油茶籽粕中茶皂素的优化提取及抑菌活性的研究

文章编号：1〇〇1&880(2018)1&127&7

油茶籽粕中茶皂素的优化提取及抑菌活性的研究

鲍妮娜！，丁富成，胡巧缘

宿州学院生物与食品工程学院，宿州234000

摘要：以油茶籽粕为原料，采取超声波辅助乙醇提取法，考察了料液比、浸提时间、超声时间、乙醇体积分数对

茶皂素得率的影响，并用响应面优化实验设计得出最优提取条件，优化条件为:料液比l:7(rn/V)、浸提时间93

min、超声时间36 min、乙醇体积分数55%，在该条件下茶皂素得率为14. 708%。依照此优化方案进行验证实 验，结果显示模型可靠性较高，可以较好的预测实际情况。同时茶皂素抑菌效果表明茶皂素对金黄色葡萄球菌 有较好的抑菌效果，而对大肠杆菌没有抑菌效果。

关键词:茶皂素;超声波辅助乙醇提取法;响应面优化;抑菌性

中图分类号:TQ423.2

文献标识码:A

D0I：10. 16333/j. 1001-6880.2018. 1.022

Extraction and Bacteriost^sis Effect of Tea Saponin

in Oil-tea Camellia Seed Cake

BA0 Ni-na!，DING Fu-cheng，HU Qiao-yuan

College of Biological and Food Engi4ering, Suzhou University, Suzhou 234000, China

Abstract :Using camellia seed cake as raw material，the effect of solid to liquid ratio extra

volume fraction of ethanol on the yield of tea saponin was studied by using ultrasonic assisted ethanol extraction method. The optimal extraction was carried out using the response surface optimization experiment. The optimal conditions were as follows: solid to liquid ratio was 1: 7 ( m/V )，extraction time 93 min，ultrasonic time 36 min，volume fraction of ethanol 55%，and the yield of tea saponin was 14. 708% under tliese conditions. According to this optimization scheme，the tes­ting results showed that tlie model had high reliability and can predict tlie actual situation. Meanwhile，the results of bac­teriostatic effect showed sis effect on Eshg%hi cl.

Key words: tea saponin % ultrasonic assisted ethanol extraction method % response surface optimization experiment % bacteri-ostaticJfJct

that

tea

saponin had

beter bacteriostasis effect on Stayhylococccs

aureus，bu

我国每年产生的油茶籽在一百万吨左右，剩余 残留的油茶籽粕产量为七十万吨/年[1]，且呈增长 的趋势[2]，榨完油后的茶籽饼大部分都被废弃，甚 至当做垃圾烧掉，得不到很好的利用。茶皂素是一 种五环三萜类皂苷，其基本结构由皂苷元、糖体、有 机酸构成[3]，同时也是一类良好的表面活性剂，其 起泡和去污效果强[4]，同时还具备抗菌消炎[5]、抗 高血压、抗渗透和抑制酒精吸收等生物活性[6,7]。

我国对茶皂素的研究直到20世纪80年代才有较大 的突破[8]，茶皂素提取工艺研究报道较多，包括水

收稿日期\"2017-08-24

接受日期\"2017-10-30

提法、醇提法以及超声波/微波辅助提取法。提取工 艺中很多利用正交法优化。而利用超声波辅助乙醇 溶液提取的方法并利用响应面优化提取的方法进行 研究相对较少，尤其是一般均设计三因素三水平的 优化实验，罕见有设计四因素三水平的优化实验。 本文采用超声波辅助乙醇溶液的方法并设计了四因 素三水平的响应面优化实验提取茶籽粕中的茶皂 素，相较于其他的优化提取工艺的实验次数多[9]， 因素水平多[10]，结果更精确，同时考察了茶皂素的 抑菌活性，为后续研究奠定了一定的理论基础。

1材料与方法

基金项目：宿州区域发展协同创新中心学生开放课题（2015SZX

TXSKF02 $%宿州学院教授（博士 $科研启动基金

1.1材料与仪器 1.1.1实验材料与试剂

浓硫酸、石油醚、丙酮，香草醛、无水乙醇，均为

(2015JB09);宿州学院药物生物技术研究所开放课题 (2015YKF04)

!通信作者 E-mail:ninabaol984@163. com

128

天然产物研究与开发

Vol. 30

分析纯国药集团化学试剂有限公司；茶皂素标准品

(BM161107052 )，分析纯上海宝曼生物科技有限公 司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（安徽农业大学生命 科学学院）。1.1.2 实验仪器

722型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪 器有限公司；SHZ-D循环水真空泵，巩义市予华仪器 有限公司；RE-501型旋转蒸发器，巩义市科瑞仪器 有限公司;TG16A-W

