吕丹妮;摆志霞;陈学新
【摘 要】目的 探讨线粒体通透性转运孔(mPTP)是否参与脂肪乳救治布比卡因心脏毒性时对能量代谢的影响.方法 H9C2心肌细胞复苏培养,随机将其分为4组(n=3):布比卡因组(BPV)加入1mmol· L-1BPV;布比卡因+脂肪乳组(BPV+ LE)同时加入1mmol·L-BPV和1％ LE;布比卡因+脂肪乳+环孢素A组(BPV+ LE+ CsA)加入1mmol·L-BPV、1％ LE以及mPTP抑制剂CsA(1 μmol·L-);布比卡因+脂肪乳+苍术苷组(BPV+ LE+ Atr)加入1mmol·L-BPV、1％LE以及mPTP开放剂Atr(20 μmol·L-1).4组分别孵育24h后,用高效液相色谱仪检测其能量代谢(ATP、ADP、AMP),Hoechst33342/PI法检测细胞的凋亡率.结果 与BPV组比较,BPV+ LE组和BPV +LE+ CsA组ATP、ADP、AMP含量增加,细胞凋亡率下降(P＜0.05),BPV+ LE+ Atr组ATP含量增加(P＜0.05)而ADP、AMP的含量以及细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05);与BPV+ LE组比较,BPV+ LE+ CsA组的ATP、ADP、AMP的含量增高、细胞凋亡率降低(P＜0.05),BPV+ LE+ Atr组ATP、ADP、AMP含量降低,细胞凋亡率增加(P＜0.05);与BPV+ LE+ CsA组比较,BPV+LE+ Atr组ATP、ADP、AMP含量均降低,细胞凋亡率增加(P＜0.05).结论 脂肪乳通过抑制mPTP的开放逆转布比卡因所致H9C2心肌细胞毒性时能量生成的减少以及细胞凋亡率的增加.
【期刊名称】《宁夏医科大学学报》 【年(卷),期】2016(038)001 【总页数】5页(P21-24,封4)
【关键词】脂肪乳;布比卡因;能量代谢;线粒体通透性转运孔;心肌细胞毒性 【作 者】吕丹妮;摆志霞;陈学新
【作者单位】宁夏医科大学,银川750004;宁夏医科大学总医院肿瘤医院麻醉科,银川750004;宁夏医科大学总医院肿瘤医院麻醉科,银川750004 【正文语种】中 文 【中图分类】R614.3
布比卡因为临床上常用的局麻药，如果过量或者误入血管则会引起严重的心脏毒性。有文献报道布比卡因引起心脏毒性的机制之一是其影响线粒体功能，导致能量代谢障碍[1-3]。脂肪乳作为临床上常用的静脉营养药物之一，可以通过氧化分解生成ATP，从而为机体提供生理活动所需的能量，但脂肪乳救治布比卡因心脏毒性的确切机制尚不清楚。有研究显示，在大鼠布比卡因心脏毒性模型中证明脂肪乳救治布比卡因心脏毒性与脂肪酸的氧化相关，这种作用与阻滞钙触发的线粒体通透性转运孔(mPTP)有关[4]。本实验拟观察脂肪乳通过mPTP逆转布比卡因对心肌细胞线粒体能量代谢的影响，探讨其作用机制。
H9C2大鼠心肌细胞(中国科学院上海细胞库)；盐酸布比卡因(康奇制药有限公司，批号121120)；脂肪乳(立邦制药有限公司，批号13010841)；环孢霉素素A(Sigma-Aldrich 化学有限公司)；苍术苷(春秋生物工程有限公司)；DMEM高糖培养基和Penicillin-Streptomycin Solution(100×)(Gibco 公司，美国)；FBS胎牛血清(Hyclone)；ATP,ADP,AMP检测试剂盒(北京索莱宝公司)；Hoechst33342染色液(碧云天)。
将H9C2心肌细胞复苏之后，培养、传代，所用培养基为含10%胎牛血清高糖DMEM完全培养基。细胞传4代后将细胞接种于96孔细胞培养板上(密度为105
个·L-1)，细胞生长达80%～90%时用于实验。将细胞随机分为4组(n=3):布比卡因组(BPV)、布比卡因+脂肪乳组(BPV+LE)、布比卡因+脂肪乳+环孢素A组(BPV+LE+CsA)和布比卡因+脂肪乳+苍术苷组(BPV+LE+Atr)。盐酸布比卡因和脂肪乳均用培养基稀释，布比卡因的终浓度为1mmol·L-1，脂肪乳的终浓度为1%。环孢素A和苍术苷用DMSO溶解，终浓度分别为1、20 μmol·L-1。1mg的碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶于10mL PBS中，配制成100μg·mL-1的储备液，用前等量混合(注意避光)。BPV组加入含1mmol·L-1 BPV的培养液；BPV+LE组加入含1mmol·L-1 BPV和1%LE的培养液；BPV+LE+CsA组加入含1mmol·L-1 BPV、1%LE和1μmol·L-1 CsA的培养液；BPV+LE+Atr组加入含1mmol·L-1 BPV、1%LE和20μmol·L-1 Atr的培养液。加入药物后的细胞在培养箱中继续孵育24h，进行实验。
