1材料与仪器
1.1材料
1.2试剂
芦丁，无水乙醇，氢氧化钠，石油醚，硝酸铝，三氯化铁，三氯化铝，浓氨水，浓盐酸，镁粉， 亚硝酸钠(以上均为国产
分析纯)，实验所用水均为蒸馏水。
1.3实验仪器
电热恒温水浴锅
电子天平(感量 0.0001g) 722型光栅分光光度计 索氏提取器
量筒(100ml,10ml)25ml比色管 移液管 小试管 白瓷板 锥形瓶
圆底烧瓶
100m 容量瓶
2实验原理
2.1提取原理
溶剂提取原理 游离黄酮黄酮昔
乙辱
溶解范围广
+
+
备注
(甲醇)著■甘元均可溶(90-95%) 沸水
多糖昔易于水
(6M)甲醇毒性大
+
成本低、安全, 水溶性杂质多
臓性水或
碱性乙醇酚强基的酸性 + 稀氢氧化钠溶出能力强 +石灰水除杂质效果好
1
2.2分离方法及原理
）溶剂萃取法 分离依据 黄酮与杂质 昔与昔元 昔元与昔元
分离工艺
之间的极性（分配系数K）差异
原料的提取苹缩液（水溶液）
依次以石油耿、乙馳、 乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取
石油駆液 乙豔液 （脂溶性杂质）|
回收
乙酸乙酯
|
回收
水饱和正丁醇 母液 （水溶性杂质） 减压回收
誓元 单糖瞽 多糖昔
（二）pH梯度萃取法
分离依据：
游离黄酮类化合物的酸性差异（见黄酮酸性规律） 分离工艺：
爸游离黄酮的乙瞇液
依次以 5%NiiH0h . 5%Na2C0
0. 2%NSLOH. 4%NaOH^取
5%NaHCO3< 5%Na2CO3液 0. 2KNaOH液
4%NaOH液 母液
（脂溶性杂质） 旧黄酮
丄酸化 2
7, 4^ -OH黄酮 7或4丁 -OH黄酮一般-OH黄酮 5」
3 实验部分
3.1 原料的预处理
金星科厥类叶T除杂T水洗T晾干T粉碎
3.2 芦丁—标准溶液的配制
将芦丁在干燥箱里用 120C条件下恒重1.5h,然后精确称取芦丁标准品 O.OIg用85%勺乙醇溶 液配制成 100.00mL 的溶液，备用。
3.3 测定波长勺选择
精确移取芦丁标准溶液 0.50mL, 置于 25.00mL 勺比色管中，用质量分数为 85%勺乙醇稀释到 10.00mL 处，加人 5%勺亚硝酸钠溶液 0.80mL, 混匀，放置 10min; 加入 10%硝酸铝溶液 0.80mL , 混匀， 放置 10min, 再加入 4%勺氢氧化钠溶液 10.00mL, 混匀，放置 10min, 加入 85%勺乙醇溶液至刻度，摇 匀，10min后在460〜560nm处测定吸光度，⑷（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长。
3.4 芦丁标准曲线勺绘制
精确吸取芦丁标准溶液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于6支25.00mL的比色管中， 用质量分数为 85%勺乙醇稀释到 10.00mL 处，加人 5%勺亚硝酸钠溶液 0.80mL, 混匀，放置 10min; 加 入1 0%硝酸铝溶液 0.80mL , 混匀，放置 10min, 再加入 4%的氢氧化钠溶液 10.00mL, 混匀，放置 10min， 加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀， 10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第一瓶为空白溶液） 然后以吸光度和芦丁溶液浓度做图，绘制标准曲线。
3.5 黄酮类化合物的特征性实验
下：
[5]-[6]
在一定条件下对提取的黄酮类化合物进行特征性实验，具体内容如
（1）盐酸一镁粉反应：取 1.00mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸数滴（ 加入），观察其泡沫颜色。 （ 2） 三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加 吹干，观察颜色变化。 （ 3） 三氯化铁反应：取几滴提取液于白瓷板上，滴加
1次
1%三氯化铝乙醇溶液， 1%三氯化铁乙醇溶液，
0.5min ，观察
观察其颜色。（ 4） 浓氨水反应：取乙醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏 其颜色变化。
3.6 单因素实验
2.6.1 较佳提取剂质量分数的确定
准确称取 3g 处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇 80%、
75%的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为
80C下回流提取3h.提取完毕，用与提取剂的
100:00mL 容量瓶中，然后精确吸取
10.00mL处，加人 、 95%、 85%
质量分数相同的乙醇反复洗涤圆底烧瓶、滤纸包，将其定容于
0.50mL提取液置于25.00mL的比色管中，用与提取剂质量分数相同的乙醇稀释到
5%的亚硝酸钠溶液 0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL ,混匀，放置10min,再 加入 4%的氢氧化钠溶液 10.00mL, 混匀，放置 10min, 加入 85%的乙醇溶液至刻度，摇匀， 于波长500nm处测定其吸光度，同时做三组平行实验。
10min 后
3
2.6.2 较佳提取时间的确定
4
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用 间用60mL 85%的乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为 如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。 2.6.3较佳提取温度的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在
2h、2.5h、3h、3.5h提取时
80C下回流提取，乙醇提取液的处理方法
75C、80 C、85C、90 C的水
浴温度下用60mL 85%的乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取 2.5 h，乙醇提取液的处理方法如前，测 定其吸光度，同时做三组平行实验。 2.6.4较佳物料比的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，
