优化气相色谱法测定酱油中对羟基苯甲酸酯类含量的方法

优化气相色谱法测定酱油中对羟基苯甲酸

酯类含量的方法

宋思园1，黄锦波2

（1.广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广州 510000；

2.吉姆斯（广州）实验技术有限公司，广州 510000）

摘 要：目的：优化气相色谱法测定酱油中对羟基苯甲酸酯类含量的分析方法。试样先后经饱和氯化钠溶液洗涤，盐酸酸化，无水乙醚提取，碳酸氢钠溶液洗涤后浓缩近干，无水乙醇溶解的条件下以外标法定量，通过

5种不同极性的色谱柱与柱温箱温度的系列变化进行测试，最终确定最佳分离柱为Inert Cap 1301，柱温箱的初始温度为90℃。结果：对羟基苯甲酸酯类的加标回收率在91%～103%之间，相对标准偏差在0.6%～0.8%之间，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯与对羟基苯甲酸丁酯的方法检出限分别为0.528mg/kg、 0.497mg/kg、0.473mg/kg与0.440mg/kg。结论：优化仪器分析方法后，测定酱油中对羟基苯甲酸酯类含量的灵敏度明显提高，分析时间明显缩短，加标回收良好，这有利于提高检测分析效率，减小分析时间成本。

关键词：气相色谱法；色谱柱；初始温度；酱油；对羟基苯甲酸酯类

中图分类号：TS202.3/O657.7+2/TS264.2 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2019）10-0141-07doi：10.19804/j.issn1006-2513.2019.10.017

Method for determining the content of parabens in soy sauce by

optimized gas chromatography

SONG Si-yuan，HUANG Jin-bo

（1. Guangdong Institute of Analysis(China National Analytical Center)，Guangzhou 510000；

2. James (Guangzhou) Experimental Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510000）

Abstract： Object：To optimize the instrumental analysis method for the determination of parabens in soy sauce by gas chromatography. The sample was washed successively with saturated sodium chloride solution， acidified by hydrochloric acid， extracted by anhydrous ether， washed by sodium bicarbonate solution， concentrated and dried， and dissolved under the condition of absolute ethanol， and passed through 5 different polar columns. The series of changes in the temperature of the column oven were tested to determine the optimum separation column for the Inert Cap 1301 and the initial temperature of the column oven was 90℃. Results：The recoveries of parabens ranged from 91% to 103%， and the relative standard deviations ranged from 0.6% to 0.8%. The detection limits of methyl p-hydroxy benzoate， ethyl p-hydroxy benzoate，propyl p-hydroxy benzoate and butyl p-hydroxy benzoate were 0.528mg/kg， 0.497mg/kg， 0.473mg/kg and 0.440mg/kg， respectively. Conclusion：After optimizing the instrumental analysis method， the sensitivity of determining the content of parabens in soy sauce is obviously improved， the analysis time is shortened obviously， and the standard addition recovery is good， which is beneficial to improve the efficiency of detection and analysis and reduce the analysis time cost. Key words： gas chromatography； column；the initial temperature；soy sauce；parabens

收稿日期：2019-04-14

作者简介：宋思园（1992-），女，本科，主要从事食品、保健品、化妆品、药物标准研究和检测方法证实与优化。

黄锦波，E-mail：550846284@qq.com。*通讯作者：

141

2019年第10期China Food Additives中国食品添加剂

分析测试

酱油一般以大豆为原料，添加盐、糖等相关辅料，通过制油、发酵等加工工艺所制成的食品。其主要特点是色素含量高，氨基酸含量高，辅料成分种类繁多［1］。酱油的营养丰富、香味独特、可口宜人，是家家户户必备的调味品［2］。据相关研究表明，2018年，食用酱油产值约为2.7亿元，总产量约为550万吨［3］。

对羟基苯甲酸酯类通过破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，与抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性，以达到防腐的作用［4］。在近几年的分析检测中，已经有不少的学者已经对对羟基苯甲酸酯类有了一定的研究，如高元元［5］等，通过气相色谱法同时检测对羟基苯甲酸甲酯与乙酯进行测定，杨杰［6］等，利用Online-GPC-GC-MS测定调味品中对羟基苯甲酸酯类化合物。而本研究直接利用气相色谱分析法进行测定对羟基苯甲酸酯类的4种物质。当目标物在气化室气化后，经过色谱柱的固定相分离，检测器中的信号放大器把收到的信号进行放大，以达到定量的目的［7］。酱油色素含量高、氨基酸含量高，分析的时候杂峰多，从而导致分离难度大，假阳性结果时有发生，从而导致检测结果不准确。因此优化仪器分析条件，提高检测的灵敏度与分离度能有效的解决这些问题。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂、标准品与样品

