乳腺癌基因治疗的研究进展

摘要：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。近年来，随着对肿瘤分子病理学认识的不断深入，乳腺癌的基因治疗研究快速发展，某些靶向药物已成功应用于临床并取得了良好的效果。自杀基因疗法的出现，为乳腺癌的治疗提供了一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略。

关键词: 乳腺癌 自杀基因 基因疗法

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。基因治疗是继手术、放化疗以及内分泌治疗之后的一种新兴治疗手段，与传统的治疗模式相比，有更好的靶向性、针对性，更适于对乳癌患者实施个体化治疗。近年来，随着对肿瘤分子病理学认识的不断深入，乳腺癌的基因治疗研究快速发展，某些靶向药物已成功应用于临床并取得了良好的效果。自杀基因（suicide gene）疗法的出现，为乳腺癌的治疗提供了一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略，本文就自杀基因治疗乳腺癌的研究进展作一综述。 1.自杀基因的基本概念

自杀基因是指能将无毒的药物前体转化为细胞毒性物质的基因。转入自杀基因的肿瘤细胞可以被前药的有毒代谢产物选择性破坏。旁观者效应是另一作用机制，是指除了破坏这些整合了自杀基因的肿瘤细胞外，自杀基因对邻近的未被转染的肿瘤细胞也有破坏作用，从而大大提高了该治疗对肿瘤细胞的杀伤能力。 2.自杀基因疗法的机制

直接杀伤作用 即转染了前药转换酶基因的肿瘤细胞能将前药转变成细胞毒药物，从而直接杀伤肿瘤细胞。1986年Moolten应用逆转录病毒将TK基因导入肿瘤细胞，被转导的肿瘤细胞（TK+）对丙氧鸟苷（GCV）高度敏感。GCV是一种核苷酸类似物，在TK作用下形成一磷酸丙氧鸟苷，然后再转化为三磷酸丙氧鸟苷，作为链终止剂，干扰肿瘤细胞分裂时DNA的合成，最终导致细胞分裂阻抑或死亡。因此，肿瘤细胞内前体药物产物的高浓度淤积，发挥了细胞毒杀伤作用。

旁观者效应（bystander effect） 在Moolten还观察到，TK+与TK-肿瘤细胞以一定比例混合时，在GCV的作用下，TK-肿瘤细胞几乎全被杀死。转染了自杀基因的肿瘤细胞被杀死，其周围大量未被转染的下拨也被杀死的现象称为旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用。由于基因载体系统在体内转染效率很低，自杀基因在体内对肿瘤直接杀伤作用比较小，因而旁观者

效应起着十分重要的作用11。关 于旁观者效应的机制：有毒性代谢产物通过细胞间的间隙连接或直接弥散作用进入相邻细胞；另有研究认为， 细胞凋亡之后产生的小泡可以包裹自杀基因产物，这些小泡被临近的细胞吞噬后就将自杀性蛋白质传递给与之接触的肿瘤细胞，导致其死亡自杀基因编码的酶是一种超抗原，能够刺激免疫系统产生各种细胞因子杀伤相邻细胞 产生旁观者效应。近年来还发现，相距甚远的两个肿瘤也可以发生旁观者效应，称之为远程旁观者效应 。

3.自杀基因转染的载体基因转移的方法 有病毒载体转移法和非病毒载体转移法 长期以来，基因治疗的难点之一是如何使目的基因只转染靶细胞，并在靶细胞中稳定表达。任何一种载体都有自身的优缺点，没有一个在安全高效的转导和稳定高效的表达方面是完美的。 相对而病言，病毒载体具有高效低毒、容量大、易于分离等优点而成为基因治疗中应用最为广泛的载体。目前在乳腺癌基因治疗中应用的较多的是逆转录病毒与腺病毒载体，逆转录病毒是病毒性载体中应用最早 ，研究相当成熟，目前仍被广泛应用的载体。 3.1逆转录病毒载体

