总DNA提取

总DNA提取

一、目的

提取真核生物基因组DNA。本方法分离的DNA，主要用于DNA杂交、PCR扩增、RFLP及RAPD分析以及基因组克隆分离纯化目的基因。

二、原理

总DNA的分离通常是在有EDTA及SDS、CTAB一类的去污剂消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这里介绍的方法是CTAB法。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7 mol/L NaCl）中可溶并且稳定存在，通过加入等体积的异丙醇将DNA沉淀下来。

三、器材

台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，PCR管，吸头，标签纸，磁力搅拌机和水浴锅。

四、材料与试剂

材料：水稻叶片。

4.1 CTAB方法

（一） 试剂

（1）1M Tris-Hcl (pH 8.0)：称取24.22 g Tris，加入150 ml双蒸水，溶解后，用浓HCl调pH值至8.0，定容至200 ml。

（2）10 M NaOH： 取40 g NaOH，加入双蒸水，定容到100 ml，高压灭菌。

（3）0.5M EDTA (pH 8.0)：称取EDTA 37.22 g加入150 ml双蒸水，在搅拌器上剧烈搅拌，用10 M NaOH调pH 8.0，定容至200 ml。

（4）1.5×CTAB：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵Hexadecyltrimethyl ammonium Bromide）1.5 g；1 M Tris-HCl（pH 8.0）7.5 ml；6.13g NaCl；0.5 M EDTA（pH 8.0）3.0 ml；加蒸馏水定容至100 ml，湿热灭菌后。加入200 μl β-巯基乙醇。

（5）无DNase的RNase A：称取100 mg RNA酶粉剂，溶于10 ml 10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷至室温。分装，－20℃保存。

（6） 1×TE 缓冲液（pH 8.0）（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）：取2 ml 1M Tris-HCl (pH 8.0)，加入0.4 ml 0.5M EDTA（pH 8.0），定容到200 ml。

（7）0.1×TE（pH8.0）：取1×TE 缓冲液稀释10倍。

（8）100%的乙醇。

（9）70%乙醇：取100% 70 ml，加双蒸水定容到100 ml。

（二）方法

（1）取少量叶片（约0.2~0.5 g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（2）加入800 µl 1.5×CTAB抽提液（含0.2%的β-巯基乙醇）到研钵中，轻轻搅动；

（3）将磨碎液倒入1.5 ml的灭菌离心管中；

（4）置于65℃的恒温水浴槽中35 min，每隔10 min轻轻摇动；

（5）冷却2 min后，加入氯仿至满管，上下轻轻摇动，使两者混合均匀，并持续摇动5 min；

（6）放入离心机中10000-12000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇（等体积）加入另一新灭菌的1.5 ml离心管中；

（7）移液器轻轻地吸取600μl上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到絮状的DNA；

（8）10000 rpm离心10 min，立即倒掉上清，注意勿将白色DNA沉淀倒出；

（9）加入500 µl的75%乙醇，轻轻转动，使DNA沉淀悬浮于75%乙醇的中10 min；

（10）10000 rpm离心1 min，倒掉液体，再加入500 µl 75%乙醇，将DNA再洗1 min；

（11）10000 rpm离心1 min，立即倒掉液体；

（12）简单离心，吸去残液，干燥10 min；

（13）根据DNA沉淀的多少，加入30 µl 0.1 × TE缓冲液，使DNA溶解；

（14）加入1-3 µl Rnase（10 mg/ml），置于37℃恒温箱中约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。