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EMSA说明书

来源：好走旅游网

非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册

本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品

目录号 SIDET001 SIDET003 SIDET004

产品名称非放射性 NF-KB EMSA 非放射性 STAT3 EMSA 非放射性 STAT5 EMSA

包装 36 次结合反应 36 次结合反应 36 次结合反应

VER. 3.11

2005年2月

宁波保税区西区创业大道7号2C-1,315800, 电话：+86-574-86822306 传真:+86-574-263101 http://www.cnviagene.com, webmaster@cnviagene.com

1. 简介 .................................................................... 3 2. 试剂盒包装清单 .......................................................... 3 3. 自备实验材料与仪器 ...................................................... 4 4. DNA/蛋白质结合反应....................................................... 4 5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳....................................................... 5 6. 电转移 .................................................................. 6 7. DNA的交联固定 ........................................................... 6 8. 化学发光反应 ............................................................ 6 9. 化学发光图像显示 ........................................................ 7 10．常见问题 ............................................................... 8 11. 参考文献 .............................................................. 8 12．注意事项 .............................................................. 9

宁波保税区西区创业大道7号2C-1,315800, 电话：+86-574-86822306 传真:+86-574-263101 http://www.cnviagene.com, webmaster@cnviagene.com

1．简介

EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。

Viagene公司的非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。每种试剂盒均经过多次实验测试，并已优化了DNA-蛋白转录因子的结合条件。

EMSA成套试剂配备足够的材料进行36次活化蛋白转录因子与特定DNA结合的测定；若每片凝胶做9个样品加上一个蛋白标准或指示，可以做四张膜。若每片凝胶做12个样品加上一个蛋白标准或指示，则可以做三张膜。实际应用中，因各个实验室使用的显示仪器与手段不同、感光胶片灵敏度以及胶片冲洗方法不一样，仅做一次曝光可能无法获得满意结果。当得到的图像太深或太浅时，则需要调整底物用量与曝光时间。由于用户很可能需要对同一张膜试用几次底物液，因而很难为EMSA试剂盒配备标准量的发光底物液。所以本试剂盒提供Viagene公司的Lighten® HRP-B底物发光系统（产品号；CHEM004）,可以做四片结合膜的EMSA实验，不够用时用户因此需要按所需用量另外购买与EMSA试剂盒配套的化学发光底物（产品号；CHEM001，CHEM002,CHEM003）。 Viagene公司并提供与非放射性EMSA成套试剂盒配套的化学发光检测系统（产品号IMGR002）。 Viagene公司的EMSA成套试剂盒主要用于科学研究，不推荐用于疾病诊断。

2．试剂盒清单

（1）EMSA试剂盒基本组分：

z z z z

10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20C)

Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20C)

10X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4C)

Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20C) 1 Vial（支） 1 Vial（支） 1 Vial（支） 1 Vial（支）

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z z z z z z z

Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20C)

Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(-20C)

2×Blocking Buffer（2× 封闭液）(4C)

5×Washing Buffer（5× 洗涤液）(4C)

Equilibration Solution（平衡液）(4C) Binding-membrane（结合反应膜）(RT) User Manual（说明操作手册）

1 Vial（支） 1 Vial（支） 1 Bottle（瓶） 1 Bottle（瓶） 1 Bottle（瓶） 4 pieces（片） 1 set（册）

（2）EMSA化学发光底物系统：

Lighten® HRP-B Substrate Solution A（底物液A）(4C ) *1 Vial（支）

z Lighten® HRP-B Substrate Solution B（底物液A）(4C ) *1 Vial（支） *本试剂盒提供的发光底物系统足够检测试剂盒配套的4片膜的EMSA操作。

（3）EMSA-Plus试剂盒对照组分（需另购）：

z z

阳性核抽提物对照 (-20C )

阴性核抽提物对照 (-20C )

*1 Vial（支） *1 Vial（支）

*目前，我们为NF-KB、STAT3和STAT5三套试剂盒各自提供3个阳性和3个阴性对照。如果使用者已经有或者可以自己制作阳性或阴性对照，则不必另购对照样品。对照样品因保质期有限，并且需要通过干冰运输供货，价格昂贵。 3. 自备实验材料与仪器：

聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及相关化学试剂。细胞培养装置与细胞核蛋白制备试剂。

电转移装置及相关化学试剂，较厚的用于蛋白转迹用滤纸。紫外线交联仪或80C干燥箱。

Viagene公司的CoolImager (产品号IMGR002)，或感光胶片与感光胶片冲印装置。

4. 结合反应对每个核抽提物样品，按以下步骤于0.5ml离心管中操作。（1）结合反应体系：

10X 结合反应液

Poly(dI:dC)(dI:dC) 细胞核提取物* 双蒸水* 混匀室温静置20 分钟

生物素标记的探针

总量

混匀室温静置20分钟或以上。

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1.0µl 1.0µl? µl? µl 0.5µl 10µl

