1 引言
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随着各种生物活性短肽的不断发现，其研究和开发日益受到人们的关注。大量科学研究表明，通过选择适当的蛋白酶水解蛋白质可以得到大量具有各种生物功能的多肽，这些多肽不仅具有较高的活性，而且来源广泛、成本低、安全性好，制备操作简单、便于工业化生产，因此已成为科学研究的新热点[1]。
小麦麸皮是小麦加工的副产品，含有15% 以上的蛋白质，是一种潜在的植物蛋白资源[2]。麦麸来源广泛，价格低廉。目前，我国麦麸的有效利用率很低，麦麸很少进行深加工和再利用，经济价值不高，资源浪费严重[3]，将麦麸蛋白酶解而得到生物活性肽不失为进一步开发麦麸蛋白的途径。
1.1 麦麸的营养评价
1.1.1 膳食纤维的功能
小麦麸皮具有抗衰老、抗癌、减肥等重要生理功能，并且已被制成多种流行保健食品[,4,5]，小麦麸皮中起生理功能的最主要的成分是膳食纤维，约含40 %。许多资料表明，由非淀粉多糖组成的膳食纤维到达小肠后，通过减少在小肠的通过时间减少葡萄糖的吸收，减缓淀粉水解，对降低血胆固醇、糖尿病、高血脂、冠心病、高血压均有良好的促进作用。小麦麸皮还有减少憩室病、胆结石和结肠癌发生的重要作用[6]。膳食纤维还可显著增加大鼠粪便正常细菌的含量。肠道中的有益细菌能利用小麦麸膳食纤维产生挥发性脂肪酸，如乙酸、丁酸等。这些脂肪酸能降低pH ，抑制腐生菌的生长，减少致癌物质的产生[7] 。
在制备小麦麸膳食纤维的过程中，通常采用酶解法除去淀粉、蛋白质，这些酶解液中含有大量的糊精、低聚糖等水溶性物质，可再加以利用。王卫东等人将这些酶解液制成风味独特的麦香茶饮料[8]。利用膳食纤维具有的吸水、吸油、保水、保香等性质，添加到豆酱、豆腐等食品及肉制品中，可以保鲜和防止水的渗透；用于粉状品时，可作为载体，制成冲剂；加入沙司、蛋黄酱中时可作为粘度调节剂；加入饼干食品中可使面团易于成型；加入冰棍、糖果等食品，可用作防固结剂[9] 。 1.1.2 低聚糖的功能
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麦麸中富含纤维素和半纤维素，是制备低聚糖的良好资源。小麦麸皮中的低聚糖具有系列生物活性[10]。首先，低聚糖具有良好的双岐杆菌增殖效果，可作为双歧杆菌生长因子应用于食品。其次，低聚糖具有低热值性能，属难消化糖，不被口腔中的产酸类和其他微生物利用，显示出抗龋齿功能。另外，由于它的低热值性能，可以作为糖尿病、肥胖病、高血脂等病人理想的糖源。低聚糖还具有表面活性，可吸附肠道中有毒物质及病原菌，提高机体抗病能力，激活免疫系统，用于医药工业和饲料工业。 1.1.3多肽作为蛋白质组成的功能
小麦麸皮中含有14.1%的蛋白质，是十分丰富的植物蛋白质资源。植物性来源的蛋白质在膳食补充和食品加工中的地位越来越重要。它不仅可弥补膳食中蛋白质的不足，减少对身体不利的饱和脂肪酸的摄入，还含有一些有生理活性的物质，具有一些非常重要的功能特性。另外，麸皮蛋白质还含有人体必需的多种氨基酸，甚至可与大豆蛋白相媲美[11]。
蛋白质不是仅以氨基酸形式被吸收，而更多的是以肽的形式被吸收。组成有机生物体的20种氨基酸从空间结构上来说比较简单，但以不同数目、不同种类的氨基酸结合形成肽就会产生空间结构上较大的差异，这也是肽具有多种生物活性的结构基础，正因为肽具有多种结构，也就决定了它的多种特殊生理功能。麦麸肽具有人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、抗菌、抗毒、抗病等诸多作用，且食用安全性极高。
1.2 麦麸多肽的性质
1.2.1麦麸多肽的溶解性
麦麸多肽在不同的pH值范围内，其溶解度基本上没有变化，说明麦麸肽的溶解性不受pH值的影响，具有良好的溶解性[12]。当蛋白被酶解后，蛋白质多聚体解离为小分子的肽，分子由卷曲状态成为较伸展的状态，增加了分子表面电荷，加强了分子与分子之间、分子与水溶液之间的静电作用。因此，麦麸多肽的溶解性不受pH值影响。 1.2.2 麦麸多肽的稳定性
在pH6.0～8.0 范围内麦麸多肽比较稳定，pH<4.0 及pH>8.0 时，麦麸多肽
