醇(%)
85.7 70.3 80.6
2 86.1 80.5 105.3
3 76.5 90.6 98.6
编 号
4 96.1 88.7 97.3
5 76.0 86.2 102.5
平均值 84.08 83.26 96.86
根据上表可知，乙醇对样品的提取效果最好，考虑到甲醇和乙腈都是有毒的有机溶剂，不仅会对环境造成污染，而且对实验人员的健康造成危害，而乙醇的毒性明显要低于甲醇和乙腈。因此本实验选取乙醇作为提取溶剂。 3.3.2 提取条件优化
3.3.2.1 单因素实验 （1）溶剂提取体积
准确称取2.00mL的菜籽油和2mL的100ug/mL的TBHQ标准品于25mL比色管中，分别加入2mL、4mL、6mL、8mL的80%乙醇溶液，振摇1min，静置片刻，放入90℃的
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水浴中加热30s，促其分层。分层过后，将上层澄清液用吸管转移到蒸发皿中（勿将油滴带入）。再重复分别用2mL、4mL、6mL、8mL的80%乙醇溶液提取，最后蒸发至近干，用二硫化碳定容，转移到2mL的容量瓶中，用吸管吸取放入样品中，进入气相色谱仪中自动进样测量。每组平行做三次，分别加入2mL、4mL、6mL、8mL的乙醇提取的样品回收率结果见表3-4： （2）混合时间
选取溶剂提取体积为6mL，混合时间分别为1min、3min、5min，其它操作条件相同，每组平行做三次，在这种情况下测得回收率见表3-5： （3）提取次数
选取溶剂为6mL，混合振摇时间为1min，提取次数分别为1次、2次、3次，其它操作条件相同，每组平行做三次，测得其回收率见表3-6：
表3-4 溶剂提取体积对样品回收率的影响
体积/mL
1
2 4 6 8
56.1 64.2 85.6 78.3
2 45.2 75.7 79.9 82.4
编 号
3 34.2 77.8 90.7 81.4
平均回收率(%)
45.17 72.57 85.40 80.70
由表中可知，在6mL时，它的回收率达到最大，提取体积太小，提取的量就小。提取体积太大，导致溶剂占有的量太大，反而会减少物质的提取，导致回收率下降。
表3-5 混合时间对样品回收率的影响
时间/min
1
1 3
编 号 2 83.5 76.5
15
3 82.3 78.8
平均回收率(%)
84.37 77.97
87.3 78.5
2009级食品科学与工程毕业论文
5
67.9
78.2
81.4
75.83
由表3-5可知，混匀时间为1min时样品加标回收率为最佳，随着时间的越长它的平均回收率减小。混合时间越长，导致后续操作分离不完全，使样品中的待测物质含量减少，故平均回收率会减小。
表3-6 提取次数对样品回收率的影响
提取次数
1
1 2 3
58.7 77.1 76.4
2 65.3 80.7 75.3
编 号
3 71.4 86.3 79.4
平均回收率(%)
65.13 81.7 77.03
由表3-6可知，提取次数为2次时，样品加标回收率为最佳。提取次数太少，样品中的待测物质不能被溶剂提取出来，提取次数太多，增大了溶剂的量，反而会降低样品中TBHQ的含量。 （4）水浴温度
选取溶剂为6mL，混合振摇时间为1min，提取次数为2次，水浴温度分别为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，其它操作条件相同，每组平行做三次，测得其回收率见表3-7：
表3-7 水浴温度对样品回收率的影响
水浴温度/℃
1
60 70 80 90 100
57.6 70.8 79.6 73.5 65.8
2 60.5 71.6 83.7 71.9 61.3
编 号
3 61.2 68.5 89.6 76.4 58.2
平均回收率(%)
59.77 70.30 84.30 73.93 61.77
由表3-7可知，水浴温度为80℃时，样品加标回收率为最好。水浴温度太低，不能促进分层，提取不完全。温度太高，使乙醇挥发掉，提取的量减少，导致回收率会有所下降。
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（5）水浴时间
选取溶剂体积为6mL，混合时间为1min，提取次数为2次，水浴温度为80℃，水浴时间分别为10s、20s、30s、40s，每组平行做三次，其回收率见表3-8：
表3-8 水浴时间对样品回收率的影响
水浴时间/s
编 号
1 88.6 80.9 87.2 85.3
2 85.6 88.7 80.5 81.6
3 87.5 79.7 81.7 84.1
平均回收率(%)
87.23 83.10 83.13 83.67
10 20 30 40
由上表3-8可知，水浴时间对回收率的影响不是很大。水浴主要是起到促进分层的作 用，促使待测物质从样品中分离，水浴时间的长短并不影响回收率的大小。 3.3.2.2 正交实验
在单因素实验的基础上，对提取溶剂体积、混合时间、提取次数和水浴温度进行正交实验，吸取2mL的菜籽油，并加入100ug/mL的TBHQ标准品2mL，依据2.4.2.2的方法进行，采用四因素三水平的正交优化实验对菜籽油中TBHQ的提取最佳工艺进行研究[20]，正交试验及回收率见表3-9。
通过正交实验极差分析表明，RA＞RB＞RD＞RC ，表明影响油脂提取的因素为溶剂提取体积＞混匀时间＞水浴温度＞提取次数 。实验结果表明：菜籽油中溶剂提取抗氧化剂的最佳条件为溶剂提取溶剂为6mL，混合时间2min，提取次数为2次，水浴温度为80℃时提取对测定结果最好。
3.4 精密度测定
3.4.1 国标方法精密度测定
取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL的溶液2mL，按照国标
17