仪器：GC-2010Plus岛津气相色谱仪；试剂：氯化钠（分析纯），盐酸（分析纯），乙醚（分析纯），碳酸氢钠（分析纯）；

标准品：对羟基苯甲酸甲酯（纯度为99.89%）、对羟基苯甲酸乙酯（纯度为99.9%），对羟基苯甲酸丙酯（纯度为98.7%）与对羟基苯甲酸丁酯为标准物质（纯度为99.5%）；

样品：海天酱油（市场购买）。1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液的制备

准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯与对羟基苯甲酸丁酯的标准品各约25mg（精确至0.1mg），用无水乙醇定容稀释并至25mL，配制成1000μg/mL的储备液。

142

2019年第10期1.2.2 混合标准溶液制备

吸取标准储备液（1.2.1）0.010mL、0.025mL、0.100mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL于

一

组10mL容量瓶中，用无水乙醇试剂定容，此标准系列的浓度为1.00μg/mL、2.50μg/mL、 10.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL。1.2.3 样品溶液的制备

称取5g试样于250mL分液漏斗中，依次加入10mL饱和氯化钠溶液，1mL50%盐酸酸化，摇匀，分别以75mL、50mL、50mL无水乙醚提取三次，每次2min，放置片刻，弃去水层，合并乙醚层于250mL分液漏斗中，加入10mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，再分别以碳酸氢钠溶液30mL、30mL、30mL洗涤三次，弃去水层。用滤纸吸去漏斗颈部水分，将有机层经过无水硫酸钠（约20g）滤入浓缩瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩近干，用氮气除去残留溶剂，准确加入2.0mL无水乙醇溶解残留物，供气相色谱用。1.2.4 色谱条件

表1 色谱条件如下表

Table 1 Chromatographic conditions

仪器/检测器气相色谱仪/FID

色谱柱InertCap1301（30m×0.25mm×0.25μm）

进样量1μL流速

2.0mL/min分流比10∶1载气氮气

程序升温

初始温度90℃，保持1min，以25℃/min升至180℃，以12℃/min升至220℃，保持6min

1.2.5 实验谱图

采用色谱条件（1.2.4），10μg/mL的混合对羟基苯甲酸酯类标准溶液的谱图如图1。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱初始温度的选择 2.1.1 色谱柱的确定

对羟基苯甲酸酯类具有酚羟基结构，因此本实验选择Inert Cap 1，Inert Cap 5，Inert Cap 1301，Inert Cap 17与Inert Cap WAX在柱温箱为100℃，标液浓度均为50μg/mL的条件下进行测

试，结果谱图如2～6。

100000uV脂酯75000甲乙酯酯FID1

酸酸丙丁甲甲酸酸50000苯苯甲甲基基苯苯羟羟基基对对羟羟25000

对对0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5min

图1 10μg/mL的混合对羟基苯甲酸酯类标准溶液的谱图 Figure 1 Spectrum of 10 μg/mL mixed paraben standard

