第２７卷第１期 ２０１３年２月 高校化学工程学报 ＮＯ．１、ｂｌ ２７ Ｆｅｂ． ２Ｏｌ３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ 文章编号：１００３－９０１５（２０１３）０１．００９６．０６ 表达单克隆抗体的ＣＨＯ细胞无蛋白培养基的优化 刘国庆，陈 飞，赵亮，范里，谭文松 （华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海２００２３７） 摘要：在自主研发无蛋白培养基的基础上，考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对ＣＨＯ细胞生长、代谢与抗体合成的 影响。结果表明，对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充，虽然不能促进细胞生长，但有利于培养后期细胞活性维 持与抗体合成；Ｂ族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间；作为重要的碳源和能源，葡萄糖浓度较高时会抑 制细胞生长，而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成，维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间， 从而有利于提高抗体产量。通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基，ＣＨＯ细胞在该培养基中的 最高密度达到５２．６×１０ ｃｅｉｌｓ．ｍＬ～，抗体产量达到２７４ ｍｇ．Ｌ～，与初始培养基相比分别提高了３３％和６３％。总之，在细 胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分，以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。 关键词：ＣＨＯ细胞；单克隆抗体；无蛋白培养基；优化 中图分类号：Ｑ８１３．１ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３．９０１５．２０１３．Ｏ１．０１６ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ—ｆｒｅｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＬＩＵＧｕｎ－ｑｉｎｇ，ＣＨＥＮＦｅｉ，ＺＨＡＯＬｉａｎｇ，ＦＡＮＬｉ，ＴＡＮＷｅｎ—ｓｏｎｇ （Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｉｇｈｔｓ ｏｗｎｅｄ ｂｙ ｏｕｒ ｌｂ，ｔｈｅ ｅｆａｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｖｉｔａｍｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｉｔ Ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｏｓｅ ｍｏｓｔ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ｍｉａｎｏ ａｃｉｄｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｙ ｔｎｄ ａｎｔｉａｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅｒ ｓｔａｇｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ ｔｈｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｏｅｓｎ’ｔ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｍａｉｎｓ ｕｎｃｈａｎｇｅｄ。Ｔｈｅ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｂ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ．Ａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｓｏｕｒｃｅ，ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｗｈｉｌｅ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｉｌｌ ｂｅ ｉｎｅｆｉｃｉｆｅｎｔ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｔ ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｂｙ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｒａｎｇｅ，ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｉｓ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ，ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ，ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ Ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｖｉｂｌａｅ ｅｅｌＩ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈａｔ ｍｅｄｉｕｍ ａｒｅ ５２．６×ｌＯ’ ｃｅｌｌｓ·ｍＬ～ａｎｄ ２７４ ｍｇ·Ｌ一，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ３３％ａｎｄ ６３％ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｂａｓａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｉｎ ｂｒｉｅｆ，ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｓｕｆｉｃｉｆｅｎｔ ａｎｄ ｂａｌａｎｃｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｖ ｗｏｒｄｓ： ＣＨ０ ｃｅｌｌｓ； ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ １ 前 言 ＣＨＯ细胞在生物制药产业中应用广泛，是生产抗体的首选宿主【１，２】。单克隆抗体在相关疾病的治疗方 面具有重要的价值，而抗体类药物临床使用剂量大和动物细胞表达抗体能力低的矛盾限制了抗体类药物 收稿日期：２０１１－０６．０９；＇量订日期：２０１１－１０．２８。 基金项目：国家自然科学基金（２１１０６０４５）：国家８６３计划项目（２０１２ＡＡ０２Ａ３０３；２０１０ＡＡ０２２９０５）：上海高校青年教师培养资助计划ＯａｌｇｌｌＯ１１）。 作者简介：刘国庆（１９８７－），男ｔ安徽安庆人，华东理工大学硕士生。通讯联系人；赵亮，Ｅ－ｍｌｈ ｚｌｍｏｌｉａｎｇ＠ｅｅｕｓｔ．ｅｄｕ ｃａ 堑 ！鲞第１期 刘国庆等：表达单克隆抗体的ＣＨＯ细胞无蛋白培养基的优化 的运用，因此如何通过动物细胞培养技术提高抗体产量一直是研究的热点。动物细胞体外培养所需的营 养成分复杂（包括碳源、氮源、无机盐、维生素和生长因子等）且需求量大，培养基的优化是提高培养过 程抗体产量的最重要手段之一。传统的无血清培养基一般在基础培养基中添加替代血清作用的蛋白类物 质，如胰岛素、转铁蛋白与白蛋白等。蛋白类物质的添加不仅存在引入动物性污染源的风险，还不利于 产品的分离纯化，并且成本较高。近年来，研究者针对ＣＨＯ、杂交瘤等细胞系成功开发了无蛋白培养基， 并在此基础上通过培养基与过程优化显著提高了抗体产量【。，钔。由于不同细胞株之间存在差异，而且在无 蛋白培养条件下细胞对营养成分的要求更高【 ，针对特定的ＣＨＯ细胞无蛋白培养基的优化是其成功迈向 产业化过程中一项必不可少的工作。 本文以表达一种单克隆抗体的ＣＨＯ细胞为研究对象，以自主研发的无蛋白培养基ＰＦ１为基础，通过 优化氨基酸、维生素以及葡萄糖的添加，促进细胞生长与抗体合成，旨在提高抗体的产量。 ２材料与方法 ２．