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方法进行处理，即提取溶剂为5mL、混合时间为1min，提取次数为3 次，水浴温度为90℃，按照2.3.3的色谱条件进行自动进样，每个浓度平行做七次，测定其浓度含量，计算其标准差和相对标准偏差。测得的结果见表3-10： 3.4.2 优化处理方法精密度测定
取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL的溶液2mL，按照上述优化的条件进行预处理，即提取溶剂为6mL、混合时间为2min，提取次数为2 次，水浴温度为80℃，按照2.3.3的色谱条件进行自动进样，每个浓度平行做七次，测定其浓度含量，计算其标准差和相对标准偏差来判定试验方法的有效程度。 按照上述2.5.1的方法测定样品的精密度得出结果见表3-11：
根据上述两种方法计算结果表明，优化后的处理方法在平均值、标准差和变异系数均优于国标方法，该实验方法精密度均＜5%。检测性良好，可用此实验方法进行检定食用油中抗氧化剂。
表3-9 L9(3)正交试验方案和结果分析
编号
溶剂体积/mL
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1
4
试验因素
混匀时间/min B
提取次数 C 1（1） 2（2） 3（3）
2 3 1 3 1 2 243.95
18
水浴温度/℃
D 1(100) 2(80) 3(60)
3 1 2 2 3 1 247.03
回收率/%
78.10 87.32 79.01 80.04 83.04 80.72 84.36 84.42 85.18
1(2) 1（1） 1 1 2(4) 2 2 3(6) 3 3 245.14
2（2） 3（3）
1 2 3 1 2 3 253.21
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K2 K3 k1 k2 k3 R 主次次序 优水平 优组合
表3-10 国标法精密度测定结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 平均值
SD
RSD(%)
50ug/mL 44.891 46.325 48.442 48.568 48.64 48.654 50.368 48.64 2.70 5.55
100ug/mL 93.457 96.310 97.367 97.890 98.414 98.657 102.456 97.790 2.71 2.77
200ug/mL 194.671 196.862 197.975 198.432 199.002 202.654 203.438 199.0 3.10 1.56
243.8 253.96
81.71 81.27 84.65 3.38
254.78 244.91
84.40 84.93 81.64 3.29
252.54 246.37
81.32 84.18 82.12 2.86
252.4 243.37 82.34 84.13 82.16 2.97
A>B>D>C
A3
B2 A3B2D2C2
C2
D2
表3-11 优化后精密度测定结果
19
2009级食品科学与工程毕业论文
编号 1 2 3 4 5 6 7
50ug/mL 48.265 48.917 49.215 49.216 50.097 51.725
52.762 50.03 1.63 3.25
100ug/mL 97.155 97.766 98.761 99.244 100.725 101.756 102.654 99.72 2.05 2.01
200ug/mL 197.015 198.346 198.995 199.202 201.245 201.775 202.725 199.9 2.06 1.03
平均值
SD
RSD(%)
3.5 回收率的测定
3.5.1 国标方法测定回收率
用移液管分别取TBHQ标准储备液100ug/mL、150 ug/mL、250 ug/mL各2mL于25mL的比色管中，并在比色管中加入2mL的样品（即菜籽油）溶液，加入5mL的80%乙醇溶液（80%乙醇是将95%乙醇80mL和15mL蒸馏水混合配置而成）。振摇1min，静置片刻，放入90℃左右的水浴中加热30s，待其分层。分层后，将上层澄清提取液用吸管转移到蒸发皿中（切勿将油滴带入）。再用5mL的80%乙醇溶液重复提取两次。提取液一并加入到蒸发皿中。将蒸发皿放入60℃的水浴上通风挥发或自然挥发至近干（切勿蒸干）并同时做空白实验。
在蒸发皿中加入二硫化碳，用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物，转移到2mL容量瓶中，试液作为试样测定液。每个加标浓度做六次平行试验，利用标准曲线查出样品加标回收的浓度，取平均值并计算回收率。
按照上述方法，通过气相色谱自动进样，得出谱图见附页，结果见表3-12： 3.5.2 优化处理交表回收率测定
用移液管分别吸取TBHQ标准储备液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于
20
2009级食品科学与工程毕业论文
25mL的比色管中，并在比色管中加入2mL的样品（即菜籽油）溶液，采用优化后的条件，即加入6mL 80%的乙醇溶液，振摇2min，然后再用6mL的乙醇溶液提取一次，放入80℃的水浴锅中水浴30s，其它条件与国标方法相同。每个加标浓度也是平行做六次，计算回收率。测得的结果见表3-13。
对其加标回收后，在相同加标浓度100ug/mL和250ug/mL的情况下，优化后的方法回收率要高于国标方法，其平均回收率在82.3%-94.2%，回收效果较好。
表3-12 国标方法标回收率表
加标浓度（ug/mL）
100 150 250
1 80.902 135.745 190.791