S

恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 香草醛-硫酸法测定茶皂素的含量[11]1.2.1.1标准曲线绘制

称取10.0 mg茶皂素标准样品，加入适量乙醇 (80b)溶解，10 mL容量瓶定容，摇勻，得到浓度1

mg/mL的标准溶液，备用。分别取5支试管按表1

台式高速离心机，湖南湘仪实

顺序加入所需试剂，在冰水浴环境中缓缓加入浓硫 酸，充分震荡后，放于60 °C水浴锅中15 ~ 20 m7,然 后继续放到冰水浴环境中，10 m7后，在550 ;m下 测定茶皂素的吸光度[12]，建立茶皂素质量浓度（C)- 吸光度值(A)之间的线性关系，得到茶皂素的标准 曲线方程：y = 0.5087X + 0.0235，（= 0.9909。

验室仪器开发有限公司；KQ5200E数控超声波清洗 器，昆山市超声仪器有限公司；BBS-SCD-A超净工 作台，北京王堂南翼科技有限公司；SHP-250型生化 培养箱，上海三发科学仪器有限公司；G

b

+D

WY

-型 -240

高压蒸汽灭菌锅，厦门致微仪器有限公司；ZW

Table 1

表1茶皂素标准曲线试剂添加顺序表

Tea saponin standardcurve reagent adding sequence

试剂

Reagent

12345

茶皂素标准溶液

Standard solution of tea saponin ( mL)

80b

0.10.40.54

0.20.30.54

0.30.20.54

0.40.10.54

0.500.54

乙醇 80b Ethanol (mL)

香草醛溶液 Vanillin solution (mL)

77b

浓硫酸 77b sulfuric acid (mL)

样品含量测定

1.2.1.2

取自提得到的茶皂素粗品，依据1.2.1中的步 骤进行操作，计算茶皂素的纯度和得率。

茶皂素纯度和得率的计算公式如下：

茶皂素的纯度:X(b) sCVn/ID

茶皂素的得率:Y(b) = XM2/M

脱脂，干燥，备用。

1.2.4茶皂素的提取流程

称取适量干燥处理好的茶籽粕粉末#石油醚脱 脂#超声波辅助乙醇浸提#离心分离#旋转蒸发浓 缩#加入沉淀剂#离心分离#干燥获得粗茶皂素1.2.5 超声波辅助乙醇提取法

称取5份处理好的茶籽粕，每份10 /，考察料液 比、浸提时间、超声时间及乙醇体积分数对茶皂素提 取率的影响。

实验参数设置为：（1)料液比:1:3、1:5、1:7、1: 9、1: 11 (m/V);(2)浸提时间：30、60、90、120、150

min;(3)超声时间:20、30、+0、50、60min;( + )乙醇

式中\"X\"茶皂素的纯度（b ); Y\"茶皂素的得率 (b);C:样品溶液的浓度（m//mL);V:测量液的体 积（mL);n:样品的稀释倍数;Mi :测吸光度A所需 的原料(mg);M2 :茶皂素粗品（mg);M:原材料茶好 柏的质量（mg)。

1.2.2茶皂素的显色验证实验

香草醛一浓硫酸显色法是目前较为常用的茶皂 素显色验证方法，其反应原理可能是:皂苷在浓硫酸 氧化作用下脱氢，与香草醛加成反应后，生成红色物 质[13]。此方法相对其他皂苷验证方法，具有实验操 作方便，耗时短且反应灵敏等优点。1.2.3 油茶籽饼粕的预处理

将油茶好饼粉碎成细小颗粒，过+0目筛，干燥，

体积分数:+5b、55b、65b、75b、85b。1.2.6 响应面（Box-Behnken)实验设计

通过单因素实验，以料液比（A)、浸提时间 (')、超声时间（C )、乙醇体积分数（D)为变量，每个 因素设置3个水平，用-1、0、+1进行水平编码，因素 水平编码表方案见表2。据此进行中心组合实验设 结果求平均值，茶皂素得率计，每组实验重复3次，

Vol. 30

鲍妮娜等:油茶籽粕中茶皂素的优化提取及抑菌活性的研究129

为响应值。选用Design-Expert软件进行数据拟合 分析，设计了 4因素3水平，进行响应面实验。

表2响应面分析因素水平编码表

Table 2 Independent variable and experimental levels for Box-Behnken design

因素

编码

Factor

Code料液比-olid to liquid ratio

A浸提时间 Extraction time (min)B超声时间 Ultrasonic time ( min)C乙醇体积分数 Volume fraction of ethanol ( b )D