solution

100000

uV酯酯酯酯FID1

75000甲乙丙丁酸酸酸酸甲甲甲甲50000苯苯苯苯基基基基羟羟羟羟25000

对对对对00

5

10

15

20

25

30

min

35图2 色谱柱为Inert Cap 1时的测试结果 Figure 2 Test results of Inert Cap 1

uV100000FID1

酯75000酯甲乙酯酯酸酸丙丁甲酸酸50000甲苯苯甲甲苯苯基基基基25000

羟羟羟羟对对对对00

5

10

15

20

25

30

min

35图3 色谱柱为Inert Cap 5时的测试结果 Figure 3 Test results of Inert Cap 5

uV100000FID1

75000酯酯酯酯甲乙丙丁酸酸酸50000酸甲甲甲甲苯苯苯基苯25000

基基羟羟羟基对对对羟对00

5

10

15

20

25

30

min

35图4 色谱柱为Inert Cap 17时的测试结果 Figure 4 Test results of Inert Cap 17

分析测试China Food Additives中国食品添加剂

uV100000

FID1

7500050000酯酯酯酯甲乙丙丁酸酸酸酸甲甲甲甲25000

苯苯苯苯基基基基羟羟羟羟对对0对对0

5

1015202530

min

35图5 色谱柱为Inert Cap 1301时的测试结果 Figure 5 Test results of Inert Cap 1301

uV100000

FID175000

酯酯酯丙酯甲乙酸丁酸酸甲酸50000甲甲甲苯苯苯苯25000

基基基基羟羟羟羟对对对对00

5

10

15

20

25

30

min

35图6 色谱柱为Inert Cap WAX时的测试结果 Figure 6 Test results of Inert Cap WAX

通过比较图2、图3、图4、图5、图6的结果，可以明显的看出，保留时间最小的为色谱柱为Inert Cap 1，最大的为Inert Cap WAX，峰高最小的为Inert Cap 17，最高的为Inert Cap 1301。同一浓度，峰高越高表明灵敏度越高，而保留时间越短，说明时间成本越小，而结合实际情况，Inert Cap 1301中的目标物的保留时间与Inert Cap 1中相应的目标物的保留时间仅相差约0.7min，但是Inert Cap 1301中的目标物的峰高却约为Inert Cap 1中相应目标物的2倍。故最佳的色谱柱为Inert Cap 1301。

2.1.2 柱温箱初始温度的确定

通过预实验，发现本实验中气化室的温度与检测器的温度对对羟基苯甲酸酯类的影响并不明显，但是对柱温箱的温度的变化却比较敏感，因此本实验将柱温箱的初始温度分别设置为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃。通过保留时间、理论塔板数为判断依据，结果如表2。

143

2019年第10期China Food Additives分析测试

表2 初始温度的变化对目标物的影响

Table 2 The effect of initial temperature change on target

对羟基苯甲酸甲酯

柱温箱初始温度

保留时间 （min）6.7876.2865.7855.2844.7874.3043.8383.393.0092.664

理论塔板数31315827687323177120242315227011742887220364952627925460

对羟基苯甲酸乙酯保留时间（min）7.2876.7856.2835.7845.2834.7934.3133.8443.4283.041

理论塔板数335624285608249678210975176496133339110047558634082230248

对羟基苯甲酸丙酯保留时间（min）8.0197.5187.0176.5176.0165.525.0294.5434.0923.662

理论塔板数364334313579272022230736204228161705138110932306641538940

对羟基苯甲酸丁酯保留时间（min）8.8018.3017.7997.2996.7986.35.8045.3094.8364.376

理论塔板数38839334392829331525292322785619405115641612931610111682450

中国食品添加剂

60℃70℃80℃90℃100℃110℃120℃130℃140℃150℃

根据上表，制作趋势图如图7、图8。通过图7与图8可以看出，随着初始温度的数却越小。从时间成本考虑，保留时间越小，那么分析时间成本就越小，但是从表2可知，当初始温度超多100℃的时候，目标物的理论塔板数均小于200000，同时初始温度大于80℃时，目标物的保留时间相差并不大，因此为了保证目标物的灵敏度，故本研究选择最佳的初始温度为90℃。

450000400000350000理论塔板数300000250000200000150000100000500000507090110初始温度/℃130150对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯保留时间（min）109876543210

升高，目标物的出峰时间就越提前，而理论塔板

对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸西酯

5060708090100110120130140150160170

初始温度（℃）

图8 保留时间的测试结果 Figure 8 retention time test results

2.2 线性关系考察

按1.2.2配制相关的曲线浓度点，在1.2.4色谱条件下进行测定，以峰面积Y对系列标准溶液浓度（X）进行回归，得回归方程，结果见表3。

通过对对羟基苯甲酸酯类的色谱分析，各物质都有稳定的保留时间及良好的峰型，且本方法在配制各浓度范围内线性关系良好，适于对羟基苯甲酸酯类（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯）的测定。

图7 理论塔板数的测试结果

Figure 7 Test results of the number of theoretical plates

144

2019年第10期分析测试China Food Additives表3 对羟基苯甲酸酯类标准曲线考察结果 Table 3 Results of the standard curve of parabens