2 77.784 122.342 270.641
3 76.890 135.679 213.065
4 85.562 136.094 208.467
表3-13 优化方法加标回收率表
加标浓度（ug/mL）
100 150 250
1 86.234 133.764 198.762
2 82.250 112.765 298.917
3 77.234 138.503 230.676
4 96.232 137.275 230.154
编 号
5 104.32 171.909 213.908
6 89.064 110.075 240.312
平均值 82.32 133.22 235.45
回收率 82.3 88.8 94.2
编 号
5 84.679 113.456 220.110
6 88.095 129.215 235.572
平均值 82.32 128.76 223.11
回收率 82.3 85.8 89.2
4 讨论和结论
本实验对食用植物油中抗氧化剂检测方法研究，从预处理到分提取离测定到结果分析。首先将TBHQ标准品稀释成不同浓度的标准液，利用气相色谱方法测定，建立标准曲线。再以乙醇作为提取溶剂处理样品，提取TBHQ并进行水浴促进分层。并且对溶剂的总体积、样品和溶剂的混匀时间、提取次数和水浴温度进行正交试验，得出
21
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在溶剂总体积为6mL、混匀时间为2min、提取两次和水浴温度在80℃的情况下，可以得到较准确的结果。这些因素对回收率的影响次序为溶剂总体积＞混匀时间＞水浴温度＞提取次数。在此基础上，对样品进行测定研究，对其进行精密度和回收率计算，其RSD为1.03%-3.25%，回收率为82.3%-94.2%。检测结果较好，此方法具有简便快速，也可同时对多种抗氧化剂进行研究分析，也可用于多种食用油中抗氧化剂的检测，对现实食品检测中具有重要的意义。
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2009级食品科学与工程毕业论文
致 谢
历经一个多月，我的论文终于完成。在这里，我首先要感谢我的指导老师王中凤教授，在百忙之中抽出时间帮我从课题的选题、资料的查阅、实验的进行到最后论文的撰写、审阅和最后细致修改，这其中的每一个环节王老师都是亲力亲为，让我非常感激。在整个做实验和写论文过程中，导师对我学习和研究工作教导、关怀和鼓励让我受益非浅。导师不但知识渊博且学习态度严谨，这些都将为我以后学习、工作作出榜样。在此，我向尊敬的王中凤导师表示由衷的感谢和崇高的敬意。
与此同时，也要非常感谢肥东质监局能给我一个很好的实验平台，感谢王莉主任和张晓玲老师和同我一起来肥东质监局实习的实验伙伴们对我的实验的帮助和建议，尤其是在实验仪器操作部分，对我精心教导，让我从生疏到熟练，每一步都很耐心的讲解，直到学会为止。
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2009级食品科学与工程毕业论文
此外，还要感谢我的母校合肥学院，让我在这里一步步成长，感谢大学四年以来一起相处的老师和同学，正是因为有了你们，我的大学生活才会如此丰富多彩。
最后，衷心感谢在百忙之中抽出时间审阅本论文和答辩的专家。
李小玲
附录
1：加标浓度为100.0ug/mL的空白实验色谱图和表格
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2013年6月 2009级食品科学与工程毕业论文
uV(x10,000)5.0 色谱4.03.02.01.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0minTBHQ
图1 TBHQ加标浓度为100.0ug/mL空白实验
表1 TBHQ浓度为100.0空白
保留时间/min
11.715
面积（微伏*秒）
36707.4
峰高 5057.3
拖尾因子 1.118
浓度（ug/mL） 82.23470
组分名 TBHQ
2：加标浓度为100.0ug/mL的实验色谱图和表格
uV(x10,000)5.0 色谱4.03.02.01.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0minTBHQ
图2 TBHQ加标浓度为100.0ug/mL的样品
表2 TBHQ浓度为100.0ug/mL的样品
保留时间/min 11.748
面积（微伏*秒） 峰高 59141.6
7434.1
26
拖尾因子 1.073
浓度（ug/mL） 组分名 104.39887
TBHQ
2009级食品科学与工程毕业论文
3：加标浓度为150.0ug/mL的空白实验色谱图和表格
uV(x10,000)5.0 色谱4.03.02.01.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0minTBHQ
图3 TBHQ加标浓度为150.0ug/mL空白
表3 TBHQ浓度为150.ug/mL空白
保留时间/min 11.716
面积（微伏*秒） 峰高 79028.6
10904.8
拖尾因子 1.101
浓度（ug/mL） 组分名 133.76430
TBHQ
4：加标浓度为150.0ug/mL的实验色谱图和表格
uV(x10,000)5.0 色谱4.03.0TBHQ 2.01.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0min
图4 TBHQ加标浓度为150.0ug/mL的样品 表4 TBHQ浓度为150.0ug/mL的样品
保留时间/min 11.792
面积（微伏*秒） 峰高 136204.5
18627.0
拖尾因子 1.807
浓度（ug/mL） 165.66722