1.2.7荼皂素抑菌性研究

选用牛津 行抑菌 。用移液枪吸取

120 !l囷i，轻轻用涂布棒将囷i均勾的涂布在培 养基表面，然后用

取牛津杯，在养基表面垂

直放置并使其稳定，再在牛津杯中加入不同质 的的 素溶液，于冰中放置3〜4 h， 充分扩散。37 e

置培养24 h，观察实验结果。

2结果与讨论

2.1料液比对茶皂素得率的影响

由图1

，液为1:3(m/V)时，茶皂素得

率较低;随着料液比由1:3(m/V)增加到1:7(5

V)时， 素率逐渐增加，当料液 1:

(m

V

)， 素的得率 ，后逐 稳。考

溶剂使用 ，浸不

，达不

的

%

溶使用太多，

药品消耗太多，回收

耗能、工作量大，成本消耗较高，因此选用料液比1:

7(m/V)为 。

图1料液比对茶皂素得率的影响

Fig. 1 Effects of solid to liquid ratio on yield of tea saponin

2@浸 间对茶皂素得率的

理 ，浸时间越长，

素取率越

高。但在实际 中，应达 后，传质

动力

，浸

，提取率不再增加，因

■

浸 时间 。 2 中

，浸时间在30 min时，得率低；之后，随浸 时间增加，得率呈

增加。浸提时间为90

水平Level

-1

0

11:6

1:71:8

759010535404550

55

60

min时， 素得率达

大； 浸提时间的继续增加，得率 ， 能是因为浸提时间的增加，浸

液中

素外

物质，

、单宁、鞣质等

质的溶出， 了 素，从而使 素浸 率

低。因 浸提时间为90 min较为合理。

图2浸提时间对茶皂素得率的影响

Fig. 2 Effects of extraction time on yield of tea saponin

2.3超声时间对茶皂素得率的影响

物中的活性成分进行提取时，通需要将植

物细胞破坏，使中的 成分释放 。

传

统的浸 ， ， 不能

的将植物细胞破坏;而 化学

， 导致提取成分的活性丧

失，达不

目的。

辅助提取法，其在

工作时，产生其特有的空化作用[14]，使受到持久的

压和拉伸， 的破坏植物细胞壁，从而使细胞破裂，释放活性成分。由 3 ， 时间 在 40 min，

时

间的增加， 素率逐

高；当时间为40 min时， 素率到达最大值；

时间在40〜50 min间，得率

％ 时间的 增加，茶素得率开始

。

能是

时间 ，产生局部高温，皂素中相关物质糊化，亦 质

的溶出，使 素得率。综合

，选

时间为40 min较为 。2.4乙

分

茶皂素得率的由图4

，

体分数为55b时，茶

皂素得率达到最大值。之后

体积分数的增

130天然产物研究与开发

Vol. 30

图3超声时间对茶皂素得率的影响

Fig. 3 4fects of ultrasonic time on yield of tea saponin

图4乙醇体积分数对茶皂素得率的影响

Fig. 4 Effects of volume fraction of ethanol on yield of tea

saponin

加， 素率逐

低。原因可能是由

2. 5

响应面优化分析

难，因 按照设计的 行 浸提， 设计表格

为及茶皂素得率结果见表3。实验结果的方差分析，

见表4。

表3

中心组合实验设计及响应值

B

C

D

R (%)11.7814@189@4314.279@8511.2512.039@789@7514@329@829@2513. 179@05

Table 3 Design and result of Box-Behnken analysis

醇体积分数的增加，萃取液的体系极性减小，茶皂素 的极性大小范围不在其范围内[15+，取

率不高，所 体积分数为55%的 合适。

序

No.A

12

345

6

7

8

9

101112

13141516171819

202122

23242526272829

10101-100-10-10-10100-10000101-100000-10000-100010-110110001000-1-1-11100000110011-1001-100-100-1-100-1000000-1-11010000-10-10001010-11001-1

10@12

9@8412@189@2814@3512.7414.2310@5812.8213.2312.959.1811.049@749@21

Vol. 30

鲍妮娜等:油茶籽粕中茶皂素的优化提取及抑菌活性的研究131

由表4可知，模型的F值为664. 35,可以说明 此分析是显著的，只有0. 01%的概率说明模型是由 于干扰噪声引起的误差。对表3中的实验结果进行 处理，得到关于茶皂素得率的回归方程：

P = 14. 27 + 0. 37A+ 0. 20B-1.06C + 0. 45D+ 0.15AB+ 0. 58AC+ 1. 15AD-0. 42BC+ 0. 17BD +

表4

0. 67CD-1.71 A2-3. 03 B2-0. 68C2-1. 61D2。上述方 程的（为0. 9970，回归方程中失拟项$ =0.1607 > 0.05,是非显著的，说明回归方程的拟合度较好，可 信度较高，通过回归方程可以很好的预测真实实验