标准品名称对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯

线性方程Y=3173.88X-7247.42Y=3342.6X-7829.65Y=3604.49X-10034.4Y=3795.44X-14171.8

相关系数0.99960.99960.99950.9992

线性范围1.00～300μg/mL1.00～300μg/mL1.00～300μg/mL1.00～300μg/mL

中国食品添加剂

2.3 仪器重现性试验

定量测定应考虑仪器的重现性，评价多次重复测定同一均匀样品所得结果之间的接近程度。

取一定浓度的标准溶液1.0μL，连续进六针，记录保留时间和峰面积，计算其保留时间和峰面积的相对标准偏差，结果见表3至表5。

表4 对羟基苯甲酸酯类重现性试验结果

Table 4 The reproducibility test results of parabens

对羟基苯甲酸甲酯

序号123456

保留时间（t）

4.4134.4124.4144.4134.4124.413

0.02RSD（％）

峰面积（A）143054143354143115143703141412143156

0.6RSD（％）

保留时间（t）

4.8844.8824.8834.8844.8844.883

0.02

对羟基苯甲酸乙酯RSD（％）

峰面积（A）154943155117155169155779153022155043

0.6RSD（％）

表5 对羟基苯甲酸酯类重现性试验结果（续表） Table 5 The reproducibility test results of parabens

对羟基苯甲酸丙酯

序号123456

保留时间（t）

5.5845.5835.5835.5825.5835.583

0.01RSD（％）

峰面积（A）169151169106169066169627166610169551

0.7RSD（％）

保留时间（t）

6.3336.3356.3356.3346.3356.336

0.02

对羟基苯甲酸丁酯RSD（％）

峰面积（A）175875176269175260176565173137175975

0.8RSD（％）

由试验结果可以看出对羟基苯甲酸酯类的保留时间和峰面积的RSD分别是：对羟基苯甲酸甲酯为0.02%和0.6％、对羟基苯甲酸乙酯为0.02%和0.6%、对羟基苯甲酸丙酯为0.01%和0.7%。

对羟基苯甲酸丁酯为0.02%和0.8%说明本实验室的仪器稳定性良好，适用于酱油中对羟基苯甲酸酯类的测定。2.4 灵敏度试验

145

2019年第10期China Food Additives分析测试

称取5g样品，并加入30μL 浓度约100 μg/mL的对羟基苯甲酸酯类标准溶液，按照1.2.3样品前处理的方法进行处理，1.2.4仪器条件测试，信噪比≥3，得方法检出限，结果图下。

表6 对羟基苯甲酸酯类灵敏度试验结果 Table 6 Test results of antioxidants sensitivity

项目对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯

方法检出限（mg/kg）

0.5280.4970.4730.440

中国食品添加剂

酯）的方法检出限均达到相关标准的要求［8］。2.5 加标回收率试验

称取已知对羟基苯甲酸酯类含量的酱油样品约5g，共3份，分别加入 140μL、400μL，浓度约为100μg/mL和200μL浓度约为1000μg/mL的混合标准溶液，按1.2.3制备样品溶液，1.2.4色谱条件进行测试，记录峰面积，计算对羟基苯甲酸酯类的回收率及RSD，结果见表7～表10。

结果表明，对羟基苯甲酸酯类（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯与对羟基苯甲酸丁酯的回收率在91%～103%之间、其RSD在0.2%～0.8%之间，均符合要求（回收率90％～110％，RSD≤10％）。

结果表明，对羟基苯甲酸酯类（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙

表7 对羟基苯甲酸甲酯加标回收率实验结果

Table 7 Experimental results of recovery rate of methyl p-hydroxy benzoate standard

加标量（μg）

称样量m

（g）5.1351

13.65

5.17035.14725.0440

38.99

5.01625.08865.1125

194.9

5.96175.1483

0.000.000.00本底值（μg）

定容体积V（mL）

2.002.002.002.002.002.002.002.002.00

测定浓度（μg/mL）6.22446.20706.208819.390919.462719.458694.010693.410194.0571

测定结果（mg/kg）2.2007 2.1796 2.1901 6.9798 7.0445 6.9428 33.3928.4533.17

回收率（%）

91.2190.9590.9899.4599.8299.8096.4395.8196.48

96

0.4

100

0.2

91

0.2

平均回收率（%）

RSD（%）

表8 对羟基苯甲酸乙酯加标回收率实验结果

Table 8 Experimental results of recovery rate of ethyl p-hydroxy benzoate standard