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的稳定性下降。随着加热温度的升高麦麸多肽的稳定性下降的幅度也增大，在60℃以下的加热温度下，其较为稳定。丙三醇、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖对麦麸多肽的热变性有明显的保护作用，其中丙三醇的保护效果最好。由于它的加入使麦麸多肽在60℃的条件下加热30 min 后，抗氧化性提高了34.31%。保护剂的浓度为40%时，较为适宜。 1.2.3麦麸多肽的安全性
麦麸多肽小鼠急性毒性试验，LD50 ＞ 20g/kg，属无毒级。Ames 试验、骨髓细胞微核试验、睾丸精母细胞染色体畸变试验、彗星试验结果均为阴性。表明麦麸多肽是一种无毒物质，毒性试验结果初步证明麦麸多肽作为保健食品是安全的。
1.3 麦麸多肽的制备
1.3.1 酶法制备
以麦麸蛋白为原料，用碱性蛋白酶Alcalase 水解麦麸蛋白制备麦麸多肽。刘长江等人采用酶法制备麦麸多肽， 研究了温度、pH 值、酶用量、及水解时间对麦麸多肽制备率的影响，找出提取的最佳工艺参数。确定采用碱性蛋白酶Alcalase制备麦麸抗氧化肽的最佳酶解条件为：[E]/[S]=5%、pH8.0、温度50℃、时间3 h。
1.3.2 啤酒麦糟制备
该方法是将湿啤酒糟进行干燥、粉碎和过筛，得到啤酒糟；加入麦麸多肽，室温下搅拌，过滤去渣，离心，得到蛋白提取液；调节pH4.0~5.0进行沉淀，去上清液，真空冷冻干燥，得到粗多肽；在啤酒糟粗蛋白中加入磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲溶液，调节pH6.5~8.5；加入Alcalase碱性蛋白酶，加热至45℃~65℃，在搅拌条件下水解1h~5h；水解完毕之后，于沸水浴灭酶，离心；取离心后的上清液用凝胶柱分离，分别收集各峰后浓缩，冷冻干燥，得到活性麦麸多肽。 1.3.3 酸碱法制备
用化学强酸或强碱催化麦麸蛋白质获得麦麸多肽，但是此法投资大、占地多、工艺复杂、污染大、分子量难以控制，产品有化学残留，难以形成功能，很难实现工业化生产，至今仍停留在实验室。
1.4 麦麸多肽的抗氧化性研究
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1.4.1 麦麸多肽清除自由基能力
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人体自由基应处于平衡中，如果自由基过多或者清除过少，就会对组织产生伤害。麦麸蛋白中蕴涵着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解就有可能释放出有活性的麦麸多肽。麦麸蛋白抗氧化性肽能抑制机体内自由基的大量积累，对提高自由基清除机制起到一定的功效，从而能在一定程度上消除机体内多种生理功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生[13]。 1.4.2 麦麸多肽对H2O2诱导的红细胞氧化溶血的抑制作用
红细胞中加入H2O2后，红细胞膜氧化受损，导致溶血现象。纯化后的麦麸多肽可明显抑制氧化溶血现象的发生。麦麸多肽对H2O2 诱导红细胞氧化溶血实验[15]表明麦麸多肽对H2O2诱导红细胞氧化溶血的抑制作用在3个浓度水平上(15 mg/mL、30 mg/mL、60mg/mL)均达到了显著水平(P＜0.01)，且表现出一定的剂量-效应关系。说明麦麸多肽能明显抑制溶血反应的发生，有效保护红细胞结构的完整性。
1.5 麦麸多肽前景展望
迄今为止，我国对麦麸的综合利用的总体水平处在初级开发阶段，尚未能跃上一个新台阶，宝贵的麦麸资源未能得到充分、合理、有效的利用。鉴于麸皮含有丰富的淀粉、蛋白质、粗纤维等，对麦麸进行深加工，提取其中的有效成分，研究开发一些高附加值的麸皮产品，突破其单一的用途，将产生很高的经济效益和社会效益。因此酶解麦麸蛋白不失为国内麦麸蛋白资源开发利用的重要途径之一，经SephadexG-25、DEAE-32 纤维素纯化后的麦麸多肽能减少红细胞溶血，减轻肝脏线粒体膨胀程度，说明麦麸多肽具有较强的抗氧化功能。可见，麦麸多肽具有广阔的开发前景。通过本研究，为麦麸多肽的工业化生产提供理论依据和工艺参数，从而为使麦麸多肽更加广泛的应用于保健品和功能食品领域提供理论基础与实验依据，但其体内抗氧化活性和抗氧化作用机理有待于进一步研究。