组分名 TBHQ
27
2009级食品科学与工程毕业论文
5：加标浓度为250.0ug/mL的空白实验色谱图和表格
uV(x10,000)5.0 色谱4.03.02.01.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0minTBHQ
图 5 TBHQ加标浓度为250.0ug/mL空白 表5 TBHQ浓度为250.0空白
保留时间/min 11.788
面积（微伏*秒） 峰高 158371.9
21938.3
拖尾因子 1.093
浓度（ug/mL） 198.76210
组分名 TBHQ
6：加标浓度为250.0ug/mL的实验色谱图和表格
uV(x10,000)5.0 色谱4.03.02.01.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0minTBHQ 图6 TBHQ加标浓度为250.0ug/mL的样品 表6 TBHQ浓度为250.0ug/mL的样品
保留时间/min
面积（微伏*秒） 峰高
拖尾因子
浓度（ug/mL）
组分名
28
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11.800
198289.7
27612.0
1.046
241.90891
TBHQ
目录
第一章项目基本情况 ....................................................... 错误！未定义书签。 一、项目情况说明 ..................................................... 错误！未定义书签。 二、可行性研究的依据 ............................................. 错误！未定义书签。 第二章项目建设的必要性与可行性 ............................... 错误！未定义书签。 一、项目建设背景 ..................................................... 错误！未定义书签。 二、项目建设的必要性 ............................................. 错误！未定义书签。 三、项目建设的可行性 ............................................. 错误！未定义书签。 第三章市场供求分析及预测 ........................................... 错误！未定义书签。 一、项目区生猪养殖和养殖粪污的利用现状 ......... 错误！未定义书签。 二、禽畜粪污产量、沼气及沼肥产量调查与分析 . 错误！未定义书签。 三、项目产品市场前景分析 ..................................................................... 20 第四章项目承担单位的基本情况 ................................... 错误！未定义书签。 一、养殖场概况 ......................................................... 错误！未定义书签。 二、资产状况 ............................................................. 错误！未定义书签。 三、经营状况 ............................................................. 错误！未定义书签。 第五章项目地点选择分析 ............................................... 错误！未定义书签。 一、选址原则 ............................................................. 错误！未定义书签。 二、项目选点 ............................................................. 错误！未定义书签。 三、项目区建设条件 ................................................. 错误！未定义书签。 第六章 工艺技术方案分析 ............................................ 错误！未定义书签。 一、污水处理模式的选择 ......................................... 错误！未定义书签。 二、处理工艺的选择 ................................................. 错误！未定义书签。 三、项目工艺流程 ..................................................... 错误！未定义书签。 四、主要技术参数 ..................................................... 错误！未定义书签。 五、主要设备选型 ..................................................... 错误！未定义书签。 第七章项目建设目标 ....................................................... 错误！未定义书签。 一、项目建设目标 ..................................................... 错误！未定义书签。 二、项目建设规模 ..................................................... 