１４ 甘肃畜牧兽医 ２０１２年３（总２２４）期 一例猪圆环病毒２型感染的ＰＣＲ检测 韩 勇 （山东省日照市动物疫病预防控制中心，山东 日照２７６８００） 摘要：对山东省日照市某规模化猪场发现的患有断奶仔猪多系统衰弱综合征（ＰＭＷＳ）典型症状 的病猪，采用针对猪圆环病毒２型（ＰＣＶ２）开放阅读框２（ＯＲＦ２）设计的特异性引物进行ＰＣＲ检测， 从病猪的组织样品中检测ＰＣｖ２。从１Ｏ头发病猪的组织样品中检测ＰＣＶ２，结果有９头呈阳性结果。 关键词：猪圆环病毒２型；ＰＭＷＳ；ＰＣＲ 中国图书分类号：Ｓ ８５２．６５ ９．２文献标识码：Ａ 文章编号：１００６－－７９９Ｘ（２０１２）０３—Ｏ０１４—ｏ３ 断奶仔猪多系统衰弱综合征（ｐｏｓｔ— ｗｅａｎｉｎｇ Ｍｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｗｅａｋ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＭＷＳ） 环境（ｐＨ３．０）及氯仿中可以存活较长时间， 在７２℃能存活１５ ｍｉｎ，５６℃不能将其灭活。 近来在日照市某些规模化猪场发现类似 是近年来新发现的一种病毒性传染病。本病 主要发生于４—１４周龄的断奶仔猪，是一种 能够感染多种组织器官的疾病，患猪主要表 现为精神沉郁、渐进性消瘦、呼吸困难和显著 的淋巴结肿大，偶尔有腹泻、胃溃疡和黄疸等 症状。在急性暴发的情况下，发病率和死亡 率会很严重，能达到４％～１０％的发病率并 ＰＭＷＳ的病例，本研究采集病猪肝、脾、肺、 肾、淋巴结、血清等，用针对ＰＣＶ开放阅读框 ２（ＯＲＦ２）特异性的引物进行ＰＣＲ检测，检测 出阳性结果，现将结果报告如下。 １ 材料与方法 １．１ 发病情况 有７０％一８０％的死亡率。感染猪容易继发 其它病毒性或细菌性疾病，使病情加重。 ＰＭＷＳ的病原是猪圆环病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ，ＰＣＶ），包括ｌ型和２型两种类型 （ＰＣＶ１，ＰＣＶ２），其中ＰＣＶ２是ＰＭＷＳ的致病 原。猪圆环病毒的基因组中开放阅读框ｌ （ＯＲＦ１）和开放阅读框２（ＯＲＦ２）是ＰＣＶ１和 ＰＣＶ２共有的主要阅读框，ＰＣＶＩ与ＰＣＶ２的 ＯＲＦ２基因组同源性只有６５％～６７％ Ｊ。国 猪场中５—１２周龄的猪表现生长受阻、 消瘦，全身黄疸，渗出性皮炎等症状，病初，猪 体温上升至４０￣Ｃ，后降至正常。发病初眼结 膜发黄，后出血；病初猪便秘，后严重便血，并 死亡。 剖检病变，全身贫血、黄疸，最显著的变 化是全身淋巴结特别是腹股沟浅淋巴结、肠 系膜淋巴结肿大，切面硬度增大。可见均匀 的白色，有的出血，红白相间。脾肿大、梗死。 肺间质性水肿，肺边缘及部分区域实变，肺尖 叶和心叶肺泡出血，颜色加深。肾脏颜色变 深，被膜下有坏死灶。心肌及心冠状脂肪出 血，心肌有白色梗死区。肝脏黄疸，肝小叶间 结缔组织增生，切面有颗粒感。肠出血性卡 内外通常采用ＯＲＦ２设计特异性引物扩增 ＰＣＶ２基因片段，与ＰＣＶ１不发生交叉反应。 圆环病毒对外界环境的抵抗力较强，在酸性 作者简介：韩勇（１９８０一），汉，山东日照人。河 南农业大学预防兽医学研究生，研究方向为动物传 染病和动物分子生物学。 他性炎症，肠粘膜脱落。胃壁粘膜脱落，出血 性溃疡。 Ｖｏ１．４２．№３ 研究报告 １５ １．２病料采取 系为５０ Ｌ，包括１０ Ｘ ＰＣＲ缓冲液５ Ｌ， ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／／￣Ｌ）４１ｚＬ，ＭｇＣ１２（２５ｍｍｏｌ／ 本试验采集猪场中ｌ０头表现ＰＭＷＳ症 状的断奶仔猪，取其肝、脾、肺、肾、淋巴结、血 清等病料，按１：５加ｐＨ７．