1.6 课题研究的目的和主要内容
近年来已有研究证实，在胃肠中肽比氨基酸更易被机体吸收利用。人体可能主要是以肽的形式来吸收氨基酸[15]。目前已发现许多具有特殊生理功能的食品蛋白源多肽，如抗氧化肽、降血压肽、降血脂肽、降胆固醇肽、抗菌活性肽、免
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疫调节肽等。麦麸蛋白来源广泛，价格低廉，是一种优质的植物蛋白。现有的研究发现，从麦麸蛋白的酶解产物中能够分离出多种具有生理功能的多肽、。麦麸多肽是一种非常优质的功能性食品原料。
本研究以麦麸为原料，采用生物调控技术孵育麦麸，激活麦麸中内源蛋白酶，以此降解麦麸蛋白，产生并富集多肽，并对麦麸多肽的抗氧化性进行测定。通过本研究，为麦麸多肽的工业化生产提供理论依据和工艺参数，从而为使麦麸多肽更加广泛的应用于保健品和功能食品领域提供理论基础与实验依据。
２ 材料和方法
2.1实验材料与设备
2.1.1 材料
麦麸：市售（在－20℃保藏备用）。 2.1.2 实验试剂
磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 三氯乙酸 酒石酸钾钠 谷胱甘肽 硫酸亚铁 邻二氮菲 硫酸铜 过氧化氢 菲咯嗪铁 DPPH EDTA 氢氧化钠 柠檬酸 柠檬酸钠 氯化亚铁
分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯
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2.1.3 实验仪器与设备
Orion818型pH测试仪 JA2003型电子天平
Orion Research，Inc.
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上海精密科学仪器有限公司
UV–2802型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司 TDL–40B离心机 FA2004N分析天平 LGJ-10冷冻离心机 RE-52/RE-52C旋转蒸发仪
上海安亭科学仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 北京四环科学仪器厂 郑州南北仪器设备有限公司
2.2 实验方法
2.2.1 麦麸处理方法
称取2g麦麸置于离心管中，加入20mL的孵育液，于一定温度下孵育一段时间后取出离心，测定上清液的多肽含量。 2.2.2 缓冲液种类和浓度对麦麸多肽富集的影响
在一定的培养温度和培养时间下，采用醋酸缓冲液与柠檬酸缓冲液作为培养液，培养后进行多肽含量的测定，得到最适于多肽富集的缓冲液。
将得到的最适缓冲液在相同的pH条件下，分别在缓冲液浓度为0.01 mol/L，0.05 mol/L，0.1 mol/L和0.2 mol/L下进行多肽的测定，选取适合麦麸多肽富集的最适缓冲液浓度。
2.2.3 麦麸多肽的富集工艺的单因素实验
以多肽含量为考察指标，对孵育时间、孵育温度、孵育液pH 值及液料比进行单因素试验。
在pH3，液料比10：1，培养时间为6h的条件下，研究培养温度对麦麸多肽富集的影响，设4个处理，培养温度分别为45℃、50℃、55℃及60℃。
在pH3，液料比10：1，培养温度55℃的条件下，研究培养时间对麦麸多肽富集的影响，设4个处理，培养时间分别为2h、4h、6h及8h。
在液料比10：1，培养温度55℃，培养时间为6h的条件下，研究培养液pH对麦麸多肽富集的影响，设4个处理，pH分别为3.0、4.0、5.0及6.0。
在pH3，培养温度55℃，培养时间为6h的条件下，研究液料比对麦麸多肽
