应用real-time RT-PCR鉴定两个水稻品种(品系)对水稻条纹病毒的抗性差异

应用real-time RT-PCR鉴定两个水稻品种（品系）对

水稻条纹病毒的抗性差异*

杨金广，方振兴，张孟倩，徐飞，王文婷，谢荔岩，林奇英，吴祖建，谢联辉

福建省植物病毒学重点实验室，福建农林大学植物病毒研究所，福州（350002）

E-mail: jinguangyang@126.com

摘 要：本研究应用real-time RT-PCR检测了水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）在2种水稻品种（品系）武育粳3号和KT95-418的悬浮细胞内复制循环和相对含量的差异，结合传统生物学接种实验，确定了这两个品种（品系）对RSV抗性的差异。结果表明RSV在武育粳3号的悬浮细胞内24 h达到复制高峰，病毒含量为侵染初期的7.46倍。而在KT95-418的悬浮细胞内，RSV达到复制高峰需要36 h，病毒含量为侵染初期的4.51倍。利用病毒生物学接种的方法，武育粳3号发病率达91.7%，而KT95-418仅为36.0%。由此可见，KT95-418较武育粳3号对RSV具有较高的抗病性。因此，real-time RT-PCR方法与传统生物学接种实验方法相比，具有更高的准确性和灵敏性，可以作为传统品种抗病性鉴定的验证手段。 关键词：水稻，水稻条纹病毒，品种抗性，real-time RT-PCR，悬浮细胞 中图分类号：S435.111.49

水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）是由灰飞虱（Laodelphax striatellus）以持久方式传播的植物病毒[1]，该病毒引起的水稻条纹叶枯病是我国温带和亚热带稻区的主要病害[2]。从1999年以来，该病害在江苏，安徽，浙江，河南，山东，辽宁，云南，北京和上海等地流行暴发，给当地稻米生产造成巨大损失，引起社会的广泛关注[3]。其中，感病品种的大面积栽培造成该病害大规模暴发流行的主要因素之一。因此，筛选和培育抗病品种是解决该病害危害最为经济有效的措施。当前，在品种抗病性筛选中，多采用田间小区实验和实验室的病毒生物学接种实验，这些方法均费时费力，并且因传播介体灰飞虱传毒效率的差异，易造成实验结果较大的误差。笔者所在实验室已筛选出两个水稻品种（品系）武育粳3号和KT95-418对RSV的抗性存在显著差异。其中KT95-418是从武育粳3号高发病田间筛选出的单株抗病植株，推测可能为武育粳3号感病品种变异而来的抗病新品系。田间小区实验和实验室传统生物学接种实验均显示KT95-418较武育粳3号对RSV具有较高的抗病性。为进一步验证该结果，本研究通过real-time RT-PCR检测RSV在这两个水稻品种（品系）悬浮细胞内复制情况的变化，来确定两者的抗性差异，以期能够提供一个更加准确，快速和灵敏的品种抗性鉴定的新方法。

1．材料与方法

1.1 供试植物材料和病毒毒源

水稻品种武育粳3号和水稻新品系KT95-418为本实验室保存。

实验毒源分别采自江苏洪泽(HZ)和云南楚雄(CX)水稻田间呈典型水稻条纹叶枯病症状的病株，经RT-PCR鉴定后，保存于水稻植株上（台中1号）。发病病株用于RSV病毒提纯

[4]

。RSV经高效传毒灰飞虱传毒于2叶期水稻幼苗，并在28℃，14 h光照和10 h黑暗，防

虫条件下培养，10 d 后，观察待试植株症状发生，30 d后，统计发病结果。以发病率表示 *

本课题得到国家重点基础研究规划项目（973） （2006CB100203）; 教育部博士点专项科研基金(200403002; 200503006); 国家自然科学基金(30671357)的资助。

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其抗病性的差异，其差异显著性通过卡方X2进行分析。

1.2水稻悬浮细胞培养与RSV侵染

水稻悬浮细胞培养与RSV侵染参照Yang et al.方法[5]。

1.3 Real-time RT-PCR检测

取植物样品0.1 g，用1 ml TRIZOL试剂（Invitrogen, USA)提取总RNA，方法按公司提供的产品说明进行。

应用PerlPrimer软件进行real-time PCR引物设计[6]。为保证所设计引物特异性，所选引物均在GenBank数据库Blast程序下进行比较分析，以避免与水稻基因组序列同源。RSV CP 基因保守区域引物5’端为5′-RTTGACAGACATACCAGCCAG-3′(R=A/G)， 3′端为 5′-CATCATTCACTCCTTCCAAATAACY-3′(Y=C/T)。水稻真核延伸因子基因（eukaryotic elongation factor 1-alpha gene，eEF-1a)作为内参基因5′-TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT-3′5′-GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA-3′。

