木质纤维素的定量测定及降解规律的初步研究

2004年10月BIOTECHNOLOGYOct12004一对特异性引物扩增,产物的大小也能在凝胶电泳中区分[2]。本研究采用竞争基因片段大于目的基因的设计,利用了带有

内标的竞争基因片段进行竞争PCR检测,仅仅是竞争PCR产物的大小与目的基因有区别。

图3　通过pQRS定量小鼠免疫前后细胞因子基因表达

A表示未免疫的小鼠细胞因子的竞争结果;B表示口蹄疫商品疫苗免疫小鼠后对各种细胞因子的定量分析;

μC表示DNA疫苗pCD-vp1免疫小鼠后,对细胞因子图的竞争PCR结果。胶图的上方数字代表pQRS的浓度(10ngΠmL);

-5-6-7-8-9-10

n代表,,,,,

　　由于DNA片段EB染色后,紫外光照射样品后激发的荧光亮度与DNA片段浓度有线形关系可以用来确定DNA的量,但这种线形关系是依赖于基本相同的目的基因,当两种DNA片段大小相差较大时不能用此方法[7,8]。本研究使用的竞争基因片段和目的基因之间只差几十个碱基的区别,不需要考虑这种影响[9]。实验中为了控制不同实验组RT-PCR的扩增结果的一致性,用HPRT作为对照,既能进行动态的分析,也能比较RNA提取的质和量。

在竞争PCR检测之前,必需先进行各种细胞因子的PCR条件的优化,每种细胞因子在特异性引物的不同决定了PCR条件的不同,但大多是在退火温度上变化,如HPRT和IFN-γ的退火温度可以达到60℃,而IL-10只能到54℃。同时镁离子浓度也是影响竞争PCR结果的重要因素之一。实验中为了检测RNA提取的质量,以保证竞争PCR结果的可靠,使用内标的HPRT基因作为对照,HPRT在小鼠体内各种细胞中均有表达,而且免疫前后在表达量上变化不大。

本研究结果表明利用竞争PCR分别对口蹄疫DNA免疫、口蹄疫商品灭活疫苗免疫和未免疫的小鼠的脾脏表达的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ进行了定量检测,用DNA疫苗pCD-vp1免疫小鼠后,IL-2和IFN-γ的mRNA表达量上升了10-100倍(从10-8提高到10-7和10-6),表明DNA疫苗pCD-vp1免疫后小鼠脾脏内T细胞大多向Th1型分化和增殖。而以口蹄疫灭活疫苗免疫的小鼠,IL-4和IL-10的表达量明显上升(从10-8和10-9提高到10-7),表明口蹄疫灭活疫苗免疫后,小鼠脾脏T细胞向Th2型分化和增殖。

因此利用竞争PCR技术能够较为准确的定量分析疫苗免

疫接种小鼠脾脏表达各种细胞因子的水平,预测疫苗免疫接种后的细胞免疫趋势,为深入分析疫苗免疫小鼠产生的细胞免疫反应奠定了基础。

参考文献:[1]MosmannTR,SSed.TheexpandinguniverseofT-cellsubsets:Th1,Th2andmore[J].Immunol.Today,1996,17:138-146.

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木质纤维素的定量测定及降解规律的初步研究

杜甫佑,张晓昱,王宏勋

(华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉430074)

摘要:为了准确地测定稻草及其发酵物中纤维素、半纤维素、木质素的含量,通过差重法进行定量测定,并以此评价白腐菌株Pleurotussapidus对稻草秸秆的降解状况,结果表明:利用差重法测定稻草发酵物中纤维素、半纤维素、木质素的百分含量是可行的,并能很好地评价白腐菌对稻草的降解规律,即降解过程中纤维素、半纤维素、木质素在前20d降解的很快,之后降解减缓,在50d内,纤维素被降解34.02%,半纤维素被降解56.29%,木质素被降解61.65%。

关键词:白腐菌;差重法;木质纤维素

中图分类号:Q53913　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)05-0046-03

3

StudiesonQuantitativeAssayandDegradationLawofLignocellulose

(CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074,P1R1China)