２的Ｈａｎｋ’ｓ液， 于灭菌组织研磨器中充分研磨成乳状物，一 ２０℃反复冻融３次，５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取 上清液，一２０℃保存备用。 Ｌ）３５ Ｌ，弓ｌ物Ｐｌ，Ｐ２各１ Ｌ，模板１ Ｌ， Ｔａｑ酶（５ ｕ／ ）０．５ ，ｄｄＨ２０３４ ｔｒＬ。 反应条件为９５℃预变性５ ｍｉｎ，为１个循 环；之后以９４℃ｌｍｉｎ，５０ｏＣｌｍｉｎ，７２℃１．５ ｍｉｎ。 共进行３０个循环，最后７２℃延伸１０ｒａｉｎ。取 １．３病料的细茵检测 取心血、肝、肺、脾、胆囊等病料分别接种 于血液琼脂平板、普通琼脂平板、伊红美蓝琼 脂平板，进行细菌分离。 １．４ ＰＣＲ检测 １．４．１试剂与材料：琼脂糖、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、 ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ等，试剂均购自大连宝生物工 程公司。标准ＰＣＶ２毒株由日照市动物疫病 预防控制中心保存。 １．４．２引物参考：引物参考Ｇｅｎｂａｎｋ中注册 的ＰＣＶ２序列设计了针对ＰＣＶ２开放阅读框 ２（０ＲＦ２）的特异性引物。 上游引物：５ 一Ａ，ＩＴＩ’ＧＴＡ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＣＴＧ Ｔ一３ 下游引物：３ 一ＡＧＧ ＣＴｒ ＣＣＡ ＣＧＣ ＣＣＴ Ｃ一５ ｐｌ和下游引物ｐ２的扩增片段长 ５８５ ｂｐ。引物由宝生物工程（大连）有限公司 合成，用灭菌击离子水配成５０ｐｍｏｌ／ｌ￣Ｌ溶 液，一２０℃保存备用。 １．４．３病料总ＤＮＡ的提取：取３００ 上述 病料上清液，加等体积的裂解液（２０ｍｍｏｌｆ ＩｘＬ Ｔｒｉｓ—ＣＩ ｐＨ８．０；０，５％ＳＤＳ），５ Ｌ蛋白 酶Ｋ（２０ｍｍｏｌ／ｌ￣Ｌ），５０ｏＣ消化２ ｈ。１２０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ取上清液。然后分别用等体 积的饱和酚／氯仿／异戊醇（Ｖ／Ｖ／Ｖ＝２５／２４／ １）提取组织中的总ＤＮＡ，最后用乙醇沉淀 ＤＮＡ，并将沉淀的ＤＮＡ溶解在无ＤＮＡ酶的 ＴＥ（ｐＨ７．５）缓冲液中，一２０℃保存备用 Ｊ。 １．４．４ ＰＣＲ扩增：将上述抽提得到的总 ＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体 ５ ｔｒＬＰＣＲ产物在０．８％琼脂糖上电泳，于紫 外灯下观察，拍照并记录试验结果。 ２结果 ２．１ ＰＣＲ检测结果 分别在肝、脾、肺、肾、淋巴结和血清等病 料中扩增出大约５８５ｂｐ的片段。与ＰＣＶ２阳 性对照扩增的片段大小一致。阴性对照中没 有扩增出任何条带。 Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ Ｍ：ＤＩ２０００ Ｍａｒｋｅｒ；１：阳性对照； ２－７：样品ＰＣＲ扩增的结果；８：阴性对照 图１ ＰＣＲ检测结果 ２．２ 细茵检测结果 病料接种的血琼脂平板、普通营养琼脂 平板、伊红美蓝琼脂平板均无细菌生长。 ３ 讨论 现已证实圆环病毒会导致断奶仔猪多系 统衰弱综台征（ＰＭＷＳ）的主要病原猪是圆环 病毒的天然宿主，病毒通过胎盘垂直传播。 或在猪群中水平传播，各种年龄、不同性别的 猪都可感染，生长猪发病率高。多呈隐性感 染，但４—１６周龄的断奶仔猪感染会导致严 重的ＰＭＷＳ等疾病。由于ＰＭＷＳ是一种免 １６ 甘肃畜牧兽医 ２０１２年３（总２２４）期 灵台县肉牛二元、三元杂交选配方案的研究 宋积锁 ，朱红强 ，冯玲霞 （Ｉ．甘肃省灵台县畜牧技术推广中心，甘肃灵台７４４４００；２．