逆转录病毒为单链病毒，进入细胞后逆转录为前病毒，它能有效地将小于目的基因整合进被感染细胞的基因组。有利于治疗基因的长期表达 ，但存在诱导

宿主基因突变产生新的肿瘤的潜在后果。逆转录病毒载体的重要特征是靶细胞必须处于增殖状态才有可能完成基因转移，这一特征使选择性基因导向到肿瘤细胞成为可能。但在体内应用时，基因不可能转染全部的肿瘤细胞 因而又具有一定的局限性。尽管如此临床实验中仍然常采用这个系统。近年来研制出的慢病毒载体是一种新型的逆转录病毒载体，它来源于人类免疫缺陷病毒II型，具有同时感染非分化细胞和分化细胞的能力，已逐渐成为新一代的基因转染工具。 3.2腺病毒载体

腺病毒载体是近年来常用的载体，重组腺病毒颗粒牢固不易突变、血清滴度高、靶细胞的范围广、装载容量大、可有效地将外源基因转移并表达于多种细胞中，既可转染分裂期细胞又可转染静止期细胞，这样可以提高载体的转染效率 ，又存在缺乏靶向性而导致副作用的可能。与逆转录病毒家族载体不同 ，腺病毒载体介导的基因转移是非整合型的，以附加体的形式存在 不随宿主细胞分裂而复制，是典型的一过性表达载体 因此它安全 致瘤性低 但同时也导致它的基因表达和转导受限。 3.3腺相关病毒

腺相关病毒（AAV）是一种细小病毒，呈单链线状的DNA病毒,用它作为基因治疗载体具有无致病性、无免疫原性靶细胞范围广、热稳定性好、能介导外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中等优点，所以被人们称为最有前途的基因治

疗载体，这一病毒载体用于乳腺癌细胞基因治疗中的研究近年来陆续也有报道。 此外非病毒载体等其他类型载体在乳腺癌基因治疗中也有研究应用 各有自身的优缺点 因为每种载体都有其优势和局限 未来基因治疗的发展方向将会是采取扬长避短或开发它们的联合载体（如杂合病毒载体 ）。 4相关实验设计

4.1在Mc F一7裸鼠移植瘤模型中，治疗组裸鼠移植瘤的生长明显受到抑制，其余各组肿瘤生长情况无明显差别；在透射电镜下可见治疗组多量的凋亡细胞。 实验结论：体内外实验均表明v EGF启动子可调控双自杀基因体系靶向桩诱导人乳腺癌细胞Mc F一7细胞凋亡。到目前为止，用于乳腺癌基因治疗的病毒载体主要有3类：腺病毒载体、反转录病毒载体和腺相关病毒载体。腺病毒载体系统因其具无插人性突变、安全性高、感染能力强、蛋白表达量大等优点，目前已成为基因治疗领域常用的载体之一。实验构建了含VEGFP驱动CD-Ⅸ自杀基因系统的重组腺病毒载体，用此重组腺病毒感染高表达VEGF的MCF一7细胞后，应用不同浓度的前药5一FC和GCV治疗后可抑制肿瘤细胞生长，证实MCF一7细胞中VEGFP启动子活性明显上调，此启动子可以驱动CD瓜自杀基因使之转录、翻译、编码产生具有生物活性的CD和胸苷激酶，催化各自前药5一FC和GCV转化成细胞毒物质，产生肿瘤杀伤效应。以上的实验结果为进一步开展腺病毒介导CD胍双自杀基