１细胞株 采用ＤＨＦＲ系统表达单克隆抗体的重组ＣＨＯ细胞，由军事医学科学院提供。 ２．２ 培养基 表ｌ不同实验中的培养基组成 ＰＦ１培养基是在ＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｒ１：Ｉ）（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）的基础上，通过 优化血清替代物（孕酮、乙醇胺、脂 类等）与蛋白（胰岛素、转铁蛋白）替代 物的添加而开发的具有自主知识产 Ｎｏｔｅｓ：‘‘＋”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｅｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ，ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｏｕｂｌｅｄ 权的无蛋白培养基，能够支持ＣＨＯ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ｆｏｒｍｕｌａ． 细胞生长与单克隆抗体的表达。本文根据需要，在ＰＦ１培养基的基础上对营养物成分进行调整，在摇瓶 中分别进行３批共７个细胞培养实验，见表１。氨基酸、维生素和葡萄糖购自Ｓｉｇｍａ公司。 ２．３细胞培养 摇瓶培养：将细胞以（３～４）×ｌ０ ｃｅｌｌｓ．ｍＬ 的密度接种于摇瓶，置于３６．８￣Ｃ、５％ＣＯ２以及饱和湿度的 培养箱中培养，摇床转速为５０ ｒ．ｍｉｎ～。反应器培养：将细胞￣（３－４）ｘｌ０ ｃｅｌｌｓ·ｍＬ 的密度接种于２ Ｌ反 应器（Ｂｉｏｒｅａ．２０００，上海伯瑞生物技术发展有限公司），ｐＨ控制为７．０－４－０．２，ＤＯ（溶解氧浓度）控制为５０％ 空气饱和度，温度为３６．８＂Ｃ，搅拌转速为８０ ｒ．ｍｉｎ－ ，通气量为Ｏ．０１ ｖｖｉｎ。 ２．４分析方法 ２．４．１细胞计数与生化分析 细胞计数与葡萄糖、乳酸、氨基酸的测定方法同文献Ｉｌ １］。 ２－４．２抗体浓度测定 使用Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ亲和层析柱纯化并收集抗体，使用高效亲和凝胶色谱法检测纯化后的抗体浓度。 ２．４．３葡萄糖比消耗速率、乳酸比生成速率和抗体比生成速率的计算 物质比消耗速率或比生成速率的计算方法相似，以抗体比生成速率为例，通过以下公式计算： ＡＰ 曲甜 一 ｑＡ．ｔＩｂｏｄｙ为抗体的比生成速率（ｍｇ·（１Ｏ ｃｅｌｌｓ·ｄａｙ） ），代表了宿主细胞的抗体表达水平； 为一段时间 内抗体浓度的增量（ｍｇ·Ｌ－ ）；ＡＩＶＣＣ为一段时间内活细胞密度对时间的积分（１Ｏ ｃｅｌｌｓ·ｄａｙ·ｒ ）。 ３结果与讨论 ３．１补充氨基酸对抗体表达的影响 根据２ Ｌ反应器中批培养的结果（图１），ＣＨＯ细胞在ＰＦ１培养基中培养至４￣５天时细胞比生长速率 ９８ 高校化学工程学报 接近于零，细胞生长从对数期进入稳定期，最大活细胞密度达到３９．５×１０ ｃｅｌｌｓ．ｍＬ～。培养上清液中的抗 体浓度在培养过程中逐渐累积，最终浓度为１６８ ｍｇ·Ｌ～。经分析ＰＦ１培养基中氨基酸的消耗情况表明（图 ２），谷氨酰胺（Ｇｌｎ）与胱氨酸（Ｃｙｓ２）在培养初期迅速消耗，接近第３天时其浓度均不足初始的１０％。其他 消耗比例较大的氨基酸主要有组氨酸（Ｈｉｓ）、苏氨酸（Ｔｈｒ）、酪氨酸（Ｔｙｒ）、甲硫氨酸（Ｍｅｔ）、亮氨酸０１ｅ）、异 亮氨酸（Ｌｅｕ）与赖氨酸（Ｌｙｓ），在培养至稳定期时其浓度均小于初始的４０％，其它氨基酸消耗微量甚至有所 生成。部分氨基酸供应不足且不平衡可能是限制细胞进一步扩增的原因。 广Ｉ－ｕｏ一 扫口 ｕＩＩｏｕ一一０Ｕ 昌 。；； ２ ２ 譬 ０ 口 亘 眦ｕＩ＼ａ０【】础扛口 ｕＩ１０ 苦ｏ０一 ——《 导毒言舌羞毒 主星备琴季差 呈 岂占 图２在ＰＦＩ培养基中批培养的氨基酸消耗 Ｆｉｇ．２ Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｎ ｉｂａｔｃｈ ｉｎ ＰＦｌ ｍｅｄｉｕｍ 图１ 细胞在ＰＦ１培养基中批培养的生长与抗体表达 Ｆｉｇ．１ Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｔｃｈ ｉｎ ＰＦＩ ｍｅｄｉｕｍ 根据消耗情况，在第一批摇瓶实验（ｓ１）中补充谷氨酰胺 ∞ 加 加 ∞ ∞∞ ∞ ∞ ０ （５５０ ｍｇ·Ｌ ）、苏氨酸（４１０ ｍｇ·Ｌ ）、胱氨酸（４０ ｍｇ·Ｌ ）、亮氨 酸（１８０ ｍｇ－Ｌ『 ）和组氨酸（６０ ｍｇ．