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富集的影响，设4个液料比，分别为4:1、6:1、8:1、10:1(mL/g) 2.2.4 响应面法优化麦麸多肽培养条件
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在单因素试验的基础上，选取培养温度、培养液pH和料液比三个对麦麸多肽富集效果影响显著的因素，采用三因素三水平的响应面分析方法，确定最适的培养条件。试验因素与水平设计见表1。
表1 因素水平表 因素 培养温度(℃) 培养液pH 液料比
代码 X1 X2 X3
-1 50 3 7
水平 0 55 4 8
1 60 5 9
采用Design-Expert 统计软件包对响应面试验数据进行线性回归和方差分析，优化出最适条件组合。 2.2.5 多肽含量的测定
量取1mL 麦麸孵育液于10mL 离心管中，加入4mL PBS 缓冲液(pH7.0、0.2mol/L)，静置提取1h后10000r/min离心15min，上清液中加入等体积10g/100mL三氯乙酸(TCA)溶液，旋涡混合后静置30min，10000r/min 离心15min 以沉淀大分子蛋白质。取3mL的上清液，加入2mL的双缩脲试剂，室温放置10 min，再10000 r/min离心15 min，以还原型谷胱甘肽作为标准，通过测定上清液的A540来计算多肽含量[16]。 2.2.6 多肽抗氧化性的测定 2.2.6.1麦麸多肽预处理
本实验采用响应面优化组的方案孵育麦麸，用得到的麦麸多肽孵育液先经旋转蒸发仪浓缩到一定体积，再进行冷冻干燥，得到的多肽粉用无水乙醇配制成浓度分别为0.15g/mL，0.20 g/mL，0.25 g/mL，.0.30 g/mL，0.35 g/mL的醇提液做麦麸多肽的抗氧化性实验，并与相同浓度的具有显著抗氧化效果的Vc进行比较。 2.2.6.2 清除羟自由基能力
取1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液于试管中,依次加入0.2 mmol/L PBS 2 mL和蒸馏水1 mL,混匀后,加入0.75 mmol/L硫酸亚铁水溶液1 mL,混匀后加入0.01 %过氧化氢水溶液1 mL,于37 ℃恒温水浴中反应60 min后,在536 nm处快速
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测定其吸光值,所得数据为损伤管的吸光值（A损）,未损伤管以1 mL蒸馏水代替损伤管中1 mL 0.01%过氧化氢,操作方法同上,得未损伤管吸光值（A未）。样品管以1 mL多肽醇提液代替损伤管中的1 mL蒸馏水,操作方法同上,得样品管吸光值（A样）。按下式计算样品对羟自由基(·OH)的清除率：
·OH清除率（%）=(A样－A损)/(A未－A损)×100。 2..2.6.3 清除DPPH·自由基活力
配制溶液浓度为1.0×10-4 mol/L DPPH·无水乙醇溶液,避光保存。取2mL麦麸多肽醇提液至2mL DPPH·溶液中,摇匀后静置30 min,以无水乙醇作参比溶液,于517 nm处比色,该值为A1,同时测定2 mL无水乙醇与2 mL DPPH·溶液的吸光值A2,2 mL醇提液与2 mL无水乙醇的吸光值为A0,按下式计算DPPH·自由基的抑制率：
抑制率（%）= [1－（A1－A0）/A2]×100
3 结果与分析
3.1 缓冲液类型对麦麸多肽富集的影响
不同缓冲液对麦麸多肽含量的影响见图1。两种缓冲液对麦麸多肽的含量均呈现先增长后基本保持稳定的趋势。培养6h 时，柠檬酸缓冲液和醋酸缓冲液处理的麦麸所得到的多肽含量分别比孵育前增长2.14和1.98倍。就两种缓冲液而言，孵育时间小于4h时，两种缓冲液孵育的麦麸中多肽含量没有显著差异(P<0.05)；在4h-8h之间两者差异显著，柠檬酸缓冲液培养的麦麸多肽含量高于醋酸缓冲液培养的。
35麦麸多肽含量(mg/g)30252015024时间(h) 图1 缓冲液种类对麦麸多肽富集的影响6810柠檬酸缓冲液醋酸缓冲液
从图1中也可以看出，两种缓冲液孵育麦麸6h时的麦麸中多肽含量最大，