分别用30mL 45mL、60mL、75mL、90mL
2.5 h,乙醇提取液的处理方
的85%的乙醇溶液在水浴温度为 85 C下对3g金星厥科叶样品回流提取 法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.7叶绿素对黄酮类物质的影响
称取15g金星厥科叶样品放于锥形瓶中用 90mL的石油醚浸泡8个小时对其脱色，过滤、干燥。 然后准确称取处理过的 3g金星厥科叶样品用质量分数为 85%的60mL乙醇溶液在水浴温度为 85 C下 对其回流提取2.5h，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。
3.8金星厥科叶中黄酮类化合物含量的测定
精密量取石油醚处理过的提取液
0.50mL,置于25.00mL的比色管中。力口 85%的乙醇稀释到
10.00mL，加入5%的亚硝酸钠溶液 0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL ,混匀， 放置10min,再加入4%勺氢氧化钠溶液 10.00mL,混匀，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度， 摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度。
同时做样品空白管.根据标准曲线计算提取物中黄酮类化合物的含量
.（把样品所测得吸光度的
平均值代入标准曲线方程，再算出0.50mL提取液中黄酮类化合物的浓度，然后再根据浓度算出样品 中黄酮类化合物的百分含量.）计算方法（公式）如下：
设样品中黄酮类化合物的含量为
，稀释以后的浓度为 C；原提取液的浓度为 C0 ；
Co 100ml 3.000g 1000 Co
C V Vo
4结果与讨论
4.1最大吸收波长的选择
将定量的黄酮提取液显色以后在 收波长，测定结果如下：
表1
波长与吸光度的关系
460〜560nm处测定吸光度，（以试剂样品做空白）选择最大吸
波长（nm） 吸光度（A） 波长（nm） 吸光度（A）
5
从表1中可以知道当波长在什么时候有最大吸收波峰。
4.2芦丁的标准曲线的绘制
精确吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL的芦丁标准溶液稀释、
显色以后在波长 500nm
处测定吸光度（以第一瓶为空白溶液），以浓度 （c）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线， 结果如下：
表2芦丁溶液浓度与吸光度的关系
浓度（mg/mL） 吸光度
0.002
0.004
0.008
0.012
0.016
实验结果表明黄酮类化合物含量在 Y=11.5548X-0.00406 R=0.99342,
0〜100ug/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程为
4.3黄酮类化合物的特征性实验
对所提取的黄酮类化合物进行特征性实验的结果如下表：
表3定性实验结果
试剂
现象
盐酸一镁粉 1%E氯化铝 1%E氯化铁
浓氨水
从表3可知，黄酮类化合物的特征性实验结果较符合黄酮类化合物的特征颜色反应， 中含有黄酮类化合物。
证明所提取
4.4单因素实验的结果
4.4.1较佳提取剂质量分数的确定
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇
75%的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为 结果如下：
表4不同乙醇质量分数对西山中黄酮类物质提取的结果
乙醇的质量分数（％）
吸光度1 吸光度2 吸光度3 平均值
无水乙醇
95
85
80
75
、95% 85% 80%、
80C下回流提取3h.显色后测其吸光度，测定
442 较佳提取时间的确定
6
准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用
时间用60mL 85%勺乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为 测定结果如下：
表5不同提取时间对西山中黄酮类物质的提取结果
提取时间（h）
2h、2.5h、3h、3.5h提取
80C下回流提取。显色后测其吸光度，
2
2.5
3
3.5
吸光度
1
吸光度
2
吸光度 3
平均值
4.4.3较佳提取温度的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在 温度
下用60mL 85%勺乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取
2.5 ho显色后测其吸光度，测定结果如下：
75 C、80 C、85 C、90 C的水浴
表6不同提取温度对西山中黄酮类物质的提取结果 ___________________ 提取温度（C） 吸光度1 吸光度2 吸光度3 平均值
4.4.4较佳物料比的确定
称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，
分别用30mL 45mL、60mL、75mL、90mL
75
80
85
90
质量分数为85%勺乙醇在水浴温度为 85C下对3g样品回流提取2.5 h。显色后测其吸光度，测定结 果如下：
表7 不同物料比对 金星厥科叶 中黄酮类物质的提取结果 ______________ 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30
物料比（w/v） 吸光度1 吸光度2 吸光度3 平均值
4.5叶绿素对黄酮类物质含量测定的影响
准确称取用石油醚脱色过的
3g金星厥科叶样品用质量分数为
85%勺乙醇60mL在水浴温度为
85C下对其回流提取 2.5h，显色后测其吸光度，测定结果如下：
表8 叶绿素和脂肪对黄酮类物质提取效果的影响 样品
吸光度1 吸光度2
石油醚浸泡
对照样
7
吸光度3 平均值
4.6金星厥科叶中黄酮类化合物含量
取黄酮提取液（用石油醚浸泡过的）0.50mL测定其吸光度并按公式计算其含量，
表9金星厥科叶中黄酮类化合物含量 项目
吸光度（C） 浓度（mg/mL ）
黄酮类化合物含量（％）
实验结果如下: 标准曲线
8
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容