DUFu-you,ZHANGXiao-yu,WANGHong-xun

3

Abstract:Inordertodeterminethecontentofcellulose,hemicelluloseandlignininstrawandthefermentationa-ccurately,thispaperreportedthequantitativeassaythroughdispersionmethod,whichevaluatedegradativestatuso-fstrawbyPleurotussapidus.Theresultsshowthatthedis2persionmethodwhichdeterminatethecontentsofce-llulose,hemicelluloseandlignininfermentationstrawisfeasible.Wefindoutthedegrada2tionruleofstrawbyad-optingimproveddispersionmethod,cellulose,hemicelluloseandligninaredegradatedveryquicklyinearly20days,afterthat,theratesofdegradationtothemaredecreased,intheall50days,cellulosevalueisdegradated34.02%,hemicellulosevalueisdegradated56.29%,andligninvalueisdegradated61.65%.

Keywords:white-rotfungi;dispersionmethod;cellulose;lignin

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2004年10月　　　　　　　　　　　　　木质纤维素的定量测定及降解规律的初步研究　　　　　　　　　　　　　　　　　47

　　白腐菌是自然界降解木质素最有效的一类微生物,国内外开展了很多的相关研究。白腐菌研究中很重要的一部分工作就是利用白腐菌降解木质纤维素物质,实现木质纤维素资源的综合利用,一般是通过研究基质的结构变化[1]、测定基质

[1-3]

中木质纤维素含量的变化等来进行降解效果好坏的评价。测定秸秆发酵物中纤维素、半纤维素、木质素含量的方法很多,现阶段应用比较多的分析方法是王玉万等所用的系统分析法[4]。通过比较实验,根据作者在稻草等秸秆中的具体测定,作者认为采用改进的差重法(中性洗涤剂洗涤、2MHCl水解、75%H2SO4水解及灰化),也能够很好地评价白腐菌的降解状况。通过对白腐菌降解稻草固体发酵物中半纤维素、纤维素和木质素三者百分含量的测定,以此验证差重法的可行性和准确性,同时初步探讨白腐菌株Pleurotussapidus对稻草的降解状况。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验菌种:白腐菌Pleurotussapidus,本实验室筛选保藏,编号为BP。1.1.2　稻草样品:来源于湖北武汉市郊,风干,经粉碎机粉碎成40目左右的稻草粉;稻草发酵样品:取经过不同天数BP发酵后的稻草样品,经pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液浸泡3h,再过滤,将滤渣烘干,即得实验所用的发酵样品。

1.1.3　试剂:地衣酚,化学纯,上海试剂一厂;无水乙醇和95%乙醇,上海振兴化工一厂;丙酮、硫酸钙和硫酸锰,分析纯,天津市化学试剂三厂;硫酸和盐酸、中性洗涤剂(所用药品十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、四硼酸钠、磷酸氢二钠、甘油单醚等均为分析纯),武汉市亚泰化工试剂有限公司。1.1.4　仪器:烘箱,KWY-500-1型,武汉市武昌实验仪器厂;压力蒸气灭菌器,YX-450A型,上海三申医疗器械有限公司;超净工作台,SW-CJ-2FD,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;马福炉,SRJX-2-9X型,湖北英山国营无线电元件厂;电子精密天平,AR2130型,上海奥豪斯公司;平底砂芯坩锅、耐酸滤过漏斗,鹿头牌,长春玻璃制品有限责任公司;分光光度计,754型,上海精密科学仪器有限公司。1.2　方法1.2.1　菌液培养:将菌株BP在斜面固体土豆培养基中进行种子活化,培养7d,将活化的斜面种接入液体土豆培养基中,