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这说明，6 h是最适孵育时间。
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3.2 缓冲液浓度对麦麸多肽富集的影响
柠檬酸缓冲液浓度对麦麸多肽富集的影响见图2。由图2可见，柠檬酸缓冲液浓度为0.1 mol/L时，麦麸多肽含量最高。因此，本研究选择0.1 mol/L柠檬酸缓冲液作为培养液。
34麦麸多肽含量(mg/g)32302826240.010.050.10.2孵育液浓度(mol/L)图2 孵育液浓度对麦麸多肽富集的影响
3.3 单因素试验结果
3.3.1 培养温度对麦麸多肽富集的影响
在pH3，液料比10：1，培养时间为6h的条件下，研究培养温度对麦麸多肽富集的影响，实验结果如图3所示。由图3可知，随着培养温度的升高，麦麸多肽的含量值逐渐增大，在55℃时达到最高值（35.7mg/g），随后降低。
36343230284550温度(℃)图3 培养温度对麦麸多肽富集的影响5560多肽含量(mg/g)
3.3.2 培养液pH对麦麸多肽富集的影响
在培养时间6h，液料比10：1，培养温度55℃的条件下，研究培养液pH对
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麦麸多肽富集的影响，实验结果如图4所示。由图4可知，随着pH值的升高，麦麸多肽的含量逐渐增加，在pH4时达到最高值32.7 mg/g，之后麦麸多肽含量缓慢降低，趋于平衡。
36麦麸多肽含量(mg/g)3228242034培养液pH图4 培养液pH对麦麸多肽富集的影响56
3.3.3培养时间对麦麸多肽富集的影响
在液料比10：1，培养温度55℃，pH3的条件下，研究培养时间对麦麸多肽富集的影响，实验结果如图5所示。由图5可知，麦麸多肽的含量在2-4h间变化不大，4h后含量增加，6h时达到最高值27.2 mg/g，随后下降。因此，培养6h是麦麸富集多肽的良好时间。
28麦麸多肽含量(mg/g)27262524培养时间(h)图5 培养时间对麦麸多肽含量的影响68
3.3.4液料比对麦麸多肽富集的影响
在pH3，培养温度55℃，培养时间为6h的条件下，研究液料比对麦麸多肽富集的影响，实验结果如图6所示。由图6可知，随着液料比的升高，麦麸多肽的含量先增加后减少，在液料比为8时达到最高值35.3(mg/g)。
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36麦麸多肽含量(mg/g)第11页 共19页
32282446液料比图6 液料比对麦麸多肽富集的影响810
3.4 响应面优化麦麸多肽富集条件的研究
3.4.1 试验设计与结果
表2 实验设计与实验结果表
试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
X1:培养温度(℃)
60 55 60 55 55 60 50 50 55 55 55 60 55 50 50 55 55
X2:培养液pH
4 4 3 5 4 5 3 4 4 3 4 4 5 4 5 3 4
X3:液料比
9 8 8 7 8 8 8 7 8 9 8 7 9 9 8 7 8
多肽含量mg/g
32.0095 36.5279 32.2473 29.8692 36.2901 31.7717 27.7289 28.6801 36.5279 29.8692 36.0529 28.9180 30.5826 29.8692 31.5339 28.6801 35.8145
响应面试验设计与结果见表2，所做的17组试验中所得到的麦麸多肽含量最大的条件是：培养温度55℃、培养液pH 4.0、液料比8:1；得到的麦麸多肽含
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量最小的条件是：培养温度50℃、培养液pH 3.0、液料比8:1。 3.4.2 回归方程的建立及统计分析