1 μg总RNA与1 μl 3′端引物（10 pmol）混合后，于70℃处理10 min，再按照TaKaRa公司的ExscriptTM RT reagent Kit试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。1 μl cDNA用于real-time PCR检测，PCR在50 μl反应体系中，在48孔MiniOpticonTM System (Bio-Rad, USA )进行以下反应。95℃预变性10 sec后，进行45个循环。每个循环为95℃变性6 sec，62℃退火20 sec。然后进行融解曲线制作。

Real-time RT-PCR扩增产物的特异性均通过1％琼脂糖凝胶电泳和每个基因的融解曲线进行鉴定。利用一系列4倍稀释的cDNA作为模板进行real-time RT-PCR灵敏性检测和标准曲线构建。根据参比基因对所有样品进行归一化处理（初始RNA量校正），然后确定每个目的基因在不同样品中的相对表达量。每个试验样品重复检测3次，并至少进行2次生物实验重复。

，

[7]

，引物5′端为

端

为

3′

2．结果

2.1 武育粳3号和KT95-418的病毒生物学特征

武育粳3号和KT95-418 2叶期水稻幼苗接种RSV后，10－20天内表现症状，两个品种(品系)发病症状无明显差异，发病后期（接种后30天）病株均枯死。但武育粳3号发病率为91.7％，而KT95-418发病率仅为36.0％（表1）。由此可见，武育粳3号和KT95-418对RSV的抗病性存在明显差异（P＜0.05），KT95-418品系较武育粳3号对RSV具有较高的抗性。

表1武育粳3号和KT95-418对RSV的抗性比较

Table 1 The comparison of resistance against RSV between Wuyujing 3 and KT95-418

品种 Varieties 武育粳3号

毒源 Virus source

HZ CX

发病率(接种总株数) Incidence of infected (total tested plants number)

90.7％（97） 92.6％（95）

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平均发病率(接种总株数) average incidence of infected (total tested plants number)

91.7％（192）

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KT95-418

HZ CX

35.1％（94） 37.0％（92）

36.0％（186）

2.2 水稻悬浮细胞内RSV CP基因的扩增及标准曲线的建立

通过采用特异性引物CP1/CP2对水稻病株和RSV侵染后的水稻悬浮细胞进行real-time RT-PCR检测，均能检测到条带单一，大小为243 bp PCR产物，无模板对照无荧光信号，说明该对引物特异性强，适合SYBR Green染料法的real-time RT-PCR检测。将CP 基因cDNA进行4倍稀释5个梯度，得到CP基因的标准曲线方程为Y＝0.2522X＋6.04，相关系数为R2＝0.996 (图1)。

2.3 武育粳3号和KT95-418悬浮细胞内CP基因表达差异的分析

RSV侵染水稻悬浮细胞后6 h，开始对细胞内RSV CP基因的相对表达量进行分析，结果表明，RSV侵染武育粳3号悬浮细胞24 h达到复制高峰，CP基因相对表达量是侵染后6 h的7.46倍，而在KT95-418悬浮细胞中，RSV侵染36 h后才能达到复制高峰，CP相对含量仅为侵染初期的4.51倍（图2）。由此可见，RSV在KT95-418悬浮细胞中复制受阻，KT95-418表现出更高的抗性。

3.0RNA含量的对数值0.1252.52.01.51.00.500.1荧光信号值0.0750.0525Ct值300.025051015Ct值图1 RSV CP基因的扩增曲线与标准曲线

扩增曲线从左到右分别是CP基因的cDNA稀释0、41、42、43和44倍为底物的扩增曲线

Figure 1 Amplication curve and strandard curve of RSV CP gene

Shown from left to right are the curves of decreaseing concentrations of cDNA with 0、41、42、43 and 44-fold

dilution. -3-

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876相对表达量321061224RSV侵染时间图2 RSV在武育粳3号和KT95-418悬浮细胞中的复制周期与相对含量变化

Figure 2 The change of RSV replication cycle and relative amount in rice suspension cells of Wuyujing 3 and

KT95-418.