)。培养5～7d,即得种子液(培养温度为25℃

1.2.2　稻草基质发酵培养:分别称取3.00g上述稻草粉加入到11个250ml的烧瓶中,分别加入0.02gCaSO4、0.06gMnSO4和12ml自来水,混匀,121℃-125℃灭菌30min,按10%的接种量接入上述培养好的种子液,25℃静止培养。1.2.3　发酵样品:每5d取固体发酵样品,用150mlpH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液浸泡3h,过滤,滤液待用,滤渣于60℃烘干,用于测定其中纤维素、木质素、半纤维素的含量。1.2.4　试剂的配制

中性洗涤剂、2molΠLHCl溶液、地衣酚试剂均采用文献[4]

上方法配制,其他试剂采用常规法配制。1.2.5　差重法测定稻草基质中纤维素、半纤维素和木质素含量

(1)样品放入60℃的烘箱中恒重。

(2)取两份0.500g恒重的平行样品,分别置于100ml碘量瓶中,各加入50ml中性洗涤剂,之后放入已沸的高压锅,100℃保温1h,取出用恒重过的耐酸滤过漏斗(重量为W01)过滤,滤渣热水洗至滤液无中性洗涤剂且pH=7.0,再用丙酮洗2次,放入烘箱中烘干,称量滤斗和样品的总重(W1克),将其中一份滤渣在550℃马福炉中灰化4h,得灰分Wg。

(3)取出上述一份干样,放入100ml的碘量瓶中,加入50ml2molΠL盐酸溶液,然后放入已沸的高压锅中,100℃准确保温50min,用重量为W02的耐酸滤过漏斗过滤至中性,滤液用地衣收稿日期:2004-03-02;修回日期:2004-05-08

作者简介:杜甫佑(1975-),男,在读硕士生,研究方向:白腐菌降解木质纤维素资源的特性研究,E-mail:dufuyou.9642@163.com;3通讯联系人:张晓昱(1957-),女,教授,研究方向:环境资源的微生物技术领域中生物降解与生物转化。

酚试剂测定半纤维素的量,滤渣再依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次,耐酸滤过漏斗和残渣于60℃烘箱中烘至恒重,为W2。

(4)将(3)中残渣放入50ml烧杯中,加入5ml致冷的75%的硫酸,室温水解3h后,再加入45mzl水,室温过夜,次日用平底砂芯滤斗(重量为W03)过滤,用蒸馏水洗残渣至滤液pH=6.5-7.0,滤渣和平底砂芯滤斗在60℃下烘至恒重,为W3,差重为W3-W03。

(5)将残渣和平底砂芯滤斗在550℃马福炉中灰化4h,干燥器中平衡至恒重,为W4,差重为W3-W4,灰分为W4-W03,按上述过程测定另外平行样品3份。

计算方法:

半纤维素的百分含量(%)=[(W1-W01-W)-(W2-W02)]/01500×100%;

纤维素的百分含量(%)=[(W2-W02)-(W3-W03)-(W4-W03)]/01500×100%;

木质素的百分含量(%)=(W3-W4)/01500×100%。

2　结果与分析

2.1　半纤维素测定

从表1可知,用差重法和地衣酚法[4]平行测定同一份样品3次,半纤维素百分含量的数据重复性很好,误差的绝对值在2%以内,属于误差容许范围。采用地衣酚试剂来测定半纤维素的含量时,同一样品其含量的数据一般比用差重法所测的略小,数据略小的原因可能是:(1)用地衣酚试剂所测出的主要是木糖的质量,而半纤维素的酸水解液中还有少量的阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖等,从而使换算出的半纤维素的含量偏小;(2)从表4可以看出,差重法所测的半纤维素含量也包含有发酵固体中菌丝体的部分质量;(3)差重法所测的半纤维素的量包含有很少量纤维素和木质素的部分降解产物。但从图1可以看到,用差重法与用地衣酚试剂所测的半纤维素含量的变化规律及趋势是一致的。

表1　两种方法测定不同天数稻草发酵物中

半纤维素的含量比较(%)

天数(d)半纤维素(王玉万的系统分析法)平均值半纤维素

(本实验中的差重法)

