“肺炎双球菌及转化”的几个疑难问题

问题一。：肺炎双球菌的知识在经典转化实验中有呈现，在科学史中也起到了重要的作用。由于是微生物，所以也会有许多疑问在学生中产生，如光滑和粗糙是指菌落，不是细菌，R菌能不能转化为S菌？

肺炎双球菌又称肺炎链球菌，属于原核生物，有R型和S型，它们是肺炎双球菌两个稳定的品系。是一种人畜共患的病原菌，其中S型在人体内引起肺炎，在小白鼠体内导致败血症，使小白鼠死亡。

一、菌种分类

荚膜多糖抗原与致病力有密切关系，且成分复杂。根据荚膜多糖抗原的不同，可将其分为若干血清型，其中～型致病力较强，型最强，且具有厚的荚膜，可作为鉴别此菌的依据。

二、形态特点

肺炎双球菌直径0.5～1.5微米。革兰氏染色阳性，但老龄菌常呈阴性反应。在机体内形成荚膜，经人工培养后荚膜逐渐消失，菌落由光滑型变为粗糙型，肺炎双球菌属双球杆菌属，为化脓性革兰氏阳性菌，呈圆形或披针形、无芽孢，无鞭毛。

三、R菌转化为S菌的机理

被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段，当DNA片段遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜上的结合位点相结合，随后其中一条链被细胞膜上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条单链推进受体细胞（该过程称为DNA的结合和摄取）。

当单链进入受体菌细胞后，便与受体菌DNA上的同源区段发生交换重组。再通过受体菌DNA复制、细胞，而表现出转化的性状，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。

四、S菌不能转化为R菌的原因

S型肺炎双球菌有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，所以在S菌的培养基中加入R菌的DNA，S菌不能被转化为R型。当然S型菌在自然状态下或人工的诱变下发生基因突变，S型菌可能突变为R型，但不是转化。

问题二. 肺炎双球菌S型细菌转化为R型细菌，转化因子是拟核中的DNA还是质粒DNA？

要搞清楚这个问题，首先要搞清楚细菌的变异类型和变异的机制。 一、菌落变异

细菌的菌落主要有光滑（smooth，S）型和粗糙（rough，R）型两种。刚从标本中分离的细菌菌落多为光滑型（S型），长期人工培养后菌落可逐渐变为粗糙型（R型）。S型菌落表面光滑、湿润，边缘整

齐。R型菌落表面粗糙、干皱，边缘不整齐。细菌菌落由光滑型变为粗糙型的变异，称为S-R变异。S-R变异多见于肠道杆菌，细菌发生菌落变异时，其理化性状、免疫原性、耐药性及毒力等也会发生改变。一般S型菌致病性强。但结核分枝杆菌、炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌其毒力菌株就是R型。

二、细菌变异的发生机制

细菌的遗传性变异是由于基因结构发生改变所致，主要通过基因突变、基因转移与重组两种方式实现。

基因突变的方式学生比较熟悉，这里就不叙说了，基因转移与重组这种方式高中没有具体的叙说，下面把这种方式简单总结如下。

遗传物质由供体菌进入受体菌体内的过程称为基因转移。

转移的基因与受体菌DNA整合在一起，称为重组。外源性遗传物质包括细菌染色体DNA片段，质粒DNA及噬菌体基因等。细菌通过某种方式获得外源基因并与自身基因重组，导致自身遗传性状改变是细菌遗传性变异的另一种方式。

基因转移与重组的方式有转化、接合、转导和转换四种。

1、转化

受体菌直接从周围摄取供体菌游离的DNA片段，与自身基因重组后获得新遗传性状的过程。例如，活的无荚膜肺炎双球菌（R）摄取死的有荚膜肺炎双球菌的DNA片段（S）与自身基因重组后获得了形成荚膜的能力，转变成有荚膜的肺炎双球菌（S）。由R型菌转化为S型菌。

2、接合

指遗传物质（如质粒）通过性菌毛由供菌体传递给受体菌，使受体菌遗传性状发生改变的过程。

（1）F质粒接合

带有F质粒的雄性菌，通过性菌毛将F质粒的一条DNA链传递给无性菌毛的雌性菌，质粒DNA复制后，雌性菌获得了F质粒，也具有了形成性菌毛的能力,转变为雄性菌。

（2） R质粒接合

R质粒是由耐药传递因子（RTF）和耐药决定因子（r决定因子）两部分组成。耐药传递因子编码性菌毛，功能与F质粒相似。耐药决定因子编码对抗菌药物的耐药性。这两部分可以单独存在，也可以结合在一起成为复合物，但必须两部分结合在一起时，才能将耐药性转移给其它细菌。

细菌携带的多重耐药质粒也可通过性菌毛转移给其它细菌，从而导致细菌耐药性的扩散，这也是近年来耐药菌株日益增多的一个重要原因。

3、转导

转导是以温和噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新性状的过程。

4、溶原性转换

某些温和噬菌体感染敏感菌后，其基因可整合于宿主菌染色体中，此状态下的细菌称为溶原性细菌。溶原性细菌因DNA结构改变获得噬菌体基因赋予的新性状称为溶原性转换。如无毒性的白喉棒状杆菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、A族溶血性链球菌均可因噬菌体感染呈溶原状态时产生外毒素。