（2）特异性反应确认竞争反应体系：

10X 结合反应液 Poly(dI:dC)(dI:dC) 细胞核提取物

未标记的竞争性寡核双蒸水*

混匀室温静置20 分钟

生物素标记的探针

总量

混匀室温静置20分钟或以上。

*每次结合反应需1-3µl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到10µl。 5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）制备6.5%聚丙烯酰胺凝胶（以下用量可以制备2片70x80x1.5mm凝胶板）：

在试管中混合以下组分：

10X TBE

40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）50% Glycerol（50%甘油） dH2O（蒸馏水）

TEMED（四甲基乙二氨）脱气10min

10% AP（过硫酸氨）总量

100µl 20.0ml1.0ml 3.3ml1.0ml14.8ml20µl 1.0µl1.0µl ? µl 0.5µl ? µl 0.5µl10µl

注:以上组分为制作两片70×80×1.5mm聚丙烯酰胺凝胶的用量，仅供参考。

（2）制备预冷的0.25XTBE，4ºC保存:

10X TBE 双蒸馏水总量

（3）预电泳：用预冷的0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时。并在上样前用电泳缓冲液冲洗加

样孔3－5次/孔。（4）制备上样混合液：

结合反应体系 10X 上样液总量

10.0µl 2.0µl 12.0µl 30ml 1170ml1200ml

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充分混匀后，14000rpm 离心1 分钟，加样（尽量在短时间内完成加样并电泳）。（5）电泳：将全部样品(12ul)加于样品孔中，低温下180V，电泳70分钟。 6. 电转移

（1）配制电转移缓冲液：配制电转移缓冲液0.5X TBE 1200ml。

10X TBE 双蒸馏水总量

电转移可在室温下进行。

60ml 1140ml1200ml

（2）浸膜：将结合膜，同凝胶大小的厚滤纸和电转移泡沫垫在0.5X TBE浸泡10分钟（注意标记

结合膜的方向）。（3）装配电转移夹：电泳后，慢慢从电泳装置的凝胶上移走一片玻璃片。将凝胶与另一片玻璃一

起移入装有0.5X TBE的盒中。在0.5X TBE中让凝胶板与玻璃板分离，使凝胶板漂浮在0.5X TBE中。取一片预浸湿的滤纸在0.5X TBE中移动到凝胶板下面。小心将滤纸与其上的凝胶板一起从0.5X TBE中移出，置于电转移泡沫垫上并按图示的顺序装配电转移夹。注意凝胶板与结合膜以及与滤纸之间不能有气泡。

（4）电转移：将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在0.5X TBE中，390mA电转移40分钟。注意

电转移的电极方向不能搞错了。 7. 交联固定DNA

电转移完后，移走滤纸。将结合膜取出。结合面朝上、置紫外灯下约10cm处交联5分钟，或置干燥烘箱中80°C，烘烤2小时。 8. 化学发光反应

(1）准备检测试剂：从4°C取出2×封闭液与5×洗涤液，置于37C温浴使白色溶解沉。

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(2）封闭结合膜：制备1X 封闭液：

2× 封闭液双蒸馏水总量

7.5ml 7.5ml

15ml

将结合膜浸于15ml 1X 封闭液中，室温孵育30分钟。

（3）Streptavidin-HRP 结合反应：

制备Streptavidin-HRP（1:750）反应液：

2× 封闭液双蒸馏水

Streptavidin-HRP 总量

7.5ml7.5ml20µl15ml

弃封闭液，将结合膜与新配制的15ml Streptavidin-HRP 反应液在室温孵育20分钟。

（4）膜洗涤：

制备1X 洗涤液：

5× 洗涤液

双蒸馏水总量 (15ml x 4)

12ml 48ml 60ml

弃反应液，用1X 洗涤液室温洗膜4次，每次15ml，每次5分钟。

（5）膜平衡：结合膜经4次洗涤后与15ml平衡液在室温平衡5分钟。（6）底物液的化学发光反应：

1）制备底物液

对每一张膜按以下用量临用前混合制备：

Lighten® HRP-B底物液A* Lighten® HRP-B底物液B* 双蒸馏水总量

0.2ml0.2ml 1.0ml 1.4ml

2）将结合膜从平衡液中移出，放于不吸水的平面上，结合面为上面。将底物液均匀覆盖于膜的表面，依所用的图像显示方法按以下操作。

注：Lighten® HRP-B底物化学发光系统覆盖于膜表面后请立即获取不同时间的图象，以免时间太长后化学发光信号减弱，影响成像。本底物在膜表面保持湿润环境下可持续发光约30分钟，一般15分钟后光信号开始减弱，请注意成像时间安排！