Ｌ ），保证其对细胞生长不构 ．委 成限制。与对照（ｃｃ１）相比，氨基酸的添加（ｃ１）对细胞生长无 显著影响，最高活细胞密度均在３５．Ｏ×１０ ｃｅｌｌｓ．ｍＬ 左右，但 在一定程度上延缓了培养后期细胞的衰亡。在培养前期（１～４ ｄａｙ）抗体表达情况基本一致，氨基酸的添加促进了培养后期 ｆ５～１０ ｄａｙ）抗体的表达，最终抗体浓度达到１９６ ｍｇ．Ｌ一，与对 照相比提高了２５％，见图３。 氨基酸是重要的营养物质，其主要用于蛋白质、核酸和 酯类等物质的合成，同时也用于代谢产生能量。ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ 善 § ｛ 图３添加氨基酸对抗体表达的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｎｇ ｉａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ Ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ 等［ 】手旨出氨基酸除了作为营养物之外，还能够在培养环境恶 １＝ 化时对细胞起到保护作用。在营养物耗竭或渗透压升高的情 况下，氨基酸可能作为细胞存活的信号ｆ 或者作为有机渗透 耋 ｉ 物保持细胞内酶和ＲＮＡ等分子的稳定性【８】。ｓｌ实验中氨基酸 的添加延缓了培养后期细胞的衰亡，在一定程度上维持了细 胞的生理状态，有利于细胞合成与分泌抗体。代谢分析的结 星 § 果显示氨基酸的添加促进了细胞对葡萄糖的利用，葡萄糖进 入ＴＣＡ循环的速率提高了４０％，能量的生成更加迅速，对抗 嚣 Ｔｉｍｅ／ｄａｙ 体的合成起到促进作用。 ３．２维生素对细胞生长、代谢以及抗体表达的影响 图４添加维生素对细胞生长的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｖｉｔｍｉａｎｓ Ｏｎ ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ ｓｌ实验根据氨基酸消耗情况对其进行相应的补充，但细 胞密度没有明显的提高，说明此时氨基酸不是限制细胞生长的唯一因素。根据ｓｌ实验补充氨基酸，并适 当添加３种Ｂ族维生素（４．０４ ｍｇ．Ｌ一 烟酰胺、４．４８ ｍｇ·Ｌ 泛酸钙与１７．９６ ｍｇ·Ｌ 氯化胆碱），进行第二批摇 瓶实验（Ｓ２），考察维生素对细胞生长、代谢和抗体表达的影响。结果发现Ｂ族维生素的添加（Ｃ２）能够有 效促进ＣＨＯ细胞的生长并延长培养时间，见图４。细胞密度的提高与培养时间的延长有利于抗体的累积， 第２７卷第ｌ期 刘国庆等：表达单克隆抗体的ＣＨＯ细胞无蛋白培养基的优化 最终抗体浓度达到２３７ ｍｇ．Ｌ～，与对照（ＣＣ２）相比提高了５３％。如图５所示，维生素的添加对培养前期０－４ 天）葡萄糖的代谢无显著影响（葡萄糖的消耗、乳酸的生成均与对照基本一致），但改善了培养后期（５～１２天） 葡萄糖的代谢，减少了乳酸的生成，使葡萄糖更多进入ＴＣＡ循环进行代谢，从而更有效的生成能量，有 利于细胞生长与培养后期细胞活性的维持。 维生素在培养基中虽然微量存在，但对细胞的生长代谢起着重要的调控作用。Ｂ族维生素能够促进 一０ⅡＩⅡＩ，ｕ０一 再丑ＩＩ８Ｉｌｏ ｏ晌０ｕｒＩ【＿０ 营养物质代谢产生能量，并参与ＤＮＡ合成与修复，保持基因组的稳定性，一些研究［９，１０１指出Ｂ族维生素 能够有效抑制细胞的快速凋亡。Ｓ２实验通过Ｂ族维生素的添加提高了细胞密度、延长了培养时间，说明 维生素是细胞生长与存活的一个限制性因素，在后续的优化过程中值得进一步研究。 ｇ 重 喜 图５添加维生素对葡萄糖代谢的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｖｉｔａｍｉｎｓ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｔｉｍｅ／ｄａｙ 图６不同葡萄糖浓度对细胞生长的影响 Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ Ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ３．