综上所述，无荚膜的R型细菌转化为S型细菌，属于转化，据资料认为，无荚膜的R型细菌有非常重要的“感受态因子”位点，保证了S型细菌的DNA可以进入。这是广义上的基因重组，然后在R型细菌内再得到表达，形成荚膜，使R型细菌转化为S型细菌。

问题三：什么是感受态？S型肺炎双球菌能不能变成R型菌？人工方法如何让细菌产生感受态？

细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态。

细菌的感受态有两种类型：一种是自然感受态，自然感受态细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是人工感受态，在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入外源DNA。枯草芽孢杆菌属于能够发展为自然感受态的细胞，大肠杆菌就属于需要人工处理的细胞。

转化示意图

1．自然感受态—R型活菌

R型肺炎双球菌存在控制荚膜不能形成的基因，S型肺炎双球菌存在控制荚膜合成的基因。将加热杀死的S型菌与R型活菌混合后，注入小鼠体内，发生了R型菌向S型菌的转化。并非任意两株R型菌与S型菌之间的接触都可发生转化。据研究，凡能发生转化的，其R型菌必须处于感受态。

（1）R型菌的特点

据资料,作为受体菌的R型活肺炎双球菌在其生长后期，即对数期后期大约40分钟内处于“感受态”。

R型活肺炎双球菌细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，可诱导与感受态有关蛋白的表达，其中包括自溶素，它使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶裸露出来。正是因为

感受态因子的作用，使得R菌在对数期后期吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。

（2）R型活菌转化成S型活菌的实质过程

由于加热后的S型肺炎双球菌的蛋白质外壳结构被破坏，从有秩序而紧密的构造，变为无秩序而松散的构造，导致出现外壳自溶现象，释放出自身的DNA片段（双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。

① 当“转化因子”遇到处于感受态的R型肺炎双球菌时，就有10个左右这样的双链片段被R型肺炎双球菌细胞膜表面的“感受态因子”位点结合。

② 在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞。

③ 进入细胞的单链DNA片段与R型肺炎双球菌DNA的同源区段配对，并使受体DNA的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态）。

④ 随着R型肺炎双球菌的生殖，DNA进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌（S型肺炎双球菌），另一类似受体菌（R型肺炎双球菌）。当细胞后，此DNA发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出了S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化，其实质是基因重组。

如图所示：

（3）R型活菌转化成S型活菌的相关解释

① 因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过生殖形成R型和S型两种后代，不是R型直接变成S型。

② 无荚膜的R型有非常重要的感受态和感受态时期，保证了S型的DNA在特定的时期可以进入R型菌中。

③ S型有荚膜，无感受态，因此不能作为受体菌，如果人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，同样会有感受态。自然状态下两者可以通过基因突变来完成相互转变，人工方法是利用理化方法诱发突变完成相互转变。

④ 发生转化需要有亲缘关系，转化本身只发生在同种菌株间或近缘菌株间。真核生物的细胞膜表面结构与原核生物的大不相同，不会发生转化。

2．人工感受态—大肠杆菌

野生型大肠杆菌并不容易转化，这是由于DNA无法进入野生型大肠杆菌的细胞。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。

大肠杆菌需要诱导才能变成感受态细胞，而有些细菌细胞则在自然条件下，或是在改变培养基和其他培养条件下就可变成感受态细胞。

大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

目前CaCl2转化方法的机制尚不清楚，可能是细胞壁被打了一些孔，DNA分子从这些孔洞中进入细胞，而这些孔洞随后又可以被宿主细胞修复。可以接受DNA的细胞称为感受态细胞。

另外，CaCl2化学试剂处理细菌后，是增加细胞膜的通透性还是细胞壁的通透性，不同的教材有不同的观点，浙科版认为增加细胞壁通透性。

这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。

问题四：肺炎双球菌的荚膜作用和控制合成的基因在哪里？ 试题：如图为科研人员将S型肺炎双球菌的DNA分子切成片段导入R型菌的过程．相关叙述错误的是（ ）

A．S型菌表面多糖类荚膜的形成受DNA（基因）控制 B．实验室中过程②的实现可用Ca2+处理 C．过程⑥需要酶和DNA聚合酶催化

D．肺炎双球菌转化的实质是游离DNA片段的转移和重组 答案：C

解析：由图可知，导入S型菌DNA分子片段后形成的S型菌表面有多糖类荚膜，所以多糖类荚膜的形成受DNA（基因）控制，A正确；使微生物（R型菌）成为感受态细胞时需要用Ca2+处理，B正确；过程⑥是重组细菌的增殖，该过程需要DNA聚合酶催化，不需要酶，C错误；肺炎双球菌转化的实质是基因重组，既游离DNA片段的转移和重组，D正确。

那么,荚膜有关的基因在哪里？在拟核还是质粒？

荚膜是某些细菌在一定条件下或生长发育到某一阶段时，在细胞壁外一层厚度不均的胶状物。是一种毒力因子，本身没有毒性，具有抗吞噬作用，所以致病性。

产生荚膜与否是细菌的一种遗传特性，遗传物质在哪里呢？是在质粒上，还是在拟核中？

荚膜多糖合成相关的基因主要包含3类，即荚膜多糖合成调节基因，糖基转移酶基因和转运基因。

也就是说，荚膜多糖的合成是一个多基因参与的过程，目前研究已知，所有型的肺炎双球菌控制合成荚膜多糖的有关基因都在染色体上，并且位于dexB 和 aliA 基因的之间（专一论文表述）。

具体的控制合成途径略。