因靶向治疗乳腺癌的研究奠定了基础。迄今研究最为深入的两大自杀基因系统是HSV一7Ⅸ／GCV和CD，5一FC，部分已进入临床试验阶段。I型单纯疱疹病毒产生单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶(HSV-TK)，催化GCV转化为单磷酸GCV，继而在哺乳类细胞激酶的共同催化下转化成细胞毒物质三磷酸GCV，限速酶为HSV一7Ⅸ。三磷酸GCv与N1P竞争DNA多聚酶的结合位点，阻止单链DNA延长，使细胞周期受阻，抑制细胞分裂，特别适用于杀灭分裂旺盛的恶性肿瘤细胞内。胞嘧啶脱氨酶(CD)可使5一FC转化为5一FU，再经细胞内酶作用，生成氟尿嘧啶三磷酸盐和单磷酸5一氟脱氧尿苷，前者可整合人RNA，干扰RNA的合成；后者5一Fd UMP是一种不可逆的胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA的生物合成网。由于不同类型肿瘤细胞对不同酶／前药体系的敏感性存在差异，而且肿瘤患者体内往往同时存在多种克隆肿瘤细胞，因此应用单一酶／前药体系难以达到根治肿瘤的目的，联合CD、TK自杀基因可利用不同的作用环节以提高疗效2

。

4.2讨论应用单一酶／前药体系难以达到根治肿瘤的目的,联合多个自杀基因是提高疗效的途径之一，课题使用的是p Ad Easy系统,构建CD／TK融合双n杀基因的重组腺病毒。在肿瘤基因治疗中，将目的基因置于此类肿瘤特异性调控序列之下。可使目的基冈选择性地在相应的组织细胞中表达．而不影响其他组织细胞。绝大多数乳腺癌细胞都高表

达VEGF．而正常组织不表达或表达甚微。因此VEGF可以作为肿瘤生物治疗的理想靶点。该治疗体系的具体作用机制为TK基因通过编码产生胸苷激酶特异地将核苷类似药物前体(GCV)磷酸化进而在细胞内代谢成磷酸丙氧鸟苷．后者抑制细胞DNA聚合酶的功能或竞争性的渗入细胞DNA使其合成终止，导致细胞死亡。在本实验中，将该自杀基因体系作用：高表达VEGF的乳腺癌细胞系MCF-7和不表达VEGF的乳腺上皮细胞。结果发现：蓖组腺病毒对各细胞株具有较强的感染率．其感染牢随病毒MOI的递增而增高。将转基因细胞给以不同浓度的前药GCV和／或5-FC．观察到前药GCV和5-FC能诱导体外培养的MCF一7细胞非坏死性损伤，MTT显示前药在一定搭配剂量范周内可以呈剂量依赖性抑制MCF一7细胞的生长：同时发现CD／TK融合基冈对乳腺癌的疗效优于任一单自杀基因，而乳腺上皮对前药不敏感，表明VEGF基因启动子调控的自杀基因体系的细胞特异性。通过流式细胞仪检测发现转基因细胞被阻止于G旷G，期，提示细胞DNA的合成被抑制。因此双自杀基因系统可以特异性抑制MCF-7细胞增殖，这与细胞周期阻滞有关。动物实验表明Ej杀基因体系GCV+5一FC组，GCV组，5-FC组均能有效抑制乳腺癌裸鼠移植瘤生长，但联合用药组明显优于单自杀基因组，进一步说明证实了双自杀基因系统的有效性。本研究构建的双自杀基因审组腺病毒口f高效感染并杀伤目的细胞。CD／TK基因的应用避免了单自杀基因的不足：VEGF启动子的引入优化

了该体系的疗效．使其选择性的作用于目的肿瘤细胞．而对正常乳腺上皮细胞无毒性作用。该实验为该体系进一步研究及临床应用奠定了基础3

。

4.3 BALB/c裸鼠移植瘤抑瘤实验及病理学检测

实验结果说明Tet调控下逆转录病毒能有效介导HSVtK基因在BALB/c裸鼠体内的基因转移并诱导肿瘤细胞凋亡的发生。 有效地控制外源基因的表达是基因治疗应用于临床医疗工作面临的重大难题! Gossen等构建的TET基因表达调控系统,具有开/关功能严密、特异性强、诱导效率高、对细胞无毒性等特点。在利用Tet-ON系统调控自杀基因作用方面，我们已进行了一些初步的研究，将质粒pRev TRE/HSVTK与pRevTet-ON共转染 MCF-7 细胞\并利用此稳定表达的细胞建立了人乳腺癌SCID小鼠模型\研究在GCV作用下自杀基因对乳腺癌是否有治疗作。 虽然取得了一定的效果\"，但这种基因转移方式仍不适合于临床治疗。本实验研究初步展示了TET-ON系统对自杀基因的调节以及在体内外诱导乳腺癌细胞发生凋亡的作用\" 为肿瘤的基因治疗调控机理研究提供了新的思路。