３葡萄糖对细胞生长、代谢与抗体表达的影响 葡萄糖作为重要的碳源与能源物质，其在培养基中的浓度水平对细胞培养过程有显著影响。前两批 摇瓶实验（ｓｌ与ｓ２）培养基中的初始葡萄糖浓度均为４０ ｍｍｏ１．Ｌ＿。，随着细胞密度的提高和培养时间的延 长，在培养末期葡萄糖浓度接近于零（Ｃ２）。根据上述情况，通过第三批摇瓶实验（Ｓ３）考察不同葡萄糖浓度 对细胞生长与抗体合成的影响，为无蛋白培养基的进一步优化与后续过程开发中葡萄糖浓度的控制提供 依据。如图６所示，当初始葡萄糖浓度为６０ ｍｍｏ１．Ｌ 时（ｃ４），细胞生长受到一定程度的抑制，最高活细 胞密度仅为２６．９×１０ ｃｅｌｌｓ．ｍＬ～。初始葡萄糖浓度为ｌ７．５ ｍｍｏ１．Ｌ 时（Ｃ３），细胞生长较快，但细胞密度达 到最高（３７．１×１０ ｃｅｌｌｓ．ｍＬ ）后迅速下降，分析发现此时葡萄糖已经耗竭。在１７．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－ 初始葡萄糖浓 度的基础上，于培养第３天与第６天分别添加２０ ｍｍｏ１．Ｌ－ 的葡萄糖（Ｃ５），培养过程中葡萄糖浓度维持在 ５－３０ ｍｍｏ１．Ｌ一，最高活细胞密度达到４６．４ｘ１０ ｃｅｌｌｓ·ｍＬ～。 一 从图７可知，初始葡萄糖浓度的不同对葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率无显著影响。在对数期 葡萄糖均迅速消耗，乳酸迅速累积，Ｃ３、Ｃ４与Ｃ５的最高乳酸浓度均为２５ ｍｍｏ１．Ｌ 左右。进入稳定期 后乳酸比生成速率均接近于零甚至为负值，乳酸的消耗说明此时葡萄糖通过糖酵解途径代谢生成乳酸的 萄糖浓度的不同对 抗体的表达无显著 图７不同葡萄糖浓度对葡萄糖比消耗速率（Ａ）与乳酸比生成速率（Ｂ）的影响 Ｆｉｇ．７ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｒａｔｅｓ ｏｆｇｌｕｃｏｓｅ（Ａ）ａｎｄ ｌａｃｔａｔｅ（Ｂ） １Ｏ０ 高校化学工程学报 影响，抗体比生成速率均在１２．２６～ｌ３－３１ ｍｇ．（１０９ ｃｅｌｌｓ·ｄａｙ） 之间。当葡萄糖耗竭时（ｃ３），抗体比生成速率 董 明显下降，而在葡萄糖充足的情￣Ｔ（Ｃ４、ｃ５），随着细 胞生长进入稳定期抗体比生成速率也有所下降，并且ｃ５ 量 。葛 与Ｃ４比相对较低，见图８。但细胞密度高（ｃ５）有利于抗 体的累积，Ｃ５的最终抗体浓度分别为Ｃ３与Ｃ４的２．７５ 和１．４７倍。 在高糖浓度下（Ｃ４）细胞生长受到抑制，而在实验范 藿、 图８抗体比生成速率的变化 Ｃｈａｎｇｅ ｏｆｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｔａｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ 围内初始葡萄糖浓度的不同对其代谢无显著影响，并且 最高的乳酸浓度相当，说明此时乳酸不是限制细胞生长 的主要因素。对出现此现象的原因尚有待研究，但仅从 。 培养基优化的角度来说，在培养初期维持相对较低的葡萄糖浓度明显有利于细胞的生长。在葡萄糖充足 的情况下（Ｃ４与ｃ５），抗体比生成速率在进入稳定期后也有一定程度下降，并且细胞密度越高时（ｃ５）这种 下降趋势越明显。在批培养过程中随着营养物的消耗与代谢活性的降低，细胞生长与抗体合成均受到物 质与能量的限制【１１，１２］，并且两者之间可能存在一定的矛盾关系。 ３．４无蛋白培养基的优化 根据三批摇瓶实验（Ｓｌ、ｓ２与ｓ３）的结果对无蛋白培养基进行优化，并通过２ Ｌ反应器进行验证。根 据氨基酸消耗情况分别补充组氨酸（６０ ｍｇ·Ｌ ）、苏氨酸（４１０ ｍｇ·Ｌ ）、酪氨酸（１ｌ １ ｍｇ·Ｌ－ ）、胱氨酸（４０ ｍｇ·Ｌ ）、甲硫氨酸（３４ ｍｇ·Ｌ ）、亮氨酸（１８０ ｍｇ·Ｌ ）和谷氨酰胺（５５０ ｍｇ·Ｌ ），并添加烟酰胺（４．０４ ｍｇ·Ｌ ）、 泛酸钙（４．４８ ｍｇ．Ｌ ）与氯化胆碱（１７．９６ ｍｇ．Ｌ ）。另外，在培养过程中使葡萄糖浓度维持在ｌ０～２０ ｍｍｏ１．Ｌ～。 结果在２ Ｌ生物反应器中细胞密度达到５２．６×１０ ｃｅｌｌｓ．Ｌ一，最终抗体浓度为２７４ ｍｇ．Ｌ～。在对数期与稳定 期抗体平均比生成速率分别为１１．０９和６．９４ ｍｇ．（１０ ｃｅｌｌｓ．ｄａｙ）～。比较优化培养基前后的２ Ｌ反应器培养 结果，最高细胞密度与抗体产量分别提高了３３％与６３％。 对于表达重组蛋白的哺乳动物细胞而言，培养基的优化是提高产量的有效手段。Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ等Ｌ５Ｊ在 种无血清、低蛋白培养基的基础上研究发现维生素的添加有利于ＣＨＯ细胞生长，对重组蛋白的比生成 速率则没有显著影响；胆固醇与脂肪酸有利于维持细胞膜的稳定与细胞的活性，但不利于重组蛋白的分 泌；氨基酸的补充能够促进蛋白的合成，提高比生产速率。作者通过系统的优化维生素、胆固醇、脂肪 酸与特定氨基酸的添加，使ＣＨＯ细胞密度与重组蛋白产量分别提高了约１００％与８０％。尽管在不同研究 中使用的细胞株来源及其构建存在诸多差异，但在基础培养基中合理添加各类营养物均能在不同程度上 促进细胞生长与产物合成。 ４结 论 无蛋白培养基是目前细胞培养基的一个发展趋势，具有良好的应用前景。本文在自主研发无蛋白培 养基ＰＦ１的基础上，通过摇瓶实验考察３类主要营养物质（氨基酸、维生素和葡萄糖）对细胞生长、代谢 与抗体合成的影响，结果表明：（１）对一些消耗较快的氨基酸的补充有利于培养后期细胞活性的维持与抗 体合成；（２）Ｂ族维生素的适当添加有利于细胞的生长和培养时间的延长，并能改善葡萄糖的代谢，使之 更有效地生成能量；（３）葡萄糖作为主要的碳源与能源物质，在培养过程中应维持在一定浓度范围内，使 其在提供细胞生长与抗体合成所必需的物质与能量的同时不会抑制细胞的生长。 根据摇瓶实验的结果调整ＰＦ１培养基中主要营养物葡萄糖、氨基酸、维生素的浓度配比，使２ Ｌ反 应器中的最高细胞密度与抗体产量分别提高了３３％与６３％，但在培养过程中抗体比生成速率仍呈下降趋 势。此无蛋白培养基尚有优化的空间，实验中发现的氨基酸与维生素等有效成分及其作用机制值得进一 步研究，以使得能在提高细胞密度的同时，保证抗体比生成速率和提高抗体产量。 第２７卷第１期 刘国庆等：表达单克隆抗体的ＣＨＯ￣９５蛋白培养基的优化 １０１ 参考文献： ｆ１】 Ｓｈｕｋｌａ Ａ Ｔｈｏｍｍｅｓ Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ叨Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２０１０，２８（５）：２５３－２６１． 【２】 Ｃｈｕｓａｉｎｏｗ Ｊ，Ｙａｎｇ Ｙ Ｓ，Ｙｅｏ Ｊ Ｈｅｔ ａ１．Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｎｉｅｓ：Ｗｈａｔ ｍａｋｅｓ ａ ｓｔａｂｌｅ ｈｉｇｈ ｐｒｏｄｕｃｅｒ？【Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００９，１０２（４）：１ １８２—１ １９６． ［３】 ＳｃｈｒＯｄｅｒ Ｍ，Ｍａｔｉｓｃｈａｋ Ｋ Ｆｒｉｅｄｌ Ｐ．Ｓｅｒｕｍ—ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＤＵＫＸＢＩ １ 【Ｊ】．Ｊ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００４，１０８（３）：２７９－２９２． ［４］ Ｂｕｒｋｙ Ｊ Ｅ，Ｗｅｓｓｏｎ Ｍ Ｃ，Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａ１Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｆｅｄ．ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｎｏｎ．ＧＳ ＮＳ０ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｎａｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００７，９６（２）：２８１—２９３． ［５】 Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ Ｃ，ＩＩＩａｎｅｓ Ｃａｎｅｓｓａ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｔｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔ－ＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ，２００６，９（１）：６１－６８． 