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用方差分析的F检验对回归模型进行统计分析，结果列于表3，相关系数R2（0.9868）与调整的相关系数Adj-R2（0.9699）都接近1，说明实际测定值与预测值之间有极高的拟合度。模型的F值为58.35，表明失拟概率低，显著性分析得P<0.0001，说明本实验所得的回归模型对麦麸多肽富集的量有很好的预测性。模型显示X1X2，X1X3，X2X3极显著（P﹤0.001），X1，X3，X12高度显著（P﹤0.01），X2显著（P﹤0.05）。
以麦麸多肽的含量为响应值，经回归拟合后，各因子对响应值的影响可用下面回归方程表示：
Y=-594.76779+11.94048X1+35.54110X2+55.56511X3-0.21403X1X2+ 0.095120X1X3-0.11892X2X3-0.10606 X12-2.77051X22-3.72176X32
表3 回归方程各项方差分析
来源 模型 X1 X2 X3 X1X2 X1X3 X2X3 X12 X22 X32 残差 失拟项 绝对误差 总和
平方和 154.01 6.36 3.42 4.87 4.58 0.90 0.057 29.60 32.32 58.32 2.05 1.67 0.38 156.06
自由度 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16
均方 17.11 6.36 3.42 4.78 4.58 0.90 0.057 29.60 32.32 58.32 0.29 0.56 0.096
F值 58.35 21.70 11.67 16.30 100.95 110.21 198.87 15.62 3.09 0.19 5.78
P﹥F ﹤0.0001 0.0023 0.0112 0.0050 ﹤0.0001 ﹤0.0001 ﹤0.0001 0.0055 0.1224 0.6737 0.0615
显著性 *** ** * ** *** *** *** **
R2=0.9868 Adj-R2=0.9699 Pred R2=0.8251 Adeq Precision=19.353 注：***，差异极显著（P﹤0.001）；**，差异高度显著（P﹤0.01）；*，差异显著（P﹤0.05）。
3.4.3 培养时间、培养液pH和液料比对麦麸多肽含量的影响
培养温度、培养液pH和液料比与麦麸多肽含量之间的关系的响应面图见图7～9。
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为了更直观得表现两个因素同时对响应值的影响，可令其他因素水平值为零，仅考虑这两个因素对响应值的影响，即进行降维分析。得到的二元二次方程可以绘出相应的响应面图和等高线图。从响应面图分析可知，培养温度、培养液pH和液料比对麦麸多肽的含量的影响为随着因素的增大，响应值增大，当响应值达到极值以后，随着因素的增大，响应值逐渐减小。该模型有稳定点，且稳定点是最大值。
36.33 34.30 32.27 肽含量(mg/g) 30.24 28.20 5.00 60.004.50 57.504.00 55.003.50 3.00 50.00 52.50 B: PH A:温度（℃）
图7 培养温度和培养液pH交互作用的响应面图
图7表示了液料比为8:1时，培养温度和培养液pH对麦麸多肽含量的影响。从图中可知，肽含量的变化随培养温度和培养液pH的变化呈现出较大波动，其总体表现为曲线形效应。根据方差分析的结果可知这两个组分之间存在显著交互作用（P<0.05）。当培养温度和培养液pH取值较低时，肽含量随着二者浓度的提高而提高，但当培养温度大于55℃，培养液pH大于4时，肽含量反而下降。
图8表示了培养液pH为4时，培养温度和液料比对麦麸多肽含量的影响。从图中可知，培养温度和培养液pH的交互作用显著（P<0.05），当培养温度和液料比为55℃和8:1时，麦麸多肽含量达到峰值。培养温度和液料比与多肽含量变化关系都是先增大后减小，当培养温度大于55℃，液料比大于8:1时，多肽含量开始下降。.