024.9023.0924.5524.1825.6126.5626.3126.49

523.1022.1923.6023.9624.5724.7525.2524.86

1021.0121.3021.3121.2121.3121.6220.8421.26

1518.6119.1019.0118.9119.9419.9219.0019.62

2015.1514.1314.2014.4916.6016.1916.3516.38

2513.0112.8612.9012.9214.0014.2914.3514.21

3012.1211.2712.0411.8114.1813.5913.7713.85

3511.4211.6010.1011.0413.6313.9413.7413.77

409.989.919.809.9012.8612.5212.5212.63

459.209.569.489.41

509.379.129.039.17

12.2211.6512.0111.7912.3011.3012.1811.58

平均值

图1　两种方法测定发酵基质中半纤维素含量的变化情况

图2　稻草固体基质中纤维素、半纤维素和木质素的含量变化

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第14卷第5期:48生　物　技　术Vol114,No15:48

2004年10月BIOTECHNOLOGYOct12004

2.2　硫酸的浓度对稻草样品中纤维素和木质素含量测定的影响

在室温下采用不同的浓硫酸与经中性洗涤剂和2molΠLHCl处理过的两份相同样品作用3h后,再稀释到原浓度的1Π10,过夜,结果如表2所示。从表中数据可以看出,硫酸的浓度采用75%的测定结果稳定而且较理想。过浓的硫酸易造成试样中纤维素的碳化并混入木质素中,过稀则将造成纤维水解不完全,这两者都会使所测的纤维素含量偏低而木质素含量偏高。利用75%硫酸评价菌株降解木质纤维素的评价(表3)可以看出,纤维素、木质素在75%硫酸的浓度下平行测定数据之间的误差很小,且都在2%以内,属于误差容许范围。采用该浓度能够较好的实现发酵基质中纤维素和木质素的含量测定。

表2　硫酸浓度对测定结果的影响(单位:%)

硫酸的浓度(%)纤维素含量木质素含量

34.410.6

7233.410.2

34.810.4

7535.210.2

31.610.8

7836.211.4

33.611.7

8033.810.6

表4　菌丝体在测定过程中的失重百分率(单位:%)

菌丝体

平均值75%H2SO4处理中性洗涤剂处理2molΠLHCl处理26.6727.6328.8148.2447.3647.3122.3824.0225.49

27.7047.6423.96　　注:此过程中所用的原样品为天然稻草

2.3　差重法中菌丝体对半纤维素、纤维素和木质素含量测定

的影响

随着天数的增加,菌丝体的量会增大,因菌丝体很难从固体基质中分离出来,所以当用差重法处理数据时,菌丝体的量会影响半纤维素、纤维素和木质素的含量。从表4可知:在用2molΠLHCl沸水浴处理过程中,菌丝体的量会失去47.64%;在经75%的浓硫酸及稀硫酸处理后,菌丝体的量会失去23.96%;在灰化过程,剩下0.7%的菌丝体量会全部失去,由此可以证实:用差重法处理时,菌丝体的量对半纤维素的含量影响最大,其次是对纤维素含量的影响,而对木质素的含量影响很少。不过,由于固体基质中菌丝体的量相对于固体基质的质量而言是很小的,不会影响发酵基质中纤维素、半纤维素和木质素的含量变化趋势及规律。

表3　75%硫酸测定不同天数稻草发酵物中纤维素、木质素的百分含量(单位:%)

天数(d)

038.60

538.1038.0038.2138.1010.4710.3410.4010.40

1035.4735.3035.3835.389.889.509.619.66

1532.1531.7833.6632.539.339.679.319.44

2030.9230.9430.2030.697.377.377.417.38

2530.1229.0629.8229.676.676.546.376.53

3028.5229.0028.8128.726.276.506.506.42

3527.6327.6328.1727.815.685.695.695.69

4027.8627.4827.5027.615.475.455.405.44

45

50

26.8725.3726.9825.3228.1525.1927.3325.295.135.135.155.14

4.514.484.684.56

2.4　稻草固体基质的生物降解

从图2可以看到,白腐菌株BP在前25d,快速地降解稻草中的纤维素、半纤维素和木质素,且木质素和半纤维素的相对降解速率都大于纤维素的相对降解速率。具体而言,纤维素的平均含量从38.33%降到29.67%,降解了原纤维素的22.59%;半纤维素的含量从26.49%降到14.21%,降解了原半纤维素的46.36%;木质素的含量从11.89%降到6.53%,降解了原木质素的45.08%;但从第25d开始,三者被降解的速率都减缓。在50d内,纤维素被降解了34.02%,半纤维素被降解了56.29%,木质素被降解了61.65%。