数值。

方差分析结果

G值G-value664.35155.4144.211233.94220.49

Table 4 Analysis of variance

因素

Factor

平方和

Sum of square100.991.690.4813.42.390.0871.335.290.7

自由度

Degree of freedom

14

均方

Mean square7.211.690.4813.42.390.0871.335.290.7

$值可能性

Probability > G

模型Model

ABCDABACADBCBDCDA2B2

0.12

1.8

19.0359.672.9816.820.150.130.019101.14

C2D2

剩余 Residue失拟项Lack of fit纯误差Pure error

总差Sum

1

1111111111111

14

<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

0.0133

8.01122.86

487.1864.2110.65165.371752.755495274.541549.25

<0.0001<0.0001<0.0001

0.0057

0.121.8

19.0359.672.9816.82

<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

0.1607

0.011

0.0134.65E-03

2.87

10

428

利用Design-Expert8.0软件设计响应面实验, 研究参数及其交互作用对茶皂素提取的影响，三维 响应面图显示和反应每个变量的实验水平之间的相 互作用。图5(a)所示为因素A和因素B的交互作 用对茶皂素得率的影响，随着料液比和浸提时间的 增加，茶皂素得率呈先上升，后下降的趋势，这极有 可能是由于料液比的增大和浸提时间的增长增加了 其溶解度，但由于浸提时间过长增加其他杂质的溶 入，从而影响茶皂素的得率。图5 (Z)为因素A和 因素C的交互作用对茶皂素得率的影响，随着料液 比和超声时间的增加，茶皂素得率呈先升高后降低 的趋势，这可能是由于超声时间的继续增加，破坏了

茶皂素的结构从而导致得率降低。图2(A为因素 3和因素C的交互作用对茶皂素得率的影响，茶皂 素得率随着料液比和乙醇体积分数的增加呈现先增 加后降低的趋势，这可能是由于随着乙醇体积分数

的增加改变了溶液极性从而使得率降低。图5(d) 为因素'和因素C的交互作用对茶皂素得率的影 响，茶皂素得率随着浸提时间和超声时间的增加呈 现先上升后降低的趋势。图5(e)为因素B和因素

D的交互作用对茶皂素得率的影响，茶皂素得率随

着超声时间和乙醇体积分数的增加先增加后降低。 图5(f)为因素C和因素D的交互作用对茶皂素得 率的影响，茶皂素得率随着超声时间和乙醇体积分

132

天然产物研究与开发

Vol. 30

数的增加呈现先增加后降低的趋势。

通

模

程的求解，

素优化

提取 为：料液 1:7(m/V)、 体分数

55% )浸时间93 min、 时间36 min，在

下茶皂素得率为14. 708%。根据此优化条件进行 验证实验，实验三次，平均值为14. 67%，实验结果 与模型优化模拟结果基本一致， 中，

模在实际实

高，更加肯定了模型的可信度。

图5

料液比和浸提时间（6、料液比和超声时间（b)、料液比和体积分数（C)、浸提时间和超声时间（d)、浸提时间和乙醇

分数（e)及超声间和乙 分数（f)的交互 茶皂素 的影响

trasonic time ( b), solid to

litjuid

ratio

and volume fraction of etlianol ( c),extraction

time

and

Fig. 5 ResjDonse surface plots showing the mutual effects of solid to litjuid ratio and extraction time ( a) , solid to litjuid ratio and ul­

ultrason

tion time and volume fraction of etlianol ( e) as well as ultrasonic time and volume fraction of etlianol (f) on yield of teasaponin

26

.抑菌实验结果分析 抑菌

结果见表5由表5

,

，

果随茶皂素浓度的增大而增强对大肠杆菌抑菌效

，

素 不

。

对金黄色 球菌 的抑菌

Table 5

，

且抑菌

表5测定抑菌圈直径大小

Determination of inhibition zonediameter

菌种

Testing bacteria

抑菌圈直径大

Inhibition zone diameter (mm)

40 mgmL

9

50 mg mL

60 mg mL

16

茶阜素浓度 Tea saponin concentration金黄色葡萄球菌

大肠杆菌.0

0

120

0

高

作等优点。

素对

，且抑菌

3结论

本文

素为研究

，采

用

-

辅时间及

素 大的优势，相

取率、工 单，

素在抑菌

金黄色 不

球菌

取时间， 行 的抑菌

研究，发现

助提取，研究了料液比、浸时间、

体积分数等因素

素提取率的影响，并以

响应面设计 取进行优化，优化 为:料

液比1 : 7 ( m/V )、浸提时间93 min、超声时间36

min、

素 的增大而增强，对大肠杆菌的抑菌效

。

体 分 55% ，

浸 取

和

辅助提取

素 率 为取法相 中的

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