采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。
与BPV组比较，BPV+LE组和BPV+LE+CsA组ATP、ADP、AMP的含量均增高(P均<0.05)，BPV+LE+Atr组ATP含量增加(P<0.05)，而ADP、AMP含量的差异均无统计学意义(P>0.05)；与BPV+LE组比较，BPV+LE+CsA组的ATP、ADP、AMP含量均增高(P均<0.05)，BPV+LE+Atr组ATP、ADP、AMP含量均降低(P均<0.05)；与BPV+LE+CsA组比较，BPV+LE+Atr组ATP、ADP、AMP含量均降低(P均<0.05)。见表1。
正常细胞呈弥散均匀低蓝色荧光，核呈正常结构，凋亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶、碎片状，边集；PI 染色，凋亡细胞染成红色，亮红色为坏死细胞。图1(见封4)。
与BPV组比较，BPV+LE组和BPV+LE+CsA组细胞凋亡率均下降(P均<0.05)，BPV+LE+Atr组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；与BPV+LE组比较，
BPV+LE+CsA组细胞凋亡率下降，BPV+LE+Atr组细胞凋亡率增加(P<0.05)；与BPV+LE+CsA组比较，BPV+LE+Atr组细胞凋亡率增加(P<0.05)。见表2。 本实验应用的布比卡因和脂肪乳的浓度分别参照文献[5]和[6]。先前的实验结果表明，不同浓度的脂肪乳对H9C2心肌细胞的生长无抑制作用，反而有轻微的促进增殖作用，1% LE的作用最显著[7]。不同浓度布比卡因对细胞生长有明显的抑制作用，1 mmol·L-1的BPV可以抑制大部分细胞的生长[8]；细胞给与药物处理后孵育24 h，所有药物的药效达到了最佳水平[7-8]。所以本实验采用1 mmol·L-1的BPV和1%的LE药物作用24h,再进行后续实验。
布比卡因临床主要应用于神经阻滞、硬膜外阻滞和蛛网膜下腔阻滞，如果过量或误入血管，则会出现严重的心脏毒性。布比卡因心脏毒性机制可能是抑制心肌钾、钙和钠离子通道，影响心肌细胞的动作电位[9-11]；影响线粒体呼吸酶活性以及氧化磷酸化，最终影响能量代谢[1-3,12-13]。
脂肪乳是临床常用的营养物质，可以为机体提供所需的能量和必须脂肪酸[14]。已有大量实验研究表明，脂肪乳可以逆转布比卡因所致的心脏毒性[15-17]，但其确切机制还不清楚。有学者证明脂肪乳分解生成的游离脂肪酸可以减少局麻药对心肌细胞线粒体内膜的肉毒碱脂肪酰转移酶(CACT)的抑制，恢复心肌细胞通过脂肪酸氧化产生ATP的能力，从而减轻布比卡因对心肌能量代谢的影响[18]。mPTP是位于线粒体内膜上的高通透性蛋白复合体，其核心组成包括腺嘌呤核苷酸(ANT)、亲环素D(Cyp-D)、电压依赖的阴离子通道(VDAC)以及己糖激酶II(HK-II)。有学者在大鼠布比卡因心脏毒性模型中证明脂肪乳救治布比卡因心脏毒性与脂肪酸的氧化相关，脂肪乳组针对钙超载的钙储存容量，线粒体的氧化速率以及膜电位均比布比卡因组高，通过钙离子转运体转运的钙离子升高就会触发mPTP的开放，脂肪乳可能增加心肌细胞的内稳态，使其能更好的调节钙超载，从而抑制mPTP的开放[4]。所以本实验应用mPTP阻滞剂CsA和开放剂Atr,探究mPTP是否参与脂
肪乳救治布比卡因对H9C2心肌细胞能量代谢的影响。本实验结果表明，与BPV+LE组比较，BPV+LE+CsA组ATP、ADP的生成增加，细胞凋亡率降低；BPV+LE+Atr组ATP、ADP、AMP的生成均减少，细胞凋亡率增加，表明mPTP极有可能参与了脂肪乳逆转布比卡因对H9C2心肌细胞能量代谢的影响。脂肪乳作用于mPTP的具体部位还有待于进一步验证。
综上所述，脂肪乳在H9C2心肌细胞布比卡因中毒模型中极有可能作用于mPTP逆转布比卡因所致的能量生成减少，减少细胞凋亡，从而保护心肌细胞。
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