综上,用差重法对稻草发酵基质中纤维素、半纤维素和木质素的含量进行定量分析,从发酵基质中木质纤维素含量的变化情况可推知,白腐菌株BP能同时降解稻草基质中的半纤维素、纤维素和木质素,即木质素的降解是依赖于纤维素、半纤维素等碳水化合物水解所提供的碳源和能源而进行的。总体而言,降解木质素的相对速率最大,降解纤维素的相对速率最慢,说明白腐菌BP对木质素降解具有一定的选择性和优势,这些对进一步利用菌株BP改变稻草等秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的组成及含量,实现木质纤维素资源的充分利用具有一定的指导作用。

3　讨论与王玉万等所采用的系统分析程序相比较,用此实验中差重法测定时,所需仪器简单、试剂易得,且不需要地衣酚试剂、蒽酮试剂,所得结果对于分析白腐菌降解木质纤维素类物质变化规律是可行的。当然,对于不同的固体基质,其纤维素、半纤维素和木质素的结构和组成是有所不同的,因而盐酸、硫酸浓度及水解时间是需要做预实验才能确定的。此方法虽不适宜用于测定发酵基质中木质纤维素类物质中纤维素、半纤维素和木质素的绝对含量,但用于对比性研究白腐菌降解木质纤维素类物质的效果及规律是完全可靠的。

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纤维素37.9838.60

平均值38.3311.86

木质素11.8811.94

平均值11.89

刺孢小克银汉霉产γ-亚麻酸代谢规律的研究

梁凇,张晓昱,王宏勋

(华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉430074)

摘要:采用液体发酵的方法,通过研究发酵过程中生物量、油量和GLA合成之间的关系以及MgSO4、MnSO4和(NH4)2SO4对三者的影响,明确一株刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)产γ-亚麻酸的代谢规律和不同因子对代谢规律的影响和因子添加的可能性。结果显示,生物量和油量的积累先于GLA到达高峰;在生长中期生物量积累处于稳定,GLA的合成速率高于油脂产生的速率,使得油脂中整体GLA含量开始上升;后期由于营养消耗,菌体利用自身合成的油脂作为能量供给减饱和酶系,GLA含

2+2++

量呈快速增长过程并且持续;Mg、Mn和NH4离子对GLA合成有一定的促进,但作用机制各不相同,可通过在不同的时期的添加使GLA的积累增加。

γ-亚麻酸;合成;离子关键词:刺孢小克银汉霉;

中图分类号:Q939　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)05-0048-03

3

StudyonMetabolicLawofγ-linolenicAcidProducedbyCunninghamellaechinulata

LIANGSong,ZHANXiao-yu,WANGHong-xun

(TheCollegeofLifeScienceandTechnologyofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074,P1R1China)

Abstract:SomefilamentousfungicanproduceGLAduringthefermentation.Therelationshipamongbiomass,lipidandGLAofCunninghamellaechinulataandtheeffectofotherionsonitwerestudied.TheresultshowedthatbiomassandlipidreachedthepeakearlierthanGLA,andthentheaccumulationofbiomassbecamesteady.ThesynthesisofGLAwasquickerthantheproductionoflipidsothatGLAratioofthelipidstartedtoin2crease.Later,thefungusstartedtoutilizethesynthesizedlipidasenergyofdesaturationbecauseofconsumptionofnutrition,andtheratioofGLA

2+2++

increasedrapidlyandcontinuously.ThemechanismsofGLAincreasebyMg,MnandNH4weredifferent.Soitispossibletoimproveaccumu2

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