错误！未定义书签。 第八章项目建设内容 ....................................................... 错误！未定义书签。 一、建安工程 ............................................................. 错误！未定义书签。 二、仪器设备 ............................................................. 错误！未定义书签。 第九章投资估算和资金筹措 ........................................... 错误！未定义书签。 一、投资估算的范围 ................................................. 错误！未定义书签。 二、投资估算的依据 ................................................. 错误！未定义书签。
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三、投资估算 ............................................................. 错误！未定义书签。 四、资金使用计划 ..................................................... 错误！未定义书签。 五、资金筹措 ............................................................. 错误！未定义书签。 第十章建设期限和实施进度安排 ................................... 错误！未定义书签。 一、项目建设期限 ..................................................... 错误！未定义书签。 二、项目实施进度安排 ............................................. 错误！未定义书签。 第十一章土地、规划和环保 ........................................... 错误！未定义书签。 一、土地与规划 ......................................................... 错误！未定义书签。 二、环境保护 ............................................................. 错误！未定义书签。 三、安全防护 ............................................................. 错误！未定义书签。 第十二章项目组织管理与运行 ....................................... 错误！未定义书签。 一、项目建设组织管理 ............................................. 错误！未定义书签。 二、项目建成后运行管理 ......................................... 错误！未定义书签。 三、项目运行费用 ..................................................... 错误！未定义书签。 第十三章效益分析与风险评价 ....................................... 错误！未定义书签。 一、经济效益分析 ..................................................... 错误！未定义书签。 二、项目风险评价 ..................................................... 错误！未定义书签。 三、生态效益 ............................................................. 错误！未定义书签。 四、社会效益 ............................................................. 错误！未定义书签。 五、附表 ..................................................................... 错误！未定义书签。 第十四章招标方案 ........................................................... 错误！未定义书签。 一、编制依据 ............................................................. 错误！未定义书签。 二、招标范围 ............................................................. 错误！未定义书签。 三、招标方式 ............................................................. 错误！未定义书签。 四、招标组织形式 ..................................................... 错误！未定义书签。 有关证明材料及附件 ....................................................... 错误！未定义书签。
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