加标量（μg）

称样量m（g）5.1351

14.04

5.17035.14725.0440

40.12

5.01625.08865.1125

200.6

5.96175.1483

0.000.000.00本底值（μg）

定容体积V（mL）

2.002.002.002.002.002.002.002.002.00

测定浓度（μg/mL）6.35936.33706.381519.969920.029219.975795.790895.308495.6862

测定结果 （mg/kg）2.05872.03752.06106.58176.63786.525931.147726.576430.8973

回收率（%）

90.5890.2690.8999.5599.8599.5895.5095.0295.40

95

0.3

100

0.2

91

0.3

平均回收率（%）

RSD（%）

146

2019年第10期分析测试China Food Additives表9 对羟基苯甲酸丙酯加标回收率实验结果

Table 9 Experimental results of recovery rate of propyl p-hydroxy benzoate standard

加标量（μg）

称样量m（g）5.1351

14.32

5.17035.14725.0440

40.90

5.01625.08865.1125

204.5

5.96175.1483

0.000.000.00本底值（μg）

定容体积V（mL）

2.002.002.002.002.002.002.002.002.00

测定浓度（μg/mL）6.76776.74616.716620.547520.623520.566998.078297.782998.2116

测定结果 （mg/kg）2.02042.00022.00046.24496.30276.196029.409125.144029.2443

回收率（%）94.5594.2593.84100.47100.85100.5795.9295.6396.05

96

0.2

101

0.2

94

0.4

平均回收率（%）

RSD（%）

中国食品添加剂

表10 对羟基苯甲酸丁酯加标回收率实验结果

Table 10 Experimental results of recovery rate of butyl p-hydroxy benzoate standard

加标量（μg）14.49

称样量m（g）5.13515.17035.14725.0440

41.39

5.01625.08865.1125

206.9

5.96175.1483

0.000.000.00本底值（μg）

定容体积V（mL）2.002.002.002.002.002.002.002.002.00

测定浓度（μg/mL）7.4637.39977.344321.237121.334921.2798.091198.409698.7901

测定结果 （mg/kg）2.06692.03542.02935.98806.04895.944727.287123.476227.2904

回收率（%）103.03102.16101.39102.61103.09102.7794.7995.1095.47

95

0.4

103

0.2

102

0.8

平均回收率（%）

RSD（%）

减小测试成本，为广大的检测工作者提供一种检

3 结论

中华人民共和国卫生部颁布的GB 5009.31-2016《食品安全国家标准食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》，采用的色谱柱为弱极性石英毛细管柱，柱固定液为（5%）苯基-（95%）甲基聚硅氧烷，即相当于本研究中的Inert Cap 5，根据研究，该色谱柱的固定相与目标物结合并不是很强，灵密度没法更好的体现。目前比较多的学者用质谱检测对羟基苯甲酸酯类的含量，如王颖［9］等就液相串联质谱测定含烟中对羟基苯甲酸酯，但是由于质谱所需成本比较高，不是每个实验室都有能力进行配备，尽管也有学者利用气相色谱法对对羟基苯甲酸酯类进行研究，但是针对酱油中对羟基苯甲酸酯类的研究较少。因此本研究通过优化气相色谱仪的分析条件后，可明显提高酱油中对羟基苯甲酸酯类的含量的灵密度，有效的

测酱油中对羟基苯甲酸酯类的参考方法。

参考文献：

［1］李杨，李明达等.酱油酿造过程中风味物质的形成与鉴定术

[J]. 食品工业科技，2019，40（4）：251-256.

［2］尹立明，等.浅析酱油发酵工艺及改善酱油风味的方法[J].

中国调味品，2018，43（3）：119-121.

［3］智研咨询. 2018年中国酱油行业分析报告-市场深度调研

与发展趋势研究[R].中国报告网，2018.

［4］张丽平，等. 对羟基苯甲酸甲酯降解菌的初步研究[J].江苏

农业科学，2018，46（20）：337-340.

［5］高元元，张建等.气相色谱法测定食品中对羟基苯甲酸酯

[J].食品与发酵科技，2018，54（5））：120-124.

［6］杨杰，等. Online-GPC-GC-MS测定调味品中对羟基苯甲

酸酯类化合物[J]. 中国食品添加剂，2018（3）：155-163.［7］姚强等.论仪器分析法在食品检测中的应用[J]. 中国食品，

2018（23）：145.［8］中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.31-2016《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》.

［9］王颖，等.超高效合相色谱-串联质谱法测定口含烟中对羟

基苯甲酸酯[J]. 质谱学报，2018，39（4）：459-466.

147

2019年第10期