甘肃省畜牧兽医研究所） 摘要：选用南德温、西门塔尔、利木辛的细管冻精分别授配本地黄牛母牛。用南德温冻精分别授 配利黄Ｆ，、西黄Ｆ，母牛，用西门塔尔冻精分别授配利黄Ｆ。、南黄Ｆ 母牛，用利木辛冻精分别授配西 黄Ｆ。、南黄Ｆ。母牛。母牛和犊牛在相同饲养管理条件下，测定二元杂交代在一定生长阶段的体尺、 体重等主要生长发育指标。结果表明，南黄组合二元杂交犊牛初生、３月龄、６月龄的体尺、体重明显 高于其他组合二元杂交代；南德温作为父本改良西黄牛、利黄牛效果非常显著，明显优于南德温二元 杂交牛，同时，杂合了南德温与西门塔尔或利木辛的品种优势，且克服了西门塔尔和利木辛的缺点， 可以作为灵台县及类似生态环境条件下肉牛三元杂交的终端父本品种在黄牛改良中推广应用。 关键词：肉牛；二元杂交；三元杂交；方案 中国图书分类号：Ｓ ８２３．３ ２文献标识码：Ａ 文章编号：１００６￣７９９Ｘ｛２０１２）０３—０ｏ１６－－－－－－０３ 灵台县是甘肃省肉牛养殖大县，养牛业 是全县主要产业之一。为了进一步加强全县 黄牛改良步伐，提高牛的个体生产性能，特别 是肉用性能，灵台县从２００４年引进了南德温 牛、西门塔尔及利木辛牛细管冻精，在全县进 行了规模化冻配推广。同时，测定了不同品 种间肉牛二元、三元杂交后代在一定生长阶 段的体尺、体重等生产性能，并进行了肉牛二 元、三元杂交选配方案研究，筛选出了适合灵 台县肉牛生产的三元杂交模式，有力的推动 ， 、 了全县黄牛改良和肉牛产业开发。 １ 材料与方法 １．１ 杂交试验母牛及公牛品种的选择 二元杂交试验共选择体质、年龄、胎次相 近的本地黄牛４５头，分成三组，每组各ｌ５ 头，南德温、西门塔尔及利木辛细管冻精各 ３０支。 三元杂交共选定二元杂交母牛南黄Ｆ，、 西黄Ｆ 、利黄Ｆ 母牛各２Ｏ头，南德温、西门 塔尔及利木辛细管冻精各４０支。 主要参考文献 ［１］Ｃｌａｒｋ Ｅ Ｇ．Ｐｏｓｔ—ｗｅａｎｉｎｇ ｍｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｅ ｗａｓｔｉｎｇ Ｓｙｎ・ ｄｒｏｍｅ［Ａ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｐｒａｅｔｉｅ—ｔｉｏｎｅｒｓ ｆＣ１．１９９７．４９９—５０１． 疫抑制性疾病。而且还怀疑ＰＣＶ２与猪皮炎 和肾脏综合征、间质性肺炎和繁殖障碍等疾 病有关，往往会给养猪业造成严重的威胁和 损失。 本研究中发病猪呈现的特征性临床症状 及病理变化与ＰＣＶ２感染引起的ＰＭｗＳ一 ［２］刘正飞．陈焕春，琚春梅．猪圆环病毒病研究进 展［Ｊ］．动物医学进展，２００２，２３（２）：１４—２６． ［３］Ｓｅｇａｌｅ．Ｊ ａｎｄ Ｄｏｍｉｎｇｏ．Ｍ．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｂｅ— ｐｈｍｐｍｈｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｉｒｃｏｖｉｍｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ ＰＭＷＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．１６ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｉｇ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ ｓｏｃｉｅｔｙ 致。利用ＰＣＲ检测方法可以快速简便、准确 地对ＰＣＶ２病原进行检测。本研究为圆环病 毒的快速准确诊断提供了科学依据。 ｃｏｎｇｒｅｓｓ［ｃ．【．Ｍｅｌｂｏｕｍｅ，２０００：２１—３１．