4.4实验构建VEGF启动子调控的双自杀基因系统，观察其对乳腺癌细胞增殖的影响，探讨双自杀基因体系在乳腺癌治疗中的应用价值。通过建立裸鼠移植瘤模型，讨论：应用单一酶／前药体系难以达到根治肿瘤的目的。联合多个自杀基因是提高疗效的途径之一，因此本课题使用的是p Ad Easy系统．构建

CD／TK融合双自杀基因的重组腺病毒。在肿瘤基因治疗重，将目的基因置于此类肿瘤特异性调控序列之下。可使目的基选择性地在相应的组织细胞中表达．而不影响其他组织细胞。绝大多数乳腺癌细胞都高表达VEGF．而正常组织不表达或表达甚微。因此VEGF可以作为肿瘤生物治疗的理想靶点，故本课题构建的载体含VEGF启动子。该治疗体系的具体作用机制为TK基因通过编码产生胸苷激酶特异地将核苷类似药物前体(GCV)磷酸化进而在细胞内代谢成磷酸丙氧鸟苷．后者抑制细胞DNA聚合酶的功能或竞争性的渗入细胞DNA使其合成终止，导致细胞死亡。 在本实验中，将该自杀基因体系作用于高表达VEGF的乳腺癌细胞系MCF-7和不表达VEGF的乳腺上皮细胞。结果发现：蓖组腺病毒对各细胞株具有较强的感染率．其感染牢随病毒MOI的递增而增高。将转基因细胞给以不同浓度的前药GCV和／或5-FC。观察到前药GCV和5-FC能诱导体外培养的MCF一

7细胞非坏死性损伤，MTT显示前药在一定搭配剂量范周内可以呈剂量依赖性抑制MCF一7细胞的生长：同时发现CD／TK融合基冈对乳腺癌的疗效优于任一单自杀基因，而乳腺上皮对前药不敏感，VEGF基因启动子调控的自杀基因体系的细胞特异性。通过流式细胞仪检测发现转基因细胞被阻止于G0-G1期，提示细胞DNA的合成被抑制。因此双自杀基因系统可以特异性抑制MCF-7细胞增殖，这与细胞周期阻滞有关。动物实验表明自杀基因体系GCV+5-FC组，GCV组，5-FC组均能有效抑制乳腺癌裸鼠移植瘤生长，但联合用药组明显优于单自杀基因组，进一步说明证实了双自杀基因系统的有效性。本研究构建的双自杀基因审组腺病毒口f高效感染并杀伤目的细胞。CD／TK基因的应用避免了单自杀基因的不足：VEGF启动子的引入优化了该体系的疗效．使其选择性的作用于目的肿瘤细胞．而对正常乳腺上皮细胞无毒性作用。该实验为该体系进一步研究及临床应用奠定了基础4。

1 .盛新华,卿三华.自杀基因疗法治疗乳腺癌研究进展[J].中国现代普通外科进展,2005,8(4):196-198.DOI:10.3969/j.issn.1009-9905.2005.04.002.

2. KONG Heng,黄宗海,YU Jin-long等.双自杀基因系统诱导乳腺癌细胞凋亡的体内外实验研究[J].中国现代医学杂志,2008,18(14):1974-1978.DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2008.14.005.

3.孔恒,黄宗海,李强等.腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用[J].南方医科大学学报,2008,28(6):907-910.DOI:10.3321/j.issn:1673-4254.2008.06.001. 4 .孔恒,黄宗海,李强等.腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用[J].南方医科大学学报,2008,28(6):907-910.DOI:10.3321/j.issn:1673-4254.2008.06.001.