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9 化学发光图像显示

（1）化学发光数字成像与检测：检测化学发光的数字成像系统需要有极高的灵敏度，能够在短时间内（5-10分钟）累加处理上万图像。Viagene公司的CoolImager (产品号；IMGR002)非常适合用于非同位素EMSA的发光成像与检测。使用化学发光系统时，将底物液加于结合膜表面后不需要去除底物液即可放入仪器中进行成像分析。一般经3-5分钟处理后即可以在显示器上清楚显示图像。使用化学发光数字成像系统不需要暗室与冲印机器设备，亦不需要冲洗液、固定液和感光胶片等耗材。图像的深浅可以调节，并可以对图像进行定量分析。详细操作步骤请参考仪器的说明书。

（2）感光胶片冲印成像：使用感光胶片冲印成像的方法需要准备有暗室，冲印机器设备，以及冲洗液、固定液与感光胶片等耗材。使用感光胶片冲印技术时，需要将底物液覆盖于膜的表面反应1-4分钟。然后吸掉底物液并用纸巾从膜表面吸走多余的底物液。然后用一张透明纸盖在结合膜表面，其上再盖感光胶片。胶片的曝光时间无法准确决定，每次实验只能多作几张不同曝光度的胶片以获得较佳的图像，但对图像进行定量分析比较困难。 10. 常见问题问题信号弱或无信号

原因

1．核提取物蛋白用量不够。 2．核蛋白被降解。 3．蛋白质转印效率差。 4. 曝光或成像时间太短。

信号太强使曝光时间少于2秒钟

1. 感光胶片太敏感； 2. 底物液灵敏度太高； 3. 探针或核抽提物用量太多。

高背景

1．膜过于干燥。

2．曝光或成像时间太长。 3．封闭液和洗液效率不高。

建议

1．增加蛋白质用量。

2．在提取液中加蛋白酶抑制剂。 3．最好用电转移，效果较好。 4．增加曝光或成像时间。 1. 将膜放一段时间后重新曝光； 2. 将底物液做1－5倍稀释后使用； 3. 减少探针或核抽提物用量。 1．检测过程中，使膜保持湿润。 2．缩短曝光或成像时间。

3．在封闭和洗涤过程中增加封闭液和

洗涤液用量。增加洗涤时间。

观测不到迁移开的条带

1．核抽提物质量差，蛋白被降解。1．提高核抽提物制备的质量。 2．核提取物蛋白或探针用量不够。2．按核抽提物质量来确定合适的核抽

提物与探针用量。

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11. 参考文献

（1） Crothers, D.M. (1998) Nature 325:4-5.

（2） Garner, M.M. &Revzin, A. (1986) T rends in Biochemical Sciences 11:395-6. （3） Hendrcikson, W. (1985) Bi Techniques 3:198 –207.

（4） Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., and Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acids Research 11:1475

–14. （5） Bannister, A. and Kouzarides, T. (1992). Basic peptides enhance protein-DNA

interaction in vitro. Nucl. Acids Res. 20:3523. （6） Kironmai, K.M., et al. (1998). DNA-binding activities of Hop1 protein, a synaptonemal

complex component from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 18:1424-35. （7） Liu R.Y., Fan C., Garcia R., Jove R., Zuckerman K.S. (1999)..Constitutive activation

of the JAK2/STAT5 signal transduction pathway correlates with growth factor independence of megakaryocytic leukemic cell lines. Blood. 93:2369-79. （8） Liu R.Y., Fan C., Olashaw N.E., Wang X., Zuckerman K.S. (1999). Tumor necrosis

factor-alpha-induced proliferation of human Mo7e leukemic cells occurs via

activation of nuclear factor kppaB transcription factor. J Biol Chem. 274:13877-85.

12．注意事项：

（1）收到本试剂盒后，请立即检查试剂瓶的包装与密封是否完好。若有破损请保持原样并在接货

后24小时内与本公司联系。（2）本试剂盒保质期为12月，请严格按照试剂瓶上的说明保存所有试剂。

（3）低温下2×封闭液和5×洗涤液有白色沉淀，请放37°C温浴后按操作说明制备1X 封闭液和1X

洗涤液。剩余的储存液放回4°C保存。（4）本公司的EMSA试剂盒附带的Lightgene® HRP-B底物反应液足够做完4片结合膜的一次性测

定，若不够，请另行购买。（5）请务必按照本说明推荐的条件进行实验操作。

（6）进行聚丙稀酰胺凝胶电泳请按照实验室的有关规定进行个人防护。

（7）您如果有不明之处或有技术问题，请及时联系唯奥基因公司，我们共同做好您的科研工作！

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