常用染料的激发与发射

Fluorescent Dye （荧光染Excitation （激发波长， Emission （发射波长， 料） nm ） nm ） Cy2 ™ GFP(Red Shifted) YO-PRO ™ -1 YOYO ™-1 Calcein FITC FluorX Alexa ™ 488 Rhodamine 110 ABI,5-FAM Oregon Green ™500 Oregon Green ™ 488 RlboGreen ™ Rhodamine Green ™ Rhodamine123 Magnesium Green ™ Calcium Green ™ TO-PRO ™-1 TOTO-1 ABI,JOE BODIPY™ 530/550 Dil BODIPY™R BODIPY?558/568 BODIPY?564/570 Cy3 ™ Alexa ™ 546 TRITC Magnesium Orange ™ Phycoerythrin,R & B Rhodamine Phalloidin Calcium Orange ™ Pyronin Y 489 488 491 491 494 494 494 490 496 494 503 496 500 502 507 506 506 514 514 520 530 549 542 558 564 550 555 547 550 565 550 549 555 506 507 509 509 517 518 519 520 520 522 522 524 525 527 529 531 533 533 533 548 550 565 568 568 570 570 570 572 575 575 575 576 580 Rhodamine B ABI,TAMRA Rhodamine Red ™ Cy3.5 ™ ABI,ROX Calcium Crimson ™ Alexa ™ 594 Texas Red Nile Red YO-PRO ™ -3 YOYO ™ -3 R-Phycocyanin C-Phycocyanin TO-PRO ™ -3 TOTO-3 DiD DilC’(5) Cy5 ™ Thiadicarbocyanine Cy5.5 备注：发射波长的颜色及频率 颜色 红色 橙色 黄色 绿色 青色 蓝色 紫色 555 560 570 581 588 590 590 595 549 612 612 618 620 642 642 644 649 651 675 580 582 590 596 608 615 615 615 628 631 631 642 648 660 660 665 670 671 694 波长 约625—740纳米 约590—625纳米 约565—570纳米 约500—565纳米 约485—500纳米 约440—485纳米 约380—440纳米 频率 约480—405兆赫 约510—480兆赫 约530—510兆赫 约600—530兆赫 约620—600兆赫 约680—620兆赫 约790—680兆赫

荧光染料的使用

吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。EB:染色DNA和RNA荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。荧

光染料Ho33342和若丹明123: 活细胞双荧光染色观察细胞核和线粒体。一般的生物染料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后改变了细胞膜的通透性，染料才能进入细胞内。但有些活体染料能进入活细胞，并对细胞不产生毒性作用。荧光染料Ho33342和若丹明123都是活体染料。Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，若丹明123能与线粒体进行特异的结合。采用两种荧光染料的混合染液可对一个活细胞的核和线粒体同时染色。

荧光组化实验中应注意的几个问题：1．每种荧光染料，均有自己的最适PH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的PH值的缓冲液中进行。2．一放荧光染色在20℃以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3．在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4．一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降， 这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。