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36.33 34.30 32.27 肽含量(mg/g) 30.24 28.20 9.00 60.008.50 57.508.00 55.007.50 7.00 50.00 52.50 C: 液料比 A:温度（℃）
图8 培养温度和液料比交互作用的响应面图
36.33 34.30 32.27 肽含量(mg/g) 30.24 28.20 9.00 5.008.50 4.508.00 4.007.50 7.00 3.00 3.50 C: 液料比 B: PH
图9 培养液pH和液料比交互作用的响应面图
图9表示了培养温度为55℃时，培养液pH和液料比对麦麸多肽含量的影响。从图中可知，随着培养液pH和料液比的增加，麦麸多肽含量先增加后降低，在培养液pH和液料比趋于中间值时多肽含量最高。响应曲面坡度较陡峭，表明麦
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麸多肽含量对于培养液pH和液料比的改变较敏感。交互作用显著（P<0.05）。
通过响应面的优化预测，得到麦麸的最佳培养条件为：培养温度为55.8℃，培养液pH 4.09和液料比8.11:1。 3.4.4 模型验证
通过拟合回归方程可以得到，最适的培养温度为55.8℃、培养液pH4.09、液料比8.11:1，麦麸中多肽含量的预测值为36.60mg/g。经验证，以最适条件培养得到麦麸中多肽含量仅仅比预测值低0.61%（36.38 mg/g）。预测值和实际值之间存在较高的拟合度，说明所建立的模型是可靠的；以最适的条件培养麦麸所得到的麦麸多肽含量是原料（15.23 mg/g）的2.39倍，说明优化后的培养液能显著提高麦麸中的多肽含量。
表4 验证性试验结果
培养条件 培养温度（℃） 最优组合
55.8
培养液pH 4.09
液料比 8.11
多肽含量(mg/g)
实测值 预测值 36.38
36.60
3.5 麦麸多肽抗氧化性的研究
3.5.1 清除羟自由基能力的变化
羟自由基(•OH)清除率(%)52423222120.150.200.250.300.350.40醇提液浓度(g/mL)图10 各浓度醇提液羟自由基(•OH)的清除率
羟自由基(·OH)是一种氧化能力很强的自由基，有实验研究表明它是造成生物组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的重要活性氧，在人体衰老方面起着特殊的作用，可以导致许多病理变化。邻二氮菲-Fe2+氧化法主要用于抗氧化研究中检测离体实验体系中羟自由基的氧化作用，是一种比色测定方法，特别是对于抗氧化剂的选择有重要的价值。图10显示了不同醇提液浓度下羟自由基(·OH)的清除率，由图可见随着醇提液浓度的升高，羟自由基(·OH)的清除率增大。
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3.5 2 清除DPPH·自由基活力的变化
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DPPH· （1, 1-二苯基-2-苦肼基）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm 处有最大吸收。添加抗氧化物质后，其将紫色的DPPH·自由基还原成黄色的非自由基DPPH-H形式。当DPPH·溶液中加入自由基清除剂时，其孤电子被配对，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，在517 nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系。故该法可以用来表征某种物质对自由基的清除能力，通常用清除率表示。清除率越大，表明该物质清除自由基的能力越强[17]。
34DPPH•的抑制率(%)30262218140.150.200.250.300.350.40醇提液浓度(g/mL)图11 各浓度醇提液DPPH•的抑制率
通过实验得到数据绘制成图11。如图所示，随着醇提液浓度的增大，DPPH·的抑制率先增大后减小，在0.2g/mL处达到最大DPPH·的抑制率31.2%。查资料知相同浓度下Vc对DPPH·的抑制率为78.4%。
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结 论
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通过研究不同条件下麦麸多肽含量的变化，得到麦麸多肽富集的优化条件，主要结果如下：
1、 通过比较柠檬酸缓冲液和醋酸缓冲液对麦麸多肽富集的影响，得出柠檬酸缓冲液对麦麸多肽富集的作用最为显著。通过研究不同浓度柠檬酸缓冲液对麦麸多肽富集的影响，得出0.1 mol/L柠檬酸缓冲液最适于麦麸多肽的富集。
2、 单因素分析培养温度、培养时间、培养液pH和液料比四种因素对麦麸多肽富集的影响，得出四因素的最佳水平分别为：培养温度55℃、培养时间6h、培养液pH 4.0、液料比8:1。
3、响应面优化得到麦麸多肽富集的最佳培养条件为：培养温度55.8℃，培养液pH 4.09和液料比8.11:1，验证实验得到在该条件下所培养出的麦麸多肽含量为36.3858 mg/g。
4、0.35g/mL麦麸多肽醇提液液对·OH的清除率为48.7%。相同浓度下Vc对·OH的清除率为99.8%。说明该浓度下麦麸多肽具有一定的清除·OH能力。
5、0.2g/mL麦麸多肽醇提液对DPPH·的抑制率为31.2%。相同浓度下Vc对DPPH·的抑制率为78.4%。说明麦麸多肽液对DPPH·具有一定的的抑制率。
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致 谢
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本论文是在导师白青云博士的悉心指导下完成的。导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在此感谢白老师的指导和帮助；感谢实验室各位老师的指导和帮助；感谢淮阴工学院的关心、支持和帮助；在这几年的学习期间，得到各位师兄和师弟妹的关心和帮助，在此表示深深的感谢。没有他们的帮助和支持是没有办法完成我的学位论文的，同窗之间的友谊永远长存。
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