武育粳3号KT95-4183860

3．讨论

基于SYBR Green染料法的real-time RT-PCR 检测中引物设计是PCR扩增获得成功的关键之一。引物首先要求对被检测基因具有很高的特异性，所设计引物的被扩增片段通常介于80－300 bp之间，片段越小定量扩增结果就越精确[8]，本研究所选择的扩增片段为243 bp，且扩增产物单一，在空白对照中，无任何扩增信号和产物产生。说明这对引物对RSV检测具有很高的特异性。为了有效的检测RSV CP基因，笔者对GenBank中已有的RSV CP基因进行了分析比较，选择CP最保守区域进行引物设计，以保证所设计引物能够扩增出目前已知的所有RSV分离物。

当前，由RSV引起的水稻条纹叶枯病是我国粳稻种植区最主要病毒病，种植抗病品种是防治该病害最为经济有效的措施。因此，抗病品种的筛选和培育成为目前的主要任务。但在传统的抗病品种筛选中，多采用传统病毒生物学接种方法，此方法需要饲养大量的传播介体灰飞虱，对其饲毒，传毒，观察病害发生情况等，均需要大量的人力和较长的周期。同时，由于灰飞虱不同群体间存在着传毒效率的差异[9]，且灰飞虱传毒具有间歇性，这些特点均易造成较大的实验误差，需要大量的重复试验来进行验证。本研究利用RSV侵染水稻悬浮细胞体系，通过real-time RT-PCR检测RSV在寄主细胞内复制周期和表达含量的变化，结合传统的品种抗病性检测的结果来确定寄主抗病性的差异。该方法可以快速、灵敏、准确地鉴定出2种和2种以上品种的抗性差异。为抗病品种鉴定和抗性种质资源的筛选提供可靠的方法。

但该方法也存在自身的弊端。在检测鉴定过程中，水稻悬浮细胞培养需要严格地无菌操作和专业无菌实验室，同时real-time RT-PCR则需要精密而昂贵的仪器和复杂的操作程序以及繁琐的分析过程。这些很难在基层得以普及，目前只能适合在实验室中对传统的生物学鉴定的结果进行必要的验证和补充。因此，目前传统生物学接种实验和田间小区实验暂时依然是验证品种抗病性差异的主要技术手段。

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参考文献

1 Toriyama, S. Rice stripe virus: prototype of a new froup of viruses that replicate in plants and insects. Microbiological Sciences,1986, 3, 347-351.

2 林奇英，谢联辉，周仲驹，等. 水稻条纹叶枯病的研究.Ⅰ.病害的分布和损失. 福建农学院学报，1990，19（4）：421－425.

3 魏太云. 水稻条纹病毒的基因组结构及其分子群体遗传. 福建农林大学博士论文, 2003.

4 Toriyama, S. Characterization of rice stripe virus: a heave component carrying infectivity. Journal of General Virology 1982,61.187–195.

5 Yang W, Wang X, Wang S, et al. Infection and replication of a planthopper transmitted virus-rice stripe virus in rice protoplasts. Journal of Virological Methods, 1996, 59, 57–60.

6 Marshall O J. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics, 2004, 20: 2471–2472.

7 Jain M, Nijhawan A, Tyagi A K, et al. Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 345: 6-651.

8 Meyer R, Jaccaud E. Authenticity and adulteration of food－the analytical approach. Eur Food Chem I X, Congress, Interlaken, Switzerland, 1997, 23-28.

9 曲志才，马向前，白逢伟，等。活跃传毒介体灰飞虱（Laodelphax striatellus）品系的杂交与选育。复旦学报（自然科学版），2002，41（60）: 684－687.

The detection on the different resistance of two rice varieties

against Rice stripe virus using real-time RT-PCR

Yang Jinguang，Fang Zhenxing，Zhang Mengqian，Xu Fei，Wang Wenting，Xie Liyan，

Lin Qiying，Wu Zujian，Xie Lianhui

Key Lab of Plant Virology of Fujian Province，Institute of Plant Virology，Fujian Agriculture and

Forest University，Fuzhou (350002)

Abstract

The different resistance against Rice stripe virus (RSV) between rice Wuyujing 3 and KT95-418 was investigated via detecting the replication cycle and relative amount of RSV in two varieties rice suspension cells by real-time RT-PCR assay and conventional RSV infected assay. This result showed that it was 24 h and 36 h when RSV replication reached its peak in rice suspension cells of Wuyujing 3 and KT95-418 respectively, and at their peak, the amount of RSV increased 7.46 and 4.51 times respectively. The infected incidences of Wuyujing 3 and KT95-418 were 91.7% and 36.0% by conventional RSV infected method. Therefore, KT95-418 has more high resistance against RSV than Wuyujing 3. In comparison with conventional RSV infected methods, real-time RT-PCR assay has more accurated and sensitive, and will used to validate the result of conventional RSV infected assay. Keywords: real-time RT-PCR，Rice，Rice stripe virus (RSV)，suspension cells，variety resistance

作者简介：

杨金广，男，1979年生，博士研究生，主要从事分子植物病毒学研究。 吴祖建，副研究员，博士，通讯作者，主要从事分子植物病毒学研究； E-mail：wuzujian@126.com。

谢联辉，教授，通讯作者，主要从事植物病理学研究；E-mail：fjxlh@126.com。

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