【６】 ｄｅ Ｚｅｎｇｏｔｉａｔ Ｖ Ｍ，Ａｂｓｔｏｎ Ｌ Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ Ａ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｒｆｏｍ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ｎａｄ ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ【Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００２，７８（７）：７４１－７５２． Ｆｒａｎ６ｋ Ｆ，￣ｒ＆ｎｋｏｖｈ Ｋ．Ｃｅｌｌ ｓｕｉｃｉｄｅ ｉｎ ｓｔａｒｖｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｉｎｏ ａｃｉｄ【Ｊ】．Ｃｙｔｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ１９９７， ２３（１）：２３ｌ－２３９． 【８】 Ｏｙａａｓ ｌ（＇Ｅｌｌｉｎｇｓｅｎ Ｔ Ｅ，Ｄｙｒｓｅｔ Ｎ．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ【Ｊ】． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９４，４３（１）：７７－８９． ［９】 Ｉｓｈａｑｕｅ Ａ Ａ１－Ｒｕｂｅａｉ Ｍ．Ｒｏｌｅ ｏｆｖｉｔａｍｉｎｓ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｎａｄ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｂｃｌ－２ ｄｕｒｉｎｇ ｈｙｈｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ 【Ｊ】．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２００２．７（３）：２３ １－２３９． 【ｌ０】 Ｓｈｉｂｕｙａ Ｋ，Ｈａｇａ Ｒ，Ｎａｍｂａ Ｍ．Ａ Ｓｅｒｕｎｌ ｓｕｂｓｔｉｕｔｔｅ ｏｆｒ ｅｆｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ【Ｊ】．Ｃｙｔｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，５７（２）： ｌ８７－ｌ９７． 【１１】 ＧＡＯ Ｌｉａｎｇ（高量），ＹＯＵ Ｌｅｉ（游磊），ＺＨＵ Ｍｉｎｇ－ｌｏｎｇ（朱明龙），ｅｔ ａ１．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｕｃｏｓｅ．１ｉｍｉｔｅｄ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ（ｒＣＨＯ细胞在葡萄糖限制流加培养过程中的生长与代谢特性）【Ｊ】．Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖ（高校化学工 程学报），２００６，２Ｏ（１）：７４－７８． 【１２】 ＣＨＥＮ Ｙｉｎｇ—ｗｅｎ（陈英文），ＨＵＡＮＧ Ｒｅｎ－ｙｕａｎ（黄任远），ＳＨＥＮ Ｓｈｕ－ｂａｏ（沈树宝），ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆｒＨｕＥＰＯ ｖｉａ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｈｉｈｇ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｃｈｅａｐ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃａｒｒｉｅｒ（用高效廉价载体培养ＣＨＯ细胞生产ｒＨｕＥＰＯ的研究）【Ｊ】．Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖ（高校化学工程学报），２００５